3.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng cà chua chuyển gen trong in vitro
3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của cây cà chua chuyển gen
Từ 9 dòng cà chua chuyển gen codA được đánh giá mức độ phiên mã tạo sản phẩm mRNA ở thí nghiệm tại mục 3.1, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng chịu mặn in vitro.
Chồi của các cây cà chua chuyển gen codA được nuôi cấy trên môi trường ra rễ có bổ sung thêm 200 mM NaCl, sau 4 tuần nuôi dưới giàn đèn kết quả cho thấy hầu hết các dòng cà chua chuyển gen sinh trưởng và phát triển bình thường, có ra rễ. Ngược lại, 100% chồi của các dòng cà chua không chuyển gen (WT) bị chết khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung 200 mM NaCl sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 3.3).
Từ kết quả sang lọc sơ bộ cho thấy các dòng cà chua chuyển gen codA ra rễ, sinh trưởng bình thường có lá xanh đậm là các dòng chuyển gen triển vọng chịu mặn tốt.
Bảng 3.3: Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của cây cà chua chuyển gen Số dòng cây
chuyển gen
Tỉ lệ % số cây ra rễ trên MT chọn lọc sau 4 tuần (số cây
ra rễ /tổng số cây)
Tỉ lệ % mảnh lá sống sót trên MT chọn lọc sau 4 tuần (số
mảnh lá sống sót /10)
1 100% (2/2) 80% (8/10)
2 100% (1/1) 70% (7/10)
3 50% (1/2) 70% (7/10)
4 75% (3/4) 80% (8/10)
5 100% (2/2) 70% (7/10)
6 100% (1/1) 50% (5/10)
7 66,6% (2/3) 90% (9/10)
8 75% (3/4) 80% (8/10)
9 100 % (1/1) 100% (10/10)
WT 0% (0/3) 0% (0/10)
Để kiểm chứng một lần nữa các dòng cà chua chuyển gen codA ra rễ trên môi trường muối (200 mM NaCl) có khả năng chịu mặn tốt hơn so với đối chứng không chuyển gen. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm thử khả năng tái sinh chồi từ mảnh lá của các cây cà chua chuyển gen này và dòng đối chứng không chuyển gen (WT) trên môi trường tái sinh chồi bổ sung 200 mM NaCl. Các mảnh lá được cắt với kích thước 0,5*0,5 cm bằng dao cấy sắc và nuôi cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung 200 mM NaCl, sau 4 tuần kết quả cho thấy hầu hết các mảnh lá của cây cà chua chuyển gen có khả năng tái sinh chồi, sinh trưởng và phát triển bình thường trên môi trường bổ sung 200 mM NaCl; trong khi đó các mảnh lá của cây cà chua không chuyển gen (WT) bị mất diệp lục và không tái sinh chồi (bảng 3.2, hình 3.12). Kết quả này, một lần nữa cho thấy rằng dòng cà chua chuyển gen codA có khả năng chịu mặn tốt hơn so với dòng cà chua không chuyển gen.
Hình 3.11: Các dòng cà chua chuyển gen codA và không chuyển gen trên môi trường ra rễ có bổ sung 200mM NaCl
(A): Dòng cà chua chuyển gen; (B) dòng cà chua không chuyển gen (WT)
Hình 3.12: Mảnh lá cà chua tái sinh trên môi trường có bổ sung 200 mM NaCl (A): dòng chuyển gen codA; (B) dòng không chuyển gen
Các nghiên cứu tương tự cũng đã được công bố về khả năng chịu mặn của cây trồng khi chuyển gen codA. Cây Hồng chuyển gen codA tăng cường được khả năng chịu hạn và mặn (Huang et al., 2000), cây thuốc lá chuyển gen codA tăng cường khả năng chịu mặn cao (Bùi Văn Thắng và cs, 2014); Ngoài ra, các nghiên cứu về chuyển các loại gen khác nhưng cũng tham gia vào con đường sinh tổng hợp GB kết quả cho thấy cây chuyển gen chống chịu tốt với điều kiện mặn. Cây cải dầu chuyển gen COX tham gia sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chịu hạn và mặn (Huang et al., 2000), cây lúa chuyển gen betA cũng chống chịu tốt với điều kiện hạn và mặn (Takabe et al., 1998).
Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy GB không những chỉ tăng cường khả năng chịu mặn mà còn chống chịu tốt hơn với các điều kiện khắc nghiệt khác. Cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA chống chịu tốt với nhiệt độ cao (Alia et al., 1998b), cường độ ánh sáng mạnh (Alia et al., 1999), băng giá (Sakamoto et al., 2000); cây lúa chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu lạnh (Sakamoto et al., 1998); cây thuốc lá chuyển gen BADH sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ cao (Yang et al., 2005). Bởi vậy, các dòng cây cà chua chuyển gen codA được tạo ra cần tiếp tục đánh giá khả năng chống chịu với các điều kiện cực đoan khác (như nhiệt độ cao, lạnh, hạn, tác nhân oxy hóa, v.v.).
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang gen codA đã được biến nạp thành công vào lá mầm cây cà chua. Tái sinh và chọn lọc được 68 chồi ra rễ thuộc 3 lô thí nghiệm. Kết quả PCR cho thấy 30/68 dòng chuyển gen dương tính với PCR (mang gen codA).
2. Kiểm tra mức độ phiên mã của gen codA trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật RT-PCR cho thấy: có 9/30 cây mang gen codA hoạt động phiên mã tạo sản phẩm mRNA.
3. Thử nghiệm và đánh giá thành công khả năng chịu mặn nhân tạo của các cây cà chua chuyển gen. Hầu hết dòng cây chuyển gen chịu mặn tốt hơn dòng đối chứng không chuyển gen (cụ thể trong thí nghiệm thu được các dòng chuyển gen sống sót được trên môi trường có nồng độ muối NaCl là 200 mM).
2. ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp tục phân tích, đánh giá khả năng chống chịu các điều kiện hạn, lạnh, nóng của các dòng cà chua chuyển gen codA ở điều kiện phòng thí nghiệm. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng cà chua chuyển gen ở điều kiện trồng trong nhà lưới.
2. Phân tích hàm lượng Glycine betain tích lũy được trong cây cà chua chuyển gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu Tiếng Việt
1. Tạ Thu Cúc (2002), Kỹ thuật trồng cà chua, Nxb Nông Nghiệp.
2. Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy trình tái sinh và hệ thống chuyển gen cho một số giống cà chua (Lycopersicon esculentum L.) của Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(2), tr.217-223.
3. Lê Thị Ánh Hồng, Nguyễn Hữu Đống, Đặng Thị Chín (1993), “Ứng dụng phương pháp ưu thế lai trong chọn giống cây cà chua”, Tạp chí sinh học, 3.
4. Nguyễn Hồng Minh (2000), Chọn giống cà chua, Trong giáo trình chọn giống do Nguyễn Văn Hiển chủ biên, Nxb Giáo dục, tr. 300-343.
5. Hoàng Minh (2005), Kỹ thuật trồng và chăm sóc dưa hấu, bí ngòi, cà chua, ngô, Nxb Lao động Xã hội.
6. Nguyễn Thanh Minh (2004), Khảo sát và tuyển chọn giống cà chua cho chế biến công nghiệp ở đồng bằng Bắc Bộ, Luận án tiến sĩ nông nghiệp.
7. Nguyễn Hồng Minh (2007), Phát triển sản xuất cà chua lai F1 trồng trái vụ, chất lượng cao, góp phần thay thế giống nhập khẩu, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp bộ 2007.
8. Nguyễn Hồng Minh, Kiều Thị Thư (2000), “Giống cà chua lai HT7”, Báo cáo công nhân giống cà chua lai HT7, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
9. Dương Kim Thoa, Trần Khắc Thi (2005), “Kết quả chọn tạo giống cà chua chế biến PT18”, Tạp chí NN&PTNT, (7), tr. 33-35.
10. Trần Khắc Thi (2005), Kỹ thuật trồng rau sạch – rau an toàn và chế biến rau xuất khẩu, Nxb Thanh Hóa.
11. Bùi Văn Thắng (2014), Nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu hạn và mặn của cây Xoan ta (Melia azedarachL.) bằng chuyển gen, Luận án tiến sỹ, Viện Công nghệ sinh học.
12. Phạm Đồng Quảng (2006), Kết quả điều tra giống 13 cây trồng chủ lực của cả nước – giai đoạn 2003-2004, Nxb Nông Nghiệp, tr. 157-170.
B. Tài liệu nước ngoài
13. Ahmad R., Kim M.D., Back K.H., Kim H.S., Lee H.S., Kwon S.Y., Murata N., Chung W.I. & Kwak S.S. (2008), “Stress-induced expression of choline oxidase in potato plant chloroplasts confers enhanced tolerance to oxidative, salt, and drought stresses”, Plant Cell Reports 27, pp. 687–698.
14. Allakhverdiev SI, Los DA, Mohanty P, Murata N (2007), “Glycinebetaine alleviates the inhibitory effect of moderate heat stress on the repair of photosystem II during photoinhibition”, Biochim Biophys Acta 1767, pp. 163-171.
15. Alia, Hayashi H., Sakamoto A. & Murata N. (1998b), “Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine”, The Plant Journal 16, pp. 155–161.
16. Alia, Sakamoto A., Nonaka H., Hayashi H., Saradhi P.P., Chen T.H.H. &
Murata N. (1999), “Enhanced tolerance to light stress of transgenic Arabidopsis plants that express the codA gene for a bacterial choline oxidase”, Plant Molecular Biology 40, pp. 279–288.
17. Avinash Chandra Rai, Major Singh, KavitaShah (2013), “Engineering drought tolerant tomato plants over-expressing BcZAT12 gene encoding a C2H2 zinc finger transcription factor”, Phytochemistry, Vol 85, pp. 44-50.
18. Berry AN, Beaupre CE, and Dale M (1995), “Inhibition of virB mediated transfer of diverse subsstrate from Agrobacterium tumefaciens by the IncQ plasmid RSF-0110, Journal of Bacteriology 177, pp. 4890.
19. Chen TH., Murata N (2002), “Enhancement of tolerance to abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes”, Curropin Plant Biol 5, pp. 250-257.
20. Chen WP, Li PH, Chen THH (2000), “Glycinebetaine increases chilling tolerance and reduces chilling-induced lipid peroxidation in Zea mays L”, Plant Cell Environ 23, pp. 609-618.
21. Collins G.G. and Symons R.H. (1992), “Extraction of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure”, Plant Mol Biol Rept 10, pp. 233- 235.
22. Frary A, and Earle D.E. (1996), “An examination of factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of tomoto”, Plant Cell Reports 16, pp. 235-240.
23. Haldimann P, Feller U (2004), “Inhibition of photosynthesis by high temperature in oak (Quercus pubescens L.) leaves grown under natural conditions closely correlates with a reversible heat-dependent reduction of the activation state of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase”, Plant Cell Environ 27, pp. 1169-1183.
24. Haldimann P, Feller U (2005), “Growth at moderately elevated temperature alters the physiological response of the photosynthetic apparatus to heat stress in pea leaves”, Plant Cell Environ 28, pp. 302-317.
25. Hamza S., Chupeau Y. (1993), “Re-evaluation of conditions for Plant Regeneration and Agrobacterium-Mediated Transformation from Tomato (Lycopersicum esculentum)”, Journal of Experimental Botany, 44 (12), pp.
1837-1845.
26. Hayashi H, Alia Mustardy L, Deshnium P, Ida M, Murata N. (1997),
“Transformation of Arabidopsis thaliana with the codA gene for choline oxidase; accumulation of glycinebetaine and enhanced tolerance to salt and cold stress”, Plant Journal 12, pp. 42 –133.
27. Huang J., Hirji R., Adam L., Rozwadowski K.L., Hammerlindl J.K., Keller W.A. & Selvaraj G. (2000), “Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations”, Plant Physiology 122, pp. 747–756.
28. Ikuta S, Mamura S, Misaki H, Horiuti Y (1997), “Purufication and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis”, J Biochem 82, pp. 1741-1749.
29. Ling Q.H., Kriseleit D., and Ganal W.M. (1998), “Effect of ticarcillin/potassium claculanate on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicom esculentum Mill.)”, Plant Cell Reports 17, pp. 843-847.
30. Linhui Y, Xi C, Zhen W, Shimei W, Yuping W, Qisheng Z, Shihui L, Chengbin X (2012), “Arabidopsis enhanced drought tolerance 1/HOMEDOMAIN
GLABROUS11 confers drought tolerance in transgenic rice without yield penalty”, Plant physiol, 162 (3), pp. 1378-1391.
31. McKersie BD, Leshem YY (1994), Chilling stress. In: McKersie BD, Leshem YY (eds) Stress and Stress Coping in Cultivated Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-Boston-London, pp. 79-103.
32. Mohanty A., Kathuria H., Ferjani A., Sakamoto A., Mohanty P., Murata N. &
Tyagi A.K. (2002), “Transgenics of an elite indica rice variety Pusa Basmati 1 harboring the codA gene are highly tolerant to salt stress”, Theoretical and Applied Genetics 106, pp. 51–57.
33. Nyyssola A, Kerovuo J, Kaukinen P, von Weymarrn N, Reinikainen T (2000),
“Extreme halophiles synthesize betaine from glycine by methylation”, J Biol Chem 275, pp. 22196-22201.
34. Paniti et al. (2012), “Gene Stacking in Transgenic Tomato Resistance to Viral Diseases”, Agricultural Sci.J, 43(2-3), pp. 311-324.
35. Park H.S., Morris L.J., Park E.J., Hirschi D.K., and Smith H.R. (2003),
“Efficient and genotype-independent Agrobacterium-mediated tomato transformation”, Journal of Plant Physiology 160, pp. 1253-1257.
36. Park E.J., Jeknic Z., Sakamoto A., DeNoma J., Yuwansiri R., Murata N. & Chen T.H.H. (2004), “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage”, The Plant Journal 40, pp. 474–
487.
37. Park EJ, Jeknic Z, Pino MT, Murata N, Chen THH (2007a), “Glycinebetaine accumulation is more effective in chloroplasts than in the cytosol for protecting transgenic tomato plants against abiotic stress”, Plant Cell Environ 30, pp. 994- 1005.
38. PapageorgiouGC, Murata (1995), “The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygen-evolving Photosystem II complex”, Photosynth Res 44, pp. 234-252.
39. Qiu D., Diretto G., Tavarza R., and Giuliano G. (2007), “Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomoto and production of transgenic
plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD”, Scientia Horticulturae 112, pp. 172-175.
40. Rathinasbapathi B, Burnet M, Hanson AD (1997), “Choline monooxygenase, an unusual ironsulfur enzyme catalyzing the first step of glycine betaine synthesis in plants: Prosthetic group characterization and cDNA cloning”, ProcNatlAcadSci USA 94, pp. 3454-3458.
41. Rathinasbapathi B, Fouad WM, Sigua CA (2001), “b-Alanine betaine synthesis in the Plumbaginaceae. Purification and characterization of a trifunctional, S- adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase from Limonium latifoliumleaves”, Plant Physiol 126, pp. 1241-1249.
42. Roekel J., Damm B., Melchers L., and Hoekema A. (1993, “Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicum esculentum)”, Plant Cell Reports 12, pp. 644-647.
43. Saneoka H, Nagasaka C, Rhodes D (1995), “Salt tolerance of glycine betaine deficient and containing maize lines”, Plant Physiol 107, pp. 631-638.
44. Sakamoto A., Alia & Murata N. (1998), “Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold”, Plant Molecular Biology 38, pp. 1011–1019.
45. Sakamoto A. & Murata N. (2000), “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in plants: current status and implications for enhancement of stress tolerance”, Journal of Experimental Botany 51, pp. 81–88.
46. Sakamoto A., Murata N.(2002), “The role of glycine betaine in the protection of plants from stress: clues from transgenic plants”, Plant Cell Environ 25, pp. 163- 171.
47. Savio PR, Aline ML, Claudia RBS (2012), Recent molecular advances on downstream plant responses to abiotic stress”, Int J Mol Sci, 13(7), pp. 8628-8647.
48. Sun J.H., Uchii S., Watanabe S., and Ezura H. (2006), “A highly efficent transformation protocol for Micro-Tom, a model cultuvar for tomato functional genomics”, Plant Cell Physiol, 47(3), pp. 426-431.