3.1. Kết quả chuyển gen, tái sinh và chọn dòng cà chua chuyển gen codA
3.1.2. Kết quả chuyển gen, tái sinh và chọn dòng cà chua chuyển gen codA
Thí nghiệm được tiến hành với ba lần, tổng cộng có 488 mảnh lá mầm cà chua PT18 được cắt 2 đầu bằng dao sắc để tạo tổn thương cho mẫu. Sau khi cắt các mảnh cấy được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn A. tummerfaciens C58 mang cấu trúc pBI121/35S/codA/NOS trong 30 phút.
Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả chuyển gen codA vào cây cà chua Lô thí
nghiệm
Số mẫu biến
nạp
Số chồi/Môi trường
SMT
Số chồi ra rễ/Môi trường
RMT
Số chồi dương tính
với PCR
Hiệu suất chuyển gen
(%)
1 150 54 22 12 8
2 140 68 19 7 5
3 158 75 27 11 6.7
Tổng số 448 197 68 30 6.7
Các mảnh lá mầm sau đó được chuyển lên môi trường đồng nuôi cấy nuôi tối 2 ngày. Các mẫu lá trong giai đoạn này dường như không có sự thay đổi về hình dáng và màu sắc so với ban đầu. Sau 2 ngày mẫu lá mầm được chuyển lên nuôi cấy trên môi trường tái sinh và chọn lọc chồi (MS + zeatin 1,8 mg/l + saccarose 30 g/l + agar 7.5 g/l, pH 5,8 có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxim 250 mg/l và kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l). Sau 7-15 ngày các mảnh cấy chuyển gen bắt đầu có những vết thâm và bắt đầu hình thành nên những mô tái sinh, trong khi cây đối chứng bắt đầu vàng và chết dần.
A B
C D
E F
Kết quả đánh giá khả năng tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen codA được thống kê trên bảng 3.1 cho thấy, với 448 mảnh lá mầm được xâm nhiễm và đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector pBI121/codA sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh chọn lọc thu được 197 chồi sinh trưởng, phát triển tốt. Các chồi sau đó được cấy chuyển sang môi trường ra rễ có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, sau 3 tuần nuôi cấy có 68 chồi ra rễ, chiếm 15,2% so với số mẫu biến nạp. Ngược lại, mảnh lá mầm không được chuyển gen cấy chuyển lên môi trường chọn lọc có 50 mg/l kanamycin (làm đối chứng), 100% mẫu bị chết không tái sinh chồi. Điều này cho thấy các dòng cà chua tái sinh và ra rễ trên môi trường chọn lọc là các dòng đã được chuyển gen
Hình 3.3: Một số hình ảnh chuyển gen codA vào cây cà chua PT18
A-Mảnh lá mầm trên môi trường nuôi cộng sinh;
B- Mảnh lá mầm trên môi trường tái sinh chọn lọc sau 7 ngày;
C- Mảnh lá mầm trên môi trường tái sinh chọn lọc sau 15 ngày;
D- Các cụm chồi được tách và chuyển sang môi trường chọn lọc 3-4 tuần;
E- Cây cà chua chuyển gen trên môi trường ra rễ chọn lọc;
F- Cây con được trồng trên giá thể TN1;
Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về chuyển gen trên cà chua nhằm xác định chức năng của gen, tạo tính trạng kháng sâu, bệnh, thuốc diệt cỏ, cải tiến chất lượng quả, làm chậm thời gian chín của quả, tạo protein mới, khả năng chống chịu với một số điều kiện bất lợi của môi trường (Park et al., 2003; Lin et al., 2004; Park et al., 2007a; Park et al., 2008). Trong thực tế, hiệu suất chuyển gen có sự khác biệt rất lớn qua các báo cáo (Roekel et al., 1993; Hamza và Chupeau 1993;
Frary và Earle 1996; Ling et al., 1998; Park et al., 2003; Sun et al., 2006; Qiu et al., 2007). Nguyên nhân của sự khác biệt phụ thuộc vào độc lực của từng dòng vi khuẩn, mức độ mẫn cảm của giống, loại mẫu sử dụng, mật độ vi khuẩn, gen chọn lọc, acetosyringone và pH. Từ những kết quả nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tối ưu, nâng cao được hiệu suất biến nạp gen vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens như đã trình bày ở phần phương pháp thí nghiệm. Sử dụng lá mầm cà chua là thể nhận gen, nồng độ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens OD600nm = 0,6, đồng nuôi cấy 48 giờ và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường tái sinh bổ sung 50 mg/l kanamycin, chọn lọc chồi chuyển gen ở giai đoạn ra rễ là 50 mg/l kanamycin. Kết quả cho thấy đối với lá mầm cây cà chua 7 ngày tuổi được sử dụng làm thể nhận gen, sử dụng chủng khuẩn A. tumefaciens C58 cho hiệu suất chuyển gen vào cà chua khoảng 6,7 %.
Tuy nhiên, để khẳng đinh chắc chắn các dòng cà chua ra rễ được trên môi trường có kháng sinh chọn lọc là các dòng chuyển gen, chúng tôi tiến hành thu mẫu lá của các dòng cà chua ra rễ chuyển gen codA và dòng đối chứng không chuyển gen, tách chiết DNA và phân tích PCR.