Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen
2.2.2.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng PCR
Thu lá cây cà chua chuyển gen và đối chứng ở giai đoạn cây con trong phòng thí nghiệm. Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Collins và Symons (1992). DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi và thông số các cặp mồi
Cặp
mồi Tên mồi Trình tự nucleotide Nhân
gen
Kích thước
(bp)
1
F/CODA- XbaI
5’GCTCTAGAATGCACATCGATAA TATTGA3’
codA 1688 R/CMYC
-SacI
5’CGAGCTCTCAATTCAGATCCTCT TC3’
Kiểm tra cây cà chua chuyển gen codA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu F/CODA – XbaI và R/CMYC-SacI (Trình tự cặp mồi như trong bảng 2.3) thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ như sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ [94oC/1 phút, 58oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Thành phần phản ứng được thể hiện trong bảng 2.4.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên agarose 0,8%, nhuộm và chụp ảnh.
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR nhân gen
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 Nước khử ion 14,5
2 Đệm PCR 10X 2,5
3 MgCl2 (25 mM) 2,5
4 dNTPs (10 mM) 2,0
5 Mồi xuôi (10 pM) 1,0
6 Mồi ngược (10 pM) 1,0
7 DNA tổng số (50 ng/àl) 1,0
8 Taq polymerase (5u/àl) 0,5
Tổng 25
2.2.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ phiên mã bằng kỹ thuật RT-PCR
Quy trình chiết tách RNA từ cà chua gồm các bước sau:
1. Nghiền nhanh mẫu trong Nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải được nghiền triệt để và tránh enzym cắt RNA
2. Chuyển ngay khoảng 50g mẫu vào ống eppendorf 2ml 3. Bổ sung 700àl đệm tỏch
4. Lắc đều bằng voltex 5. Ủ 650 C trong 10 phút
6. Thờm 700àl CH3Cl: isoamyl alcohol (24:1) 7. Lắc mạnh để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút 8. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 20 phút ở 40C
9. Hỳt 600 àl dịch nổi phớa trờn vào ống I 10. Thờm 700 àl CH3: isoamyl (24:1) 11. Lắc mạnh để ở nhiệt độ phòng 5 phút
12. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C 13. Hỳt 50 àl phần dịch phớa trờn sang ống I
14. Thờm 150 àl LiCl vào ống I sau đú ủ 40C qua đờm 15. Li tâm thu cặn, sau đó rửa bằng cồn lạnh 2 lần
16. Làm khụ rồi bổ sung 50 àl nước deion và bảo quản mẫu
Thành phần của RNA tổng số gồm có rRNA (80-85%), tRNA,…(15-20%).
Các RNA này có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng dễ dàng bằng các kĩ thuật như điện di, li tâm. mRNA chiếm khoảng 1-5% tổng số RNA tế bào, lại có kích thước và trình tự vô cùng đa dạng. Tuy nhiên chúng có một điểm chung là cấu trúc đuôi polyA (có thể lên đến 100A). Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc kí ái lực trên cột oligo dT- cellulose. Dựa vào nguyên tắc trên, hiện nay trên thị trường xuất hiện những bộ mẫu thử sử dụng các viên bi từ có mang oligo dT trên bề mặt. Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligo dT, các viên bi này được thu nhận lại qua li tâm và mRNA sẽ được tách khỏi các viên bi và giữ lại. Kĩ thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ.
Điện di trên gel agarose 1%
Qui trình:
1/ Chuẩn bị gel: cho 1g agarose vào 100 ml TAE 1X. Đun sôi đến khi agarose tan hoàn toàn. Để cho agarose nguội xuống khoảng 55°C, đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel agarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập bản gel agarose khoảng 2mm, tháo lược ra khỏi bản gel
2/ Tra mẫu: trộn mẫu theo tỷ lệ ( 2 àl RNA/ 1μl đệm tra mẫu 10X: 7 àl H2O) và tra vào giếng
3/ Điện di: điện thế dùng để điện di từ 60- 80V. RNA chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển bằng màu của bromophenol để biết lúc nào ngừng điện di
4/ Nhuộm RNA: nhuộm RNA bằng Ethidium Bromid. Bản gel được lấy ra khỏi khay điện di và đưa vào dung dịch EtBr 0,5 μg/ml trong thời gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ
5/ Soi RNA: soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen-Doc Tổng hợp cDNA từ mRNA
cDNA sợi đơn được tổng hợp từ khuôn của mRNA bằng Kít tổng hợp cDNA
“SuperScript™ III First Strand Kits” của hãng Invitrogen. Các bước tiến hành như sau:
Bước 1. Chuẩn bị: Ống 1 với thành phần như bảng 2.5:
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 1 STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
1 Primer(50àM oligo(dT)20 1
2 10mM dNTP mix 1
3 mRNA 5
4 DEPC-treated water 3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp dung dịch trên được trộn đều, ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó ủ trong đá ít nhất 1 phút.
Ống 2 với thành phần như bảng 2.6:
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 2
STT Thành phần Thể tớch(àl)
1 10X RT buffer 2
2 25mM MgCl2 4
3 0,1M DTT 2
4 RNaseOUTTM (40U/ àl) 1
5 SuperScriptTM III RT(200 U/ àl) 1
Tổng thể tích 10
Bước 2. Tiến hành:
- Lấy 10 àl dung dịch ở ống 1 cho vào ống 2 rồi trộn đều - Ủ ở 50oC trong 50 phút
- Kết thúc phản ứng ở 85oC trong 5 phút rồi ủ trong đá
- Thờm 1 àl RNase H vào ống, ủ ở 37oC trong 20 phỳt để loại bỏ sợi mRNA - Sản phẩm cDNA sợi đơn được sử dụng làm khuôn để nhân gen.
*Nhân gen actin từ cDNA
Phản ứng nhân gen actin từ cDNA có thành phần như bảng 2.7.
Trình tự mồi xuôi F1: 5’-ATG GAG AAC ACA GAT CCT TGT-3’ và R1:
5’-GAA GAT CCA ATT GGT CGA GTG T-3’ cho nhân một đoạn gen actin có kích thước 152 bp.
Chu kỳ nhiệt độ: 94oC/3 phút; 35 chu kì [94oC/1 phút, 56oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm bằng ethidium bromide, soi dưới đèn UV và chụp ảnh.
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR nhân gen actin từ cDNA
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 DEPC treated water 13,5
2 Đệm PCR 10X 2,5
3 MgCl2 (25mM) 2,5
4 dNTPs (10 mM) 2,0
5 Mồi xuôi (10 pM) 1,0
6 Mồi ngược (10 pM) 1,0
7 cDNA 2,0
8 Taq polymerase (5u/àl) 0,5
Tổng 25
*Nhân gen codA từ cDNA
Phản ứng nhân gen codA từ cDNA có thành phần như sau:
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA từ cDNA
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 DEPC treated water 13,5
2 Đệm PCR 10X 2,5
3 MgCl2 (25mM) 2,5
4 dNTPs (10 mM) 2,0
5 Mồi xuôi (10 pM) 1,0
6 Mồi ngược (10 pM) 1,0
7 cDNA 2,0
8 Taq polymerase (5u/àl) 0,5
Tổng 25
Sử dụng cặp mồi F/codA-XbaI và R/cmyc-SacI cho phản ứng kiểm tra nhân gen codA. Theo tính toán cặp mồi này sẽ nhân đoạn gen có kích thước gần 1,7 kb.
Phản ứng nhân gen codA từ cDNA có chu kỳ nhiệt độ: 94oC/3 phút; 30 chu kì [94oC/1 phút, 56oC/50 giây, 72oC/1 phút]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm bằng ethidium bromide, soi dưới đèn UV và chụp ảnh.
2.2.2.3. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng cây chuyển gen in vitro
- Chồi của các dòng cà chua chuyển gen codA và đối chứng không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường ra rễ (RMT) bổ sung 200 mM NaCl.
- Mảnh lá của các dòng cà chua chuyển gen codA và đối chứng không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường tái sinh (SMT) bổ sung 200 mM NaCl.