3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn đối kháng
Vi khuẩn đối kháng đ−ợc phân lập từ những cây họ cà, cây cỏ ngoài tự nhiên. Mẫu thu về được rửa sạch dưới vòi nước để phục vụ cho việc phân lập.
Lấy 3 cm phần rễ của cây họ cà, rửa sạch bằng nước, sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn ethanol và dung dịch hypochlorite. Rửa lại nhiều lần bằng n−ớc cất khử trùng.
Sau khi đ−ợc khử trùng sạch bề mặt, mỗi mẫu đ−ợc cất bằng dao mổ khử trùng trong một giọt nước ở đĩa petri. Thu phần dịch huyền phù để phân lập vi khuẩn nội sinh đối kháng.
Vi khuẩn đối kháng đ−ợc phân lập theo Geels and Schippers [40] gồm các b−ớc sau:
Bước 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha long đến nồng độ nhất định, sao cho khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc YPDA, ủ ở nhiệt
độ 280C ữ 300C trong 24 ữ 48 giờ để có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 2: Chọn những khuẩn lạc có hình thái điển hình theo những đặc
điểm nh−: hình thái, kích cỡ, màu sắc đ−ợc hoà long trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 0,1ml dung dịch trải đều trên bề mặt đĩa môi trường KB hoặc YPDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi ủ ở 280C ữ 300C trong 24 ữ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt).
B−ớc 3: Phun dịch vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường, ủ ở nhiệt độ 280C ữ 300C trong 24 ữ 48 giờ.
Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vòng vô khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó.
Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước cất khử trùng hoặc glyxerol 30 % ở - 800C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2.2. Phương pháp phân loại vi khuẩn đối kháng
Có rất nhiều phương pháp xác định vị trí phân loại và phân loại vi khuẩn. Trong phạm vi luận án này, chúng tôi sử dụng các ph−ơng pháp nh−:
* Để làm tiền đề cho việc xác định vị trí phân loại, trước tiên xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng đối kháng theo phương pháp của N.W. Schaad - 2002, gồm các phản ứng: Gram, hiếu khí, kỵ khí, phát triển trên môi tr−ờng YDC, phát quang trên môi tr−ờng KB, khuyếch tán trên môi tr−ờng KB, phân giải Ure, Oxidase, phát triển trên môi tr−ờng thạch D1M
- Phản ứng Gram: Lấy một đầu que cấy chủng vi khuẩn cần xác định cho vào 2 giọt KOH 3% và trộn đều. Nếu thấy hỗn hợp này nhớt tức là phản ứng Gram âm, nếu không nhớt là phản ứng Gram d−ơng
- Khả năng phát quang trên môi trường KB: Cấy vi khuẩn cần xác định thành các vệt trên môi tr−ờng KB và nuôi ở 250C. Sau 48h quan sát khả năng phát quang dưới đèn tử ngoại với bước sóng 366nm
- Phát triển hiếu khí và kỵ khí
Môi tr−ờng Basal: 2, 0 g pepton, 5,0 g NaCl, 0,3 g KH2PO4, 3 g agar, 3ml bromothymol blue (1% dung dịch n−ớc), 1 lít n−ớc cất, pH 7,1
Lấy 5 ml môi tr−ờng Basal cho vào các ống tuýp dài 13 cm và khử trùng ở 1210C trong 20 phút, sau đó bổ sung vào mỗi ống tuýp đó 0,5 ml dung dịch glucoza 10% đ khử trùng. Cấy các chủng cần xác định vào các ống tuýp
đó, mỗi chủng cấy hai ống, một ống để bình thường (xác định hiếu khí), ống còn lại phủ lên trên bề mặt một lớp parafin dầy khoảng 5mm (xác định kỵ khí), nuôi ở 300C và quan sát sự biến đổi màu. Các chủng có khả năng phát triển là các chủng làm biến đổi màu của môi trường từ màu xanh sang màu vàng.
- Phát triển trên môi tr−ờng YDC
Môi tr−ờng YDC: 10,0 g cao nấm men; 20,0 g glucoza; 20,0 g canxi cacbonat; 15,0 g agar; 1 lÝt n−íc cÊt
Cấy các chủng cần xác định trên môi tr−òng YDC, nuôi ở nhiệt độ 300C và quan sát sự phát triển
- Phát triển trên môi tr−ờng D1M
Môi tr−ờng D1M: 5,0 g Cellobiose; 1,0 g NH4Cl; 1,0 g NaH2PO4; 1,0 g K2HPO4; 3,0 g MgSO4.7H2O; 10,0 mg Malachine green; 15,0 g thạch; 1 lít n−íc cÊt; pH: 7,0
- Thử Oxidaza: Dùng que tăm khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn nuôi cấy 24h trên môi tr−ờng KB chà sát lên miếng giấy thấm đ tẩm dung dịch 1%
tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride. Phản ứng d−ơng tính nếu xuất hiện màu hồng trong vòng 10 giây và phản ứng âm tính nếu không biến
đổi màu sau 60 giây.
3.3.2.3.Phương pháp đánh giá tác động của vi khuẩn đối kháng lên sự nảy mầm của hạt vừng và lạc
Hạt vừng và hạt lạc đ−ợc khử trùng bằng cồn 73% trong 5 phút, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, trộn đều hạt trong dung dịch vi khuẩn đối kháng có chứa bột mêtylxenlulô với nồng độ có độ bám dính tốt nhất, để hạt khô tự nhiên, khi đó bột mêtylxenlulô sẽ tạo thành một lớp áo bao trên bề mặt hạt giúp vi khuẩn bám dính tốt hơn. Công thức đối chứng là hạt đ−ợc trộn với n−ớc cất. Để hạt khô tự nhiên rồi mới đem gieo. Các thí nghiệm đ−ợc lặp lại 2 lần, mỗi lần sử dụng 50 hạt và đ−ợc gieo trên các vùng đất canh tác khác nhau, ghi và đánh giá kết quả trong 10 ngày.
3.3.2.4. Đánh giá hoạt lực kháng bệnh héo xanh của vi khuẩn đối kháng lên cây vừng và cây lạc trong nhà kính
Các b−ớc thí nghiệm đ−ợc tiến hành nh− sau:
- Khay gieo hạt, bầu nhựa và các dụng cụ trồng cây vừng, lạc đ−ợc khử trùng với KMnO4 trong 24 giờ, rửa sạch bằng n−ớc máy.
- Đất dùng cho thí nghiệm đ−ợc khử trùng d−ới ánh nắng mặt trời, mục
đích nhằm loại bỏ bớt một số vi sinh vật ngoại lai có hại trong đất và đ−ợc bổ sung l−ợng phân bón theo tiêu chuẩn ngành cho từng loại cây.
- Chuẩn bị bầu đất cho cây con: Đất khử trùng đ−ợc chia vào các bầu nhựa có đ−ờng kính 10 cm và trọng l−ợng là 600g/1bầu.
- Chuẩn bị cây con: Hạt lạc, vừng đ−ợc chuẩn bị nh− tiêu mục 2.2.2.3, hạt ở các công thức thí nghiệm đ−ợc tiếp tục tẩm thêm vi khuẩn gây bệnh (với mật độ 106tb) và đ−ợc gieo trực tiếp trong các bầu đất. Sau đó các bầu đất
đ−ợc chia thành các lô theo công thức thí nghiệm:
CT ĐC (-) : Cây trồng chỉ đ−ợc t−ới n−ớc sạch
CT ĐC (+): Cây trồng có bổ xung vi khuẩn gây bệnh
CT Thí nghiệm: Cây trồng đ−ợc bổ xung lần l−ợt các chủng vi khuẩn
đối kháng + vi khuẩn gây bệnh
ở lô thí nghiệm cây sau một tuần, mỗi tuần bổ sung một lần vi khuẩn
đối kháng với mật độ đạt 107tb/g đất trong 3 đến 4 lần, đến khi cây có 5-7 lá
thật bổ sung vi khuẩn gây bệnh héo rũ với mật độ đạt 106 tb/g đất. Chăm sóc cây hàng ngày
- Các bầu cây được đặt dưới điều kiện ánh sáng tự nhiên, tưới nước và chăm sóc hàng ngày, nhiệt độ trung bình 280C ữ 300C.
Ghi số cây sống và chết ở từng công thức theo định kỳ. Kết quả đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học.
3.3.2.5. Đánh giá khả năng kích thích sinh tr−ởng của các chủng vi khuẩn
đối kháng lên cây vừng và cây lạc trong nhà kính
Các bước chuẩn bị dụng cụ, hạt, và đất được thực hiện như ở tiêu mục 2.2.2.3. Sau đó :
- Hạt vừng, hạt lạc đ−ợc gieo thẳng vào các bầu đất khử trùng, và đ−ợc chia thành lô theo các công thức thí nghiệm
CT ĐC: cây đ−ợc t−ới n−ớc sạch
CT Thí nghiệm: Cây đ−ợc bổ xung vi khuẩn đối kháng với mật độ đạt 107tb/1g đất (theo định kỳ 1lần/1tuần trong 3-4 lần)
- Các bầu cây được đặt dưới điều kiện ánh sáng tự nhiên, tưới nước và chăm sóc hàng ngày, đến khi cây đ−ợc 8-9 tuần tuổi tiến hành đo chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi và trọng lượng khô để so sánh.
3.3.2.6. Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng lên cây vừng, cây lạc trên đồng ruộng
Hạt lạc đ−ợc khử trùng bề mặt bằng Javen để loại bỏ những vi sinh vật ngoại lai bám trên bề mặt hạt, tiếp đó hạt đ−ợc tẩm vi khuẩn đối kháng trong 48h, khi hạt lạc bắt đầu nứt nanh đ−ợc tẩm vào dung dịch vi khuẩn gây bệnh trong 6h, sau đó hạt giống đ−ợc chia thành các công thức thí nghiệm đem gieo trồng ngoài ruộng sản xuất. CT1: ĐC (-); CT2: ĐC (+); CT3: CI4-1 + HL1, CT4:
CI4-2 + HL1; CT5: NA4 + HL1; CT6: CI1-5 + HL1. Sau đó bổ sung VKNSĐK với
mật độ 107 tb/ 1g đất theo định kỳ 1 lần/ 1tuần trong 4-5 lần, khi cây có 2-3 lá
thật tiếp tục bổ sung vi khuẩn gây bệnh HL1 với mật độ đạt 106 tb/ 1g đất.
Hạt vừng đ−ợc chuẩn bị nh− tiêu mục 2.2.2.3, và đ−ợc gieo trên những ruộng dễ thoát n−ớc, tơi xốp, giữ ẩm tốt...và ch−a từng bị nhiễm bệnh héo xanh đ−ợc chọn làm khu thí nghiệm
Đất thí nghiệm trên vừng đ−ợc chia thành 3 lô, một lô đối chứng + (đối chứng có vi khuẩn héo xanh VT3), hai lô công thức (CT) chủng là CI4-2 và NA4. Giữa các lô được ngăn cách bởi một bờ đất cao 0,2m để nước không tràn sang nhau. Mỗi lô có diện tích là 80m2, luống đ−ợc bố trí theo h−ớng Đông Tây để đảm bảo đủ và đều ánh nắng mặt trời, mỗi luống là một băng có chiều rộng 2,5m, luống cách luống 0,3m, hàng cách hàng 0,25m, xung quanh lô thí nghiệm có một luống bảo vệ.
Mỗi lô thí nghiệm đ−ợc bổ sung vôi bột và phân chuồng, lân và đạm theo tiêu chuẩn ngành áp dụng cho cây vừng. Sau một ngày, gieo hạt vừng đ
đ−ợc tẩm chủng vi khuẩn đối kháng. Lô đối chứng hạt không có chủng và
đ−ợc bổ sung bằng n−ớc sạch.
Mỗi lô trồng khoảng 3200 cây, khi cây vừng đ−ợc 15 ngày tuổi mỗi tuần bổ sung một lần các chủng đối kháng vào các lô thí nghiệm với mật độ 107 tế bào/g đất, vi khuẩn gây bệnh VT3 đạt 106 tb/1g đất, bổ sung trong 3 tuần đầu. Ghi số cây chết và sống trong thời gian 60 ngày. Kết quả đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học .