Để phân lập đúng vi khuẩn gây bệnh héo xanh chỉ thu thập những cây mới thể hiện triệu chứng bệnh (có 3 đến 4 lá trên ngọn bị héo xanh). Bởi vì
những cây trồng ngoài đồng đ bị nhiễm bệnh lâu ngày thường khó hoặc không thể phân lập được vi khuẩn gây bệnh đích thực vì nó thường bị tạp nhiễm thêm nhiều loại vi sinh vật hoại sinh khác.
Đ thu thập đ−ợc 12 mẫu cây lạc và 20 mẫu cây vừng bị bệnh ở các địa ph−ơng nh− Vĩnh Phúc, Sóc Sơn, Nghệ An và Thanh Hoá. Mẫu thu ngày nào thì đ−ợc xử lý ngay ngày hôm đó để tránh làm giảm sức sống của vi khuẩn
gây bệnh. Không thể chỉ dựa vào các biểu hiện triệu chứng bệnh mà nhận biết
đ−ợc loài vi khuẩn gây bệnh. Vì cùng một loại triệu chứng hoặc những triệu chứng giống nhau lại có thể do những loài vi khuẩn khác nhau gây ra. Do vậy cần thiết phải phân lập, xác định tác nhân gây bệnh và khẳng định tính gây bệnh của vi khuẩn phân lập đ−ợc.
Từ mỗi mẫu cây bệnh thu một ống dịch vi khuẩn, dịch này đ−ợc cấy trên môi trường nhận biết TTC và nuôi ở nhiệt độ 280C ữ 300C, sau 48 giờ sẽ chọn ra những dạng hình thái khuẩn lạc đặc tr−ng - màu trắng kem hoặc trắng sữa, thể chảy lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm.
Đại diện của mỗi dạng khuẩn lạc đ−ợc giữ trong dung dịch bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng gây bệnh thể hiện triệu chứng bệnh héo xanh
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc ST
T
Ký hiệu
chủng Nguồn gốc Địa điểm
thu mÉu H×nh dạng
KÝch
cỡ Mầu sắc
1 VD1 Vừng đen Thanh Hoá Đặc Nhỏ Trắng kem 2 VT1 Vừng trắng Thanh Hoá
Chảy Trung b×nh
Đỏ nhạt, viền trắng
3 VT2 Vừng trắng Nghệ An Đặc Nhỏ Trắng đục 4 VT3 Vừng trắng Nghệ An Chảy
láng
Trung b×nh
Viền trắng kem, tâm phớt hồng
5 VD2 Vừng đen Nghệ An Chảy Nhỏ Trắng
6 DK Vừng trắng Nghệ An
Chảy Trung b×nh
Phớt hồng
7 SBR Vừng trắng Hà Nội
Chảy Nhỏ Trắng kem tâm hồng
8 HL1 Lạc Hà Nội
Chảy Trung b×nh
Trắng đục, tâm phớt hồng
9 HL2 Lạc Vĩnh Phúc Chảy Nhỏ Đỏ nhạt
Trên bảng 4.1, là 9 chủng vi khuẩn đ−ợc phân lập từ cây lạc và cây vừng bị bệnh héo xanh ở một số tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam.Trong đó có 7 chủng (từ 1 đến 7) ở cây vừng và 2 chủng (8 và 9) ở cây lạc. Các chủng vi khuẩn này đều c− trú tại phần cổ rễ của cây có biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh. Trong một số tr−ờng hợp có thể nhận dạng khá chính xác vi khuẩn đích dựa vào hình thái khuẩn lạc của chúng và chất màu Triphenyl Tetrazolium Clorit có trong môi tr−ờng TTC. Để tuyển chọn những vi khuẩn này, thoạt đầu dựa vào sự mô tả hình thái khuẩn lạc của loài R. solanacearum gây bệnh héo xanh có tính độc khi phát triển trên môi trường TTC nh− đ đ−ợc miêu tả trong công bố của Kelman và cộng sự (Kelman và cs, 1954) – “Khuẩn lạc màu trắng kem hoặc trắng sữa, thể chảy lỏng, dễ di
động, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm”.
Các chủng vi khuẩn này đ−ợc đặt tên, ký hiệu theo cây chủ, tên địa ph−ơng thu mẫu và đ đ−ợc làm thuần bằng cách cấy truyền các khuẩn lạc tách rời nhau khi phát triển trên môi tr−ờng TTC. Sau 3 lần cấy truyền liên tiếp từ một khuẩn lạc thu đ−ợc chủng vi khuẩn thuần. Đại diện của mỗi dạng hình thái khuẩn lạc của chủng thuần đ−ợc giữ trong n−ớc cất vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả thu đ−ợc 9 chủng vi khuẩn thuần khác nhau.
ảnh 4.4. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh
ảnh 4.4 và bảng 4.1 cho thấy, hình thái, mầu sắc và kích th−ớc của các khuẩn lạc gây ra triệu chứng bệnh héo xanh trên lạc và vừng là khác nhau.
Kích th−ớc khuẩn lạc đ−ợc quan sát ở thời điểm sau 48 giờ phát triển dao
động từ 0,8 mm đến 3,0 mm và đa số khuẩn lạc có kích thước nằm trong khoảng 1,0 mm ữ 1,8 mm.
Độc tính của các chủng này đ−ợc kiểm tra bằng khả năng gây bệnh trên cây vừng và cây lạc khi cây có 3-6 lá thật.