4.2.1. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng
Với mục đích là tuyển chọn những chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh. Từ các mẫu cây khoẻ nh−: cà chua, vừng, hành, cà dại ở các vùng canh tác rau màu thuộc các tỉnh Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Lào Cai, Thanh Hoá, Nghệ An…Trong đó có một số mẫu đ−ợc thu ở vùng chuyên canh trồng lạc và vừng, một số mẫu không thuộc vùng có bệnh héo xanh. Kết quả đ phân lập đ−ợc thể hiện qua bảng 4.3
Bảng 4.3. Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc STT Ký hiệu
chủng
Nguồn gèc
Địa điểm
thu mẫu Hình dạng Kích cỡ Mầu sắc 1 CI4-1 Cà dại Lào Cai Chuẩn mực Nhỏ Trắng trong 2 CI4-2 Cà dại Lào Cai Gấp nếp,
nh¨n Trung
bình Trắng sữa 3 NA4 Cà dại Nghệ An Tròn, phẳng Trung
bình Trắng 4 CI1-5 Cà chua Vĩnh phúc Tròn, chuẩn
mực Nhỏ Xanh nhạt
5 NA3 Cà dại Thanh
Hoá Bề mặt
phẳng Trung
bình Trắng đục
6 CI4-3 Cà chua Bắc Ninh Nhăn Nhỏ Vàng Cam
7 NA2 Cá Thanh
Hoá Chảy Trung
bình Trắng trong
8 NA7 Cà dại Nghệ An Đặc nhỏ Vàng nhạt
Các chủng vi khuẩn đối kháng đ−ợc đặt tên theo nguồn gốc xuất xứ và theo mẫu cây đ−ợc phân lập nhằm thuận tiện cho quá trình sử dụng và nghiên cứu chúng
CI4 -1 CI1- 5
ảnh 4.6. Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng đối kháng
Để tuyển chọn chính xác đ−ợc những chủng có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh, sau khi phân lập và làm thuần, các chủng vi khuẩn đ đ−ợc thử t−ơng tác với các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh HL1 và VT3 trong điều kiện invitro nhằm đánh giá nhanh hoạt lực đối kháng vi khuẩn gây bệnh của chúng.
4.2.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn
Hoạt lực đối kháng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh héo xanh đ−ợc thể hiện ở bảng 4.4
CI4 - 1 CI1 - 5
NA4 CI4 - 2
Bảng 4.4. Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng R. solanacearum ( trong điều kiện invitro)
Đường kính vòng ức chế tạo ra bởi các chủng vi khuẩn đối kháng trên thảm vi khuẩn gây bệnh chỉ thị (R-r: cm)
Các chủng vi khuẩn gây bệnh STT Chủng đối
kháng
VT3 HL1
1 CI4-1 1,0 1,2
2 CI4-2 2,0 2,5
3 NA4 1,9 2,2
4 CI1-5 1,5 1,8
5 NA3 0,6 0,8
6 CI4-3 0,4 0,4
7 NA2 0,4 0,6
8 NA7 0,7 0,6
Kết quả thu đ−ợc ở bảng 4.4 cho thấy 8 chủng vi khuẩn CI4-1, CI4-2, NA4, CI1-5, NA3, CI4-3, NA2 đều có hoạt tính đối kháng với 2 chủng VT3 và HL1.Trong đó các chủng NA4 và CI4-2 có hoạt tính đối kháng cao nhất với cả hai chủng vi khuẩn gây bệnh với đường kính vòng ức chế dao động từ 1,9 cm đến 2,5 cm. Điều này cho thấy có thể hai chủng này đ tiết vào môi trường một chất kháng sinh nào đó hoặc bacteriocin... có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn héo xanh trên môi trường thạch đĩa. Một số chủng còn lại nh− CI4-3, NA3, NA2, NA7 thể hiện hoạt tính đối kháng yếu với các chủng vi khuẩn gây bệnh.
ảnh 4.7. Vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh VT3 của vi khuẩn đối kháng NA4 Từ kết quả trên đ mở ra một h−ớng mới, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn đối kháng trong phòng trừ bệnh héo xanh cây trồng nói chung, cây vừng và cây lạc nói riêng, vì tất cả các chủng vi khuẩn đối kháng này đều
đ−ợc phân lập từ các vùng địa lý khác nhau từ nóng ẩm đến lạnh khô. Đây là một điểm −u thế khi chọn lọc các chủng đối kháng thích nghi với các vùng địa lý thay đổi.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
CI4-1 CI4-2
NA4 CI1-5
NA3 CI4-3
NA2 NA7 chung vi khuan
duong kinh vong uc che
VT3 HL1
Đồ thị 4.1. Hoạt lực đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn
đối kháng trên đĩa petri
NA4
Qua kết quả thu đ−ợc ở bảng 4.4 và trong phạm vi đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 4 chủng CI4-1, CI4-2, NA4, CI1-5 điển hình.
4.2.3. Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng sử dụng trong xác định vị trí phân loại của chúng
Để dễ dàng hơn cho việc phân loại các chủng vi khuẩn đối kháng, bước
đầu xác định một số một số đặc điểm cơ bản của các chủng này theo phương pháp của N.W. Schaad- 2002
Bảng 4.5. Một số đặc điểm cơ bản phục vụ mục đích phân loại các chủng vi khuẩn đối kháng
Các chủng vi khuẩn đối kháng
Đặc điểm/ Tính chất
CI4-1 CI4-2 NA4 CI1-5
Gram + + - -
Kþ khÝ - - + +
HiÕu khÝ + + + +
Khuẩn lạc màu vàng trên môi tr−êng YDC
- - - +
Nhày trên môi tr−ờng YDC - - + -
Oxidaza + + + +
Huỳnh quang trên KB - - + -
Phát triển trên D1M - - + -
Chú thích: +: d−ơng tính, -: âm tính.
Dựa trên một số phản ứng xác định khả năng sinh hoá sinh lý của các chủng vi khuẩn trên cho thấy, hai chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng CI4-1, CI4-2 là vi khuẩn Gram dương, chúng có khả năng chịu nhiệt và có một số đặc điểm giống với các đặc điểm thuộc chi Bacillus. Chủng CI1-5 có đặc điểm giống chi Pantoea. Chủng NA4 có đặc điểm tương tự chi Pseudomonas vì chúng có khả
năng phát quang trên môi tr−ờng KB, oxidaza d−ơng tính.