Phun electron được sinh ra do sự phân tán chất lỏng thành các hạt bụi qua điện trường.
Phương pháp này được biết đến từ lâu và được sử dụng để ion hóa mẫu trong thiết bị khối phổ.
Thực nghiệm đầu tiên của của ion hóa phun electron (ESI) của polime được thực hiện bởi Malcolm Dole vào năm 1960. ESI cho khối phổ được sử dụng trong thiết bị hiện đại ngày nay được phát triển bởi John Fenn vào năm 1980. Năm 2002, Fenn nhận được giải Nobel cho phát minh này.
ESI cung cấp sự sản sinh ion phân tử trực tiếp từ mẫu trong dung dịch. Nó có thể được sử dụng cho lượng nhỏ bipolime lớn tới khoảng 200.000 Da của peptid, protein, cacbohydrat, fragment DNA và lipit. Giống như MALDI, ESI là phương pháp ion hóa liên tục và thuận lợi cho sự ghép với các phương pháp tách chất lỏng như HPLC.
1. Nguyên tắc ion hóa
Ion hóa phun electron dựa trên sự phân tán chất lỏng với sự hỗ trợ của một điện trường. Dung dịch mẫu chứa ion phân tích được bơm vào một buồng đốt nóng qua một capila hay kim rỗng. Thế hiệu chừng vài kilovolt được đặt giữa capila và thành buồng đối diện (hình 70 và 71) sinh ra một điện trường mạnh ở đầu capila đi ra. Nếu capila có thế dương, ion âm quay trở lại còn ion dương đi ra khỏi capila đến thành buồng đối diện. Các ion dương tạo ra hình miệng côn ở cuối đầu ra của capila. Các giọt chứa ion phân tích tích điện dương được hình thành ở cuối của miệng côn này. Các ion này được chuyển động theo điện trường trong khi dung môi liên tục mất đi do sự bay hơi. Các giọt co lại dẫn đến làm tăng mật độ điện tích ở bề mặt giọt. Lực đẩy trên bề mặt giọt dẫn đến xô đẩy chúng làm nổ tung thành các hạt nhỏ mini như bụi. Quá trình co lại và vỡ tung xẩy ra lặp đi lặp lại, kết quả là mẫu phân tích hoàn toàn bị solvate hóa và đi vào bộ phận phân tích khối lượng. Bộ phận ESI kết hợp với bộ phận phân tích khối lượng tạo ra thiết bị phân tích phổ khối phun electron (ESI-MS). Có trường hợp nó kết hợp với hai bộ phận phân tích khối lượng cho thiết bị có tên gọi phổ khối kép phun electron (ESI-MS/MS) (tandem mass spectrometer, ESI-MS/MS). Thiết bị phổ khối ESI-MS/MS kết hợp với máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đóng vai trò như một detecto trở thành thiết bị có tên chung HPLC/MS/ESI được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực hóa sinh, phân tích protein-peptit cho sắc kí đồ và phổ khối của mỗi đoạn (hình 72a,b).
phun capila
Thê cao
phân tich khôi
Hình 70. Sơ đồ thiết bị phun electron
Buồng phun mẫu Ion mẫu Detecto Phổ Hình 71. Sơ đồ phổ kế ESI-MS
Đặc trưng của sự ion hóa là sự hình thành các ion tích điện. Các ion quan sát được ở đây có thể là ion quasimolecul được phát sinh do thêm vào cation hydrogen biểu thị là [M+H]+, [M+2H]2+, [M+3H]3+ đến [M+nH]n+ hay cation khác như ion natri cho ion [M+Na]+ hay ion âm [M-H]–. Đối với các phân tử lớn có thể sinh ra nhiều loại ion mang điện tích khác nhau. Các mẫu thích hợp cho ESI phải hòa tan và bền trong dung dịch và cần thiết làm sạch tương đối. Các ion được hình thành trong quá trình phun phải tránh các chất đệm, muối và chất tẩy rửa. Phải giữ tiếp xúc đến mức tuyệt đối.
Hiệu thế giữa capila và bức thành đối diện của buồng có thể thực hiện theo hai cách phụ thuộc vào cation hay anion được phân tích:
1) Theo mốt ion dương (positive ion mode), khi đó capila có thế dương. Các ion mang điện tích âm quay trở lại capila và chỉ có ion mang điện tích dương vượt qua buồng vào bộ phận phân tích khối lượng và detectơ. Thông thường giá trị pH thấp của dung dịch mẫu được sử dụng để hình thành cation.
2) Theo mốt ion âm (negative ion mode), khi đó hiệu thế ngược lại, capila mang điện tích âm.
Cation quay trở lại capila còn anion vượt qua buồng phân tích khối lượng. Theo kiểu này giá trị pH cao, pH > pI được sử dụng.
2. Nguồn ESI và giao diện (Interface)
Ion hóa phun electron được thực hiện ở áp suất thường, tuy nhiên bộ phận phân tích khối lượng vận hành dưới áp suất cao. Do đó giao diện đặc biệt cần thiết để vận chuyển ion từ buồng ion hóa vào khối phổ. Sơ đồ của giao diện như vậy được chỉ ra ở hình 71. Thông thường khu vực áp suất trung gian ngăn cách buồng ion hóa với bộ phận phân tích khối lượng, mẫu lỏng kết hợp với một dòng khí đi vào buồng ion hóa đốt nóng. Sự phun electron được sản sinh bởi sử dụng thế hiệu giữa kim rỗng và tấm chắn giao diện. Một lượng nhỏ ion phân tích được hòa tan đi ra khỏi buồng ion hóa vào khu vực áp suất trung gian. Các ion phân tích đi qua vào bộ phận phân tích khối lượng.
Nó thường là thiết bị tứ cực (quadrupole) vận hành dưới áp suất cao.
Đặc trưng của ESI là mẫu có thể bơm liên tục vào thiết bị phân tích và có thể ghép với phương pháp HPLC. Lượng mẫu phân tích nhỏ (bảng 1).
Bảng 21. Lượng mẫu cần cho ESI
Chất Mẫu khô Dung dịch
Protein, Peptit Polyme Đenđime Hợp chất cơ kim Hợp chất hữu cơ
1àg 1mg 1mg 1mg 1mg
1àg/100àl 1mg/250àl 1mg/250àl 1mg/250àl 1mg/250àl 3. Ứng dụng của ESI-MS
ESI sử dụng thuận lợi cho sinh học phân tử (biomolecules) khi chúng phân cực và hòa tan trong hệ dung môi có thể dùng để phun. Peptid, protein, cacbohyđrat, đoạn DNA và lipit thường
được phân tích bằng ESI-MS. Phân tích trọng lượng là nhiệm vụ chính. Đôi khi còn sử dụng thiết bị ESI cặp đôi (ESI-MS-MS).
Vấn đề khó khăn của ion hóa phun electron là phải tránh các chất bẩn hay tạp chất trong mẫu.
Nồng độ chất đệm và muối không vượt quá 0,1mM vì nó ngăn cản sự hình thành ion trong quá trỡnh phun electron cũng như một vài chất tẩy rửa cú nồng độ lớn hơn 10àM đều cản trở. Thụng thường chất đệm dùng trong phân tích sinh học (bioanalysis) chứa 100mM photphat và 150mM NaCl do đó không thuận lợi cho phương pháp phun electron.
Các dung môi bay hơi như methanol, etanol và axetonitrin được sử dụng phổ biến cho phương pháp ESI.
Do sự ion hóa nhẹ nhàng không có nhiều mảnh ion (fragment) được quan sát, phổ ESI cho các ion [M+H]+, [M+2H]2+, [M+3H]3+ đến [M+nH]n+. Số lượng các số khối phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Ví dụ phổ ESI-MS đoạn trypsin của methionin hocmon sinh trưởng của người (hình 72b) cho ion(M+H)+ ở m/z 1362,5 Da và ion (M+2H)2+ ở m/z 681,0 Da.
Hình 73 cho phổ ESI-MS có mặt ion Na+ và các fragment như [8-oxodG+Na]+, [8-oxodG+Na]+ …
Hình 74 chỉ ra phổ ESI-MS của chuỗi peptit LLYGGSVTGATCK.
Hình 75 Phổ ESI-MS của N-(4-clophenyl)-3-hiđroxinaphtalen-2-cacboxami.
Trên phổ cho ion phân tử (M-H)+ =296 có cường độ cao nhất và ion đồng vị của clo m/z = 298, ngoài ra chỉ có một ion mảnh m/z = 144 do cắt vòng naphtol như sau:
OH N O
Cl
H OH
m/z 144 M 297
Hình 72a. Sắc ký đồ của sản phẩm phân hóa trypsin của methionin hocmon sinh trưởng của người
500 1000 1500 2000 0
25 50 75 100
(M+H)+ 1362.5 681.0
(M+2H)2+
T11 MW = 1361
454.5
%B
m/e
Hình 72b. Phổ khối ESI của pic T11 trypsin của methionin hocmon sinh trưởng của người
Hình 73. Phổ ESI-MS
Hình 74. Phổ ESI-MS của chuỗi peptit LLYGGSVTGATCK
Hình 75. Phổ ESI-MS của N-(4-clophenyl)-3-hiđroxinaphtalen-2-cacboxami