Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến một số nghiên cứu nhân giống invitro
GIỐNG IN VITRO
2.5.1. Chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng trong hầu hết các hệ thống nuôi cấy phôi vô tính. Trong thực nghiệm nuôi cấy khởi đầu thường dùng những phạm vi rất hẹp chất điều tiết sinh trưởng được đưa vào môi trường.
Loại auxin tổng hợp như 2,4-D được dùng phổ biến trong những nuôi cấy ban đầu. Những auxin khác cũng được sử dụng như IBA, picloram, các auxin yếu là NAA và IAA được dùng trong một vài hệ thống nuôi cấy. Auxin được dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi, có lẽ do hoạt hóa phân hóa gen khởi đầu và cũng thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua phân bào liên tiếp, đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào thành các phôi. Trong trường hợp mẫu cấy có chứa các tế bào phát triển phôi thì môi trường nuôi cấy có thể không cần đến auxin.
Ngoài auxin, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh ở các loài thực vật hai lá mầm. Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy là BAP, nhưng các cytokinin khác như kinetin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tùy thuộc vào loại thực vật. Trong nuôi cấy phôi, nồng độ của các chất điều tiết sinh trưởng là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy. Khi nồng độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại hàm lượng quá cao có thể gây độc cho mẫu.
Sự phát triển của phôi vô tính cà rốt trong nuôi cấy trải qua một quá trình gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có môi trường riêng. Các mô sẹo được nuôi cấy
khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin và thường được sử dụng 2,4- D ở phạm vi nồng độ 0,5 - 1,0 mg/l. Trên môi trường này, sự phân hóa mô sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm phát triển phôi” (EC). Nếu các EC được chuyển sang môi trường có nồng độ auxin rất thấp (0,01 -0,1 mg/l) hoặc không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi trưởng thành. Sự có mặt của auxin trong môi trường tăng sinh là cần thiết cho mẫu có thể phát triển thành phôi khi chuyển sang môi trường phù hợp. Các môi trường tăng sinh có thể coi là môi trường cảm ứng đối với sự hình thành phôi vô tính. Những mẫu duy trì liên tục trong môi trường không có auxin sẽ không hình thành phôi.
2.5.2. Đường
Sucrose là một loại đường thường được sử dụng để cung cấp nguồn carbohydrate cho sự phát sinh phôi. Sucrose và auxin có mối tương tác với nhau, nồng độ sucrose hoặc auxin đều phụ thuộc lẫn nhau. Bên cạnh sucrose cũng có một số đường đôi, đường đơn khác có thể được sử dụng thành công và cho thấy có hiệu quả hơn trên những đối tượng khác. Galactose và lactose tốt hơn sucrose cho việc cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo của Citrus, trong khi đó thì sucrose lại cho kết quả tốt hơn glucose và fructose (Kochba et al., 1982). Đôi khi cũng cần phối hợp hai loại đường khác nhau để giúp cho sự thành lập phôi vô tính.
2.5.3. pH
pH trong tế bào là một nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa và sự phân chia tế bào. Sự biến đổi pH trong tế bào chất được biết là rất cần thiết để điều khiển chu kì tế bào, sự sinh trưởng và phân chia tế bào (Pasternak et al., 2002). Giá trị pH trong không bào cũng như trong lục lạp có thể được xem như là một nhân tố chỉ thị của kiểu tế bào (có khả năng phát sinh và không có khả năng phát sinh phôi). pH trong tế bào chất tăng liên quan đến sự phân chia tế bào. Auxin làm tăng sự vận chuyển proton đi ra, kết quả là làm giảm pH. pH trong tế bào thấp được cho là có liên quan đến quá trình nới lỏng thành tế bào cần thiết cho sự kéo dài tế bào trực tiếp trong quá trình phát triển phôi.
2.5.4. Ánh sáng
Phôi vô tính có thể được tạo ra trong những điều kiện sáng và tối khác nhau. Có những loài có nhu cầu ánh sáng cao nhưng cũng có những loài sự hình thành phôi xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn. Việc cảm ứng tạo phôi ở cây họ cà hoàn toàn cần ánh sáng (Gorpenchenko et al., 2006). Ngược lại cảm ứng phôi
ở cây Podophyllum hoàn toàn cần điều kiện tối (Arumugam and Bhojwani, 1990). Ở cây vân sam Na Uy thì việc hình thành phôi vô tính chỉ có thể thực hiện được trong điều kiện tối hoàn toàn nếu có sự hiện diện của ammonium trong môi trường và việc loại bỏ ammonium ra khỏi môi trường là rất cần thiết trước khi việc tạo phôi được tiến hành ngoài sáng (Verhagen and Wann, 1989). Ánh sáng đỏ thúc đẩy tạo phôi trên cây chà là trong khi ánh sáng xanh làm giảm khả năng đó. Trong việc tạo phôi vô tính cây cà rốt thì ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh lục hoặc tối đều có hiệu quả tương tự nhau, còn ánh sáng xanh hoặc ánh sáng trắng thì lại ức chế hiệu quả cảm ứng tạo phôi.