TỔNG QUAN
Tổng quan về dihydroartemisinin
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của DHA
- Tên khoa học: (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimethyl- 3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol [58]
- Tên khác: Artenimol [58], dihydroqinghaosu [36], shuangqing qinghaosu [10]
- Khối lượng phân tử: 284,35 g/mol [10]
- Hình thức: DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi [10]
- Độ tan: Rất ít tan trong nước (~137,4 μg/ml) và ít tan trong dầu, tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform [9], [57]
- Năng suất quay cực [α]D 20 = +140 o – +146 o (dung dịch 1,0026% trong cloroform) [9] DHA là dẫn xuất của artemisinin đã được thay thế nhóm lacton ở vị trí
C10 của DHA là một cacbon bất đối nhờ nhóm hydroxy bán acetal, dẫn đến sự hình thành hai đồng phân quang học α và β Nghiên cứu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X cho thấy DHA chủ yếu tồn tại ở dạng β trong trạng thái rắn, trong khi trong dung dịch, DHA có thể xuất hiện ở cả hai dạng.
DHA không bền vững trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, nơi nó dễ bị thủy phân Tuy nhiên, DHA lại ổn định hơn trong môi trường trung tính Bên cạnh đó, DHA cũng nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng, ảnh hưởng đến tính chất của nó.
Nghiên cứu trên động vật cho thấy DHA được hấp thu tốt qua đường uống với tỷ lệ liên kết protein huyết tương đạt 50% Khi sử dụng liều 20 mg/kg, thời gian bán thải là 2,1 giờ và hoàn toàn thải trừ sau 3,04 giờ, phân bố nhanh đến gan và tim, đồng thời DHA cũng tập trung nhiều ở hồng cầu nhiễm P falciparum DHA chủ yếu được thải trừ qua nước tiểu (82,7%) và một phần qua phân Đặc biệt, khi DHA được sử dụng cùng với các thuốc khác có tỷ lệ liên kết protein huyết tương cao, độc tính không tăng lên Nghiên cứu trên người cho thấy DHA cũng hấp thu tốt với liều 2 mg/kg và 4 mg/kg, nồng độ cao nhất trong huyết tương đạt được sau 1-2 giờ, với thời gian bán thải từ 0,8 đến 1,5 giờ.
DHA là một chất có khả năng diệt ký sinh trùng sốt rét hiệu quả, đặc biệt là P falciparum Hợp chất artemisinin, bao gồm DHA, tiêu diệt ký sinh trùng gần như ngay lập tức nhờ vào cơ chế liên kết với hem, tạo ra các gốc tự do trung tâm cacbon Những gốc tự do này sẽ alkyl hóa các protein cần thiết cho sự phát triển của ký sinh trùng, dẫn đến việc tiêu diệt chúng.
DHA đã được chứng minh có khả năng chống khối u thông qua hai cơ chế tiêu diệt tế bào ung thư Cơ chế thứ nhất liên quan đến việc tạo ra các gốc tự do oxy hoạt tính qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu Cơ chế thứ hai là sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid, dẫn đến hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton Cả hai cơ chế này đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể, với các gốc tự do có khả năng oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và ADN, từ đó kích thích quá trình tự chết của tế bào ung thư.
Năm 2014, nghiên cứu của Chen và cộng sự đã chỉ ra rằng DHA có khả năng tăng cường hiệu quả chống ung thư của paclitaxel (PTX) và cisplatin trên tế bào ung thư buồng trứng Kết quả cho thấy DHA có tác dụng tích cực trong việc điều trị các tế bào ung thư buồng trứng.
Nghiên cứu cho thấy 4 loại tế bào có IC 50 từ 1 μM đến 2 μM DHA có tác dụng hiệp đồng với PTX (CI từ 0,6 đến 0,73) và cisplatin (CI từ 0,98 đến 1,11) trên tế bào SKOV3 Đặc biệt, liều thấp DHA (0,5 μM) làm tăng đáng kể hiệu quả hiệp đồng của sự kết hợp giữa PTX và cisplatin trên tế bào SKOV3, với CI từ 0,4 đến 0,83.
Theo Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển Quốc tế 2019, DHA nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 (100 × 4,6 mm, 3 μm) với pha động là hỗn hợp ACN và nước tỷ lệ 60:40 (tt/tt) và bước sóng phát hiện 216 nm Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, hòa tan DHA và artemisinin với nồng độ 1,0 mg/ml trong pha động Dung dịch chuẩn hỗn hợp DHA (1,0 mg/ml) và artemisinin (1,0 mg/ml) được tạo ra trong hỗn hợp ACN và nước tỷ lệ 80:20 (tt/tt) Tiêm 20 μl mỗi dung dịch vào cột sắc kí C18 với tốc độ dòng 0,6 ml/phút DHA thể hiện hai pic với độ phân giải giữa pic artemisinin và pic α-DHA khoảng 0,6; độ phân giải giữa hai pic của DHA không thấp hơn 2,0; và số đĩa lý thuyết không thấp hơn 6000 được tính với pic tham khảo của DHA.
Năm 2010, quy định định lượng DHA được thực hiện bằng phương pháp đo UV, cụ thể là đo độ hấp thụ tại bước sóng 238 nm Mẫu trắng sử dụng là dung dịch hỗn hợp natri hydroxid 2% và ethanol theo tỷ lệ 4:1 Hàm lượng DHA được tính toán bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn có cùng nồng độ.
Ngoài hai Dược điển đã đề cập, nhiều nghiên cứu khác cũng đã phát triển các phương pháp định lượng DHA Một số nghiên cứu tiêu biểu được trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng DHA
Tên các nghiên cứu Đối tượng định lượng
Phương pháp định lượng Điều kiện định lượng
Nghiên cứu của Zhang và các cộng sự [61]
Nano DHA sử dụng chất mang thân lipid
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
- Pha động bao gồm ACN, dung dịch amoni sulfat 0,02 M, dung dịch triethylamin 12% với tỷ lệ 100:100:0,15 (tt/tt/tt)
- Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện 213 nm
- Nhiệt độ chạy sắc kí 30 o C
- Thể tích tiêm mẫu là 50 μl
Nghiên cứu của Attih và các cộng sự
DHA trong viên nén hoặc trong thuốc bột
- Dựa trên phản ứng của DHA với kali iod (1:1), iod giải phóng được chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat với chỉ thị hồ tinh bột
- Phạm vi định lượng từ 5 đến 70 mg/ml DHA
Nghiên cứu của Babalola và cộng sự
Quang phổ UV sử dụng p-nitroanilin làm tác nhân tạo dẫn xuất
Tiến hành phản ứng giữa dung dịch methanol của DHA và p-nitroanilin trong môi trường acid HCl 1M, với điều kiện nhiệt độ cao và thời gian phản ứng ngắn Tỷ lệ giữa DHA và p-nitroanilin được duy trì ở mức 2:1.
- Đo độ hấp thụ của sản phẩm tại bước sóng 290 nm
Nghiên cứu về độ ổn định của DHA đã chỉ ra rằng, theo Parapini và các cộng sự năm 2015, DHA duy trì sự ổn định tốt trong khoảng pH từ 2,2 đến 7,0 khi ở nhiệt độ 37 o C Tuy nhiên, ở các môi trường có pH quá acid hoặc kiềm, DHA dễ bị phân hủy hơn Đặc biệt, DHA cho thấy độ ổn định cao hơn trong huyết tương.
Tổng quan về paclitaxel
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của PTX
- Tên khoa học: 4,10β-Bis(acetyloxy)-13α-[[(2R,3S)-3-benzamido-2-hydroxy-3- phenylpropanoyl]oxy]-1,7β-dihydroxy-9-oxo-5β,20-epoxytax-11-en-2α-yl benzoate
- Công thức phân tử: C47H51NO14
- Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [17], [55]
- Hình thức: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dạng tinh thể
- Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và dễ tan methylen clorid [17], [51]
- Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực từ -49,0 o đến -55,0 o ở dạng khan [17], [55]
Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều truyền vào tĩnh mạch và giảm theo đồ thị hai pha Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương đạt 89% (in vitro) Ở giai đoạn ổn định, thể tích phân bố dao động từ 5 – 6 lít/kg thể trọng, cho thấy thuốc phân bố chủ yếu ở ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của mô Thời gian bán thải của thuốc khoảng
Sau khi truyền tĩnh mạch, khoảng 2 – 13% paclitaxel được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng ban đầu trong khoảng thời gian từ 6 đến 13 giờ Nghiên cứu trên động vật thí nghiệm cho thấy paclitaxel được chuyển hóa tại gan, với độ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg, tương đương 6,0 – 15,6 lít/giờ/m².
Paclitaxel, một hoạt chất chiết xuất từ vỏ cây thông đỏ Taxus brevifolia, được biết đến như một loại thuốc chống ung thư hiệu quả Hoạt động của paclitaxel liên quan đến việc tăng cường quá trình trùng hợp các dime tubulin để hình thành và ổn định các ống vi thể, đồng thời ức chế quá trình giải trùng hợp Điều này dẫn đến việc ngăn chặn sự tái cấu trúc bình thường của mạng lưới ống vi thể trong giai đoạn phân bào và ảnh hưởng đến chức năng của ty lạp thể Hơn nữa, paclitaxel còn gây ra sự hình thành các cấu trúc bất thường trong ống vi thể trong quá trình phân bào, dẫn đến sự phá vỡ nhiễm sắc thể.
- Điều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng các anthracyclin và platin đã thất bại hay bị chống chỉ định [2]
Điều trị ung thư vú di căn trở nên cần thiết khi các liệu pháp thông thường, đặc biệt là anthracyclin, không còn hiệu quả hoặc khi ung thư vú tái phát trong vòng 6 tháng sau điều trị bổ trợ.
- Điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư Kaposi liên quan đến AIDS [2],
Truyền tĩnh mạch được thực hiện với liều 175 mg/m² trong thời gian 3 giờ và có thể lặp lại sau ít nhất 3 tuần Liều mới chỉ được sử dụng khi số lượng bạch cầu hạt trung tính vượt quá 1,5 x 10^9/lít (1500/m³) và số lượng tiểu cầu lớn hơn 100 x 10^9/lít (100.000/m³).
- Ở người bệnh có số lượng bạch cầu hạt bị giảm nặng (dưới 0,5 x 10 9 /lít, hay 500/m 3 ) trong quá trình điều trị dài bằng paclitaxel thì nên giảm 20% liều dùng
Thuốc paclitaxel cần được pha loãng trong dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch glucose 5%, hoặc hỗn hợp của cả hai, với nồng độ cuối cùng trong dịch truyền đạt từ 0,3 đến 1,2 mg/ml.
1.2.7 Một số phương pháp định tính
1.2.7.1 Đo góc quay cực của paclitaxel
Hòa tan 0,25 g paclitaxel trong methanol và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi Góc quay cực phải nằm trong khoảng từ -49,0 o đến -55,0 o [17]
1.2.7.2 Phương pháp đo phổ hồng ngoại IR
Tiến hành đo phổ hồng ngoại của paclitaxel và so sánh với phổ hồng ngoại của paclitaxel chuẩn Để đảm bảo tính chính xác, phổ hồng ngoại của chất thử cần phải tương ứng với phổ hồng ngoại của chất chuẩn.
1.2.8 Môt số phương pháp định lượng
1.2.8.1 Phương pháp đo quang UV – Vis
Paclitaxel được định lượng bằng phương pháp UV – Vis trong môi trường đệm phosphat pH 7,4 và tại bước sóng 230 nm
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn chứa paclitaxel với nồng độ chính xác khoảng 10 μg/ml, được pha loãng bằng methanol và đệm phosphat pH 7,4 theo tỷ lệ thể tích 30:70.
1.2.8.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao – HPLC
Dung môi hòa tan: Hỗn hợp của methanol và acid acetic (200:1)
Pha động: Hỗn hợp của nước và acetonitril (11:9)
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch có nồng độ dược chất khoảng 1 mg/ml trong dung môi hòa tan Điều kiện sắc kí:
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
Tổng quan về lecithin
Lecithin là một từ phổ biến để chỉ phospholipid (PL) tự nhiên [6] Theo Dược điển
Lecithin, theo tiêu chuẩn Mỹ 2017 (USP 40-NF 35), là một hỗn hợp các phosphatid không tan trong aceton, chủ yếu bao gồm phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS) và phosphatidylinositol (PI), cùng với triglycerid, acid béo và cacbon hydrat được chiết xuất từ dầu thực vật Thành phần của lecithin có sự biến đổi lớn tùy thuộc vào nguồn gốc và mức độ tinh chế; chẳng hạn, lecithin từ lòng đỏ trứng chứa 80,5% phosphatidylcholin và 11,7% phosphatidylethanolamin, trong khi lecithin từ đậu nành có 21% phosphatidylcholin, 22% phosphatidylethanolamin và 19% phosphatidylinositol, kèm theo các thành phần khác.
Trong đó, R1, R2 là các gốc acid béo
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của PC trong lecithin
Lecithin tan trong các dung môi ether, cloroform và các acid béo, tan ít trong benzen, không tan trong các dung môi phân cực [49]
Lecithin được sử dụng phổ biến trong nhiều ứng dụng như nhũ hóa, phân tán và ổn định cho các sản phẩm bôi ngoài da, uống hoặc tiêm Ngoài ra, lecithin cũng là thành phần quan trọng trong các hệ thống nano vận chuyển thuốc, bao gồm liposome, micell, nano lipid rắn, nano lai lipid-polyme và nhũ tương nano.
Tổng quan về PLGA
1.4.1 Cấu trúc, tính chất và ứng dụng
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của PLGA
PLGA, một copolyme được tạo thành từ acid glycolic và acid lactic, là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất trong việc bào chế hệ tiểu phân nano Polyme này hòa tan trong nhiều dung môi như aceton, dicloromethan và ethyl acetat, và khi tiếp xúc với nước, PLGA sẽ thủy phân, giải phóng acid lactic và acid glycolic Hai monome này sau đó được chuyển hóa qua chu trình Krebs và dễ dàng thải trừ dưới dạng CO2 và nước, giúp giảm thiểu độc tính tuần hoàn của các hệ thống đưa thuốc PLGA đã được FDA và EMA phê duyệt cho nhiều dạng thuốc khác nhau sử dụng trên người.
10 làm chất mang cho các tiểu phân nano đang được nghiên cứu ứng dụng trong các liệu pháp chẩn đoán hình ảnh và điều trị ung thư [3]
PLGA thương mại có nhiều loại với khối lượng phân tử và tỷ lệ thành phần monome khác nhau Acid lactic có tính thân dầu hơn acid glycolic, khiến các PLGA giàu acid lactic kém thân nước và hấp thu nước ít hơn, dẫn đến quá trình phân hủy chậm hơn Quá trình phân hủy polyme, cả in vitro và in vivo, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như phương pháp bào chế, sự hiện diện của các hợp chất có phân tử lượng thấp, kích thước, hình dạng và hình thái bề mặt, cũng như các đặc tính vốn có của polyme như khối lượng phân tử, cấu trúc hóa học, độ kỵ nước, trạng thái kết tinh và nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh Các thông số hóa lý như pH, nhiệt độ, lực ion của môi trường, cùng với hàm lượng và loại dược chất, cũng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế thủy phân.
Một số loại PLGA phổ biến trong bào chế bao gồm PLGA 50:50, PLGA 65:35 và PLGA 75:25 Trong đó, PLGA 50:50, với tỷ lệ monome acid lactic và acid glycolic là 50:50, thường được sử dụng làm giá mang thuốc nhờ khả năng duy trì thời gian giải phóng dược chất kéo dài và phân hủy nhanh chóng, giúp giảm thiểu độc tính liên quan đến sự tích lũy của tiểu phân tá dược và dược chất.
1.4.2 Nhược điểm của PLGA khi sử dụng làm chất mang thuốc
Một trong những thách thức lớn nhất của hệ nano polyme PLGA là tỷ lệ dược chất nano hóa thường thấp, thường dưới 20%, đặc biệt đối với các chất có độ thân dầu kém.
Hệ nano sử dụng PLGA dễ bị nhận diện và tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch do bề mặt sơ nước của các tiểu phân nano, khiến chúng bị coi là chất ngoại lai và bị đào thải ra khỏi máu đến gan và lách Sau khi tiêm vào cơ thể, các tiểu phân nano PLGA gắn với protein opsonin trong huyết tương, dẫn đến việc chúng bị bắt giữ bởi đại thực bào, tạo thành một trong những rào cản sinh học lớn nhất cho hệ tiểu phân nano Hơn nữa, tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào gây ra sự tích lũy thuốc tại các mô không bệnh lý, làm giảm hiệu quả điều trị và gia tăng tác dụng không mong muốn, đặc biệt đối với các thuốc kháng ung thư như paclitaxel Đặc biệt, tiểu phân nano PLGA có động học giải phóng gồm hai pha: pha I là giải phóng ồ ạt và pha II là giải phóng chậm.
Việc phóng ồ ạt dược chất ở giai đoạn đầu có thể làm giảm hiệu quả điều trị lâu dài do dược chất không đến được mô hoặc tế bào đích Để khắc phục vấn đề này, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc thay đổi các đặc tính lý hóa bề mặt của tiểu phân nano PLGA, như việc sử dụng các polyme thân nước như chitosan và acid hyaluronic, nhằm kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu và giảm tích lũy ở gan Bên cạnh đó, sự kết hợp giữa nano polyme và hệ mang thuốc liposome đã mở ra hướng đi mới trong công nghệ nano y học Nano lai lipid-polyme, với lõi polyme và vỏ lipid, mang lại tính toàn vẹn cấu trúc cao, khả năng dễ cải thiện đặc tính bề mặt, cùng với tính tương thích sinh học tốt và độc tính thấp Lớp lipid bên ngoài giúp làm chậm sự thấm nước và giảm phân hủy, kéo dài quá trình giải phóng dược chất, đồng thời tăng khả năng nhập bào và nồng độ thuốc tại mô đích Nghiên cứu của Liu và cộng sự đã chỉ ra rằng nano lai lipid-polyme với lõi PLGA và vỏ từ 1,2-dilauryl phosphatidylcholin có khả năng nhập bào hiệu quả hơn so với nano polyme chỉ sử dụng PLGA.
Tổng quan nano polyme-lipid
Nano polyme-lipid, hay còn gọi là hybrid nanoparticles, là các hạt nano có sự kết hợp giữa polymer và lipid, chứa dược chất ở kích thước nano Cả lipid và polymer có thể tồn tại dưới nhiều cấu trúc khác nhau, tạo ra các đặc tính ưu việt cho việc vận chuyển và giải phóng dược phẩm.
- Lõi polyme ở trong, lớp vỏ lipid ở ngoài (nano lai lipid-polyme)
- Lõi lipid ở trong, lớp vỏ polyme ở ngoài (nano lai polyme-lipid)
1.5.2.1 Phương pháp bào chế hai bước (two-step method)
Phương pháp bào chế hai bước bao gồm:
- Bước 1: Bào chế nano polyme hoặc nano lipid
Phối hợp nano polyme với lipid hoặc ngược lại là phương pháp phổ biến trong nghiên cứu phát triển nano lai polyme-lipid Khi bào chế nano lai lipid-polyme, các nano polyme được bao bọc bởi lớp lipid, với các tiểu phân lipid hấp phụ lên bề mặt nano qua tương tác tĩnh điện Ngược lại, trong nano lai polyme-lipid, nano lipid được bao lớp polyme bên ngoài cũng nhờ vào tương tác tĩnh điện Tuy nhiên, lipid có bản chất sơ nước và thường không có thế zeta cao, do đó cần thêm chất diện hoạt ion hóa để thúc đẩy tương tác tĩnh điện, hình thành cấu trúc nano lai Nhược điểm của phương pháp này là quy trình phức tạp, tốn thời gian và năng lượng, đồng thời có nguy cơ rò rỉ dược chất ra môi trường bên ngoài trước khi lớp vỏ lipid hình thành, dẫn đến giảm hiệu suất nano hóa.
1.5.2.2 Phương pháp bào chế một bước
Phương pháp này gồm một bước đồng nhất hóa khi phối hợp đồng thời hai pha dầu và pha nước chứa polyme và lipid
Phương pháp bào chế một bước, hay còn gọi là phương pháp kết tủa nano, liên quan đến việc hòa tan polyme và dược chất trong dung môi đồng tan với nước, như aceton, trong khi pha nước chứa lipid được phân tán ở nhiệt độ cao từ 65-70°C Dung dịch polyme được thêm từ từ vào pha nước, tạo ra một hệ phân tán đồng nhất Trong quá trình khuếch tán dung môi, polyme sẽ kết tủa và lipid tự động kết tập quanh các nano polyme nhờ vào các tương tác giữa các nhóm chức sơ nước Đầu sơ nước của lipid kết tập với tiểu phân polyme, trong khi đầu thân nước hướng ra pha nước, tạo thành nano lai lipid-polyme Lipid thường được sử dụng trong phương pháp này là lipid-PEG, với phần lipid hướng vào trong cấu trúc nano và phần đầu PEG hướng ra ngoài Tỷ lệ khối lượng lipid và polyme là chỉ tiêu quan trọng nhất trong công thức.
Nghiên cứu gần đây đã phát triển nano lai lipid-polyme thông qua phương pháp bào chế một bước, sử dụng nhũ hóa và bốc hơi dung môi Trong quy trình này, lipid, polyme và dược chất được hòa tan trong dung môi không hòa tan với nước (pha dầu) Khi pha dầu được nhũ hóa trong pha nước, một nhũ tương dầu/nước (D/N) được hình thành, với lipid tự kết tập quanh.
13 lõi polyme tương tự như trong phương pháp kết tủa nano Từ đó, hình thành nên nano lai lipid-polyme [15], [21].
Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano chứa DHA, PTX
Năm 2020, tác giả Lê Thiện Giáp đã tiến hành nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp PTX, DHA và PEG, bao gồm tổng hợp phức hợp, xây dựng công thức bào chế và đánh giá các đặc tính lý hóa Kết quả cho thấy tiểu phân nano có kích thước khoảng 110 nm, PDI 0,337, với DHA có hiệu suất entrapment (EE) là 76,68% và nồng độ chất (LC) 16,36%, trong khi PTX đạt EE 98,80% và LC 9,94% Thử nghiệm giải phóng in vitro cho thấy khả năng giải phóng dược chất tương tự nhau ở cả hai môi trường pH 5,0 và pH 7,4 Nghiên cứu cũng xác định chỉ số kết hợp giữa DHA và PTX tại các tỷ lệ khác nhau, với tất cả chỉ số kết hợp đều nhỏ hơn.
Giá trị CI từ 0,7 đến 0,96 cho thấy hai loại thuốc có khả năng tác động hiệp đồng, với tỷ lệ DHA/PTX là 2:1 (kl/kl) mang lại chỉ số kết hợp nhỏ nhất Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tăng lên khi sử dụng hệ tiểu phân nano so với việc sử dụng PTX và DHA tự do trong các thí nghiệm in vitro.
Năm 2018, tác giả Trịnh Thị Hằng và Vũ Thị Kim Phượng tại Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano chứa đồng thời Paclitaxel (PTX) và Docosahexaenoic Acid (DHA) với tỷ lệ 4:1 và 1:1 Nghiên cứu bao gồm khảo sát phương pháp định lượng PTX và DHA bằng HPLC với cột C18, sử dụng điều kiện sắc ký ACN: đệm phosphat pH 3,0 tỷ lệ 58:42, tốc độ dòng 1 ml/phút và bước sóng phát hiện 210 nm Hệ nano bào chế có kích thước tiểu phân nhỏ dưới 160 nm và chỉ số PDI dưới 0,4, tuy nhiên, nhược điểm là chỉ số tải thuốc (LC) rất thấp, dưới 3%.
Năm 2010, Zhang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về việc bào chế hệ nano lipid của DHA thông qua phương pháp khuếch tán dung môi Trong nghiên cứu này, pha dầu bao gồm monostearat, Miglyol 812 và DHA được hòa tan trong 5 ml hỗn hợp dung môi ethanol và aceton theo tỷ lệ 1:1.
14 nhiệt ở 55 o C Sau đó pha dầu được phân tán nhanh vào 20 ml pha nước có chứa Tween
80 (1%, kl/tt) và Poloxamer 188 (1%, kl/tt) ở nhiệt độ phòng dưới điều kiện khuấy từ
Hỗn dịch nano lipid được tạo thành bằng cách quay ở 3000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó sấy chân không ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Để điều chỉnh pH về 1,2, thêm HCl 0,1N vào hỗn dịch, rồi ly tâm trong 50 phút để thu phần rắn Phần này được phân tán lại vào 10 ml dung dịch natri dodecyl sulfat 0,3% nhằm loại bỏ chất tự do Sau khi loại bỏ dược chất tự do, các tiểu phân nano được thêm lactose và glucose và tiến hành đông khô Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức tối ưu với DHA 1 g/l, nồng độ lipid 1%, và tỷ lệ lipid lỏng so với lipid rắn là 0,1:1, đạt EE 98,97 ± 2,3%, LC 15,61 ± 1,9%, KTTP 198 ± 4,7 nm, PDI 0,146 và thế zeta -21,6 ± 1,3 mV Kết quả TEM cho thấy các hạt nano hình cầu mang thuốc trên bề mặt và trong NLC, với mô hình giải phóng thuốc in vitro cho thấy DHA giải phóng nhanh trong 6 giờ đầu (62,86%) và kéo dài đến 48 giờ.
Năm 2001, Chen và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu về nano lipid rắn chứa paclitaxel nhằm kéo dài thời gian tuần hoàn Hệ nano lipid được chuẩn bị bằng cách tiêm 10 ml aceton chứa paclitaxel, acid stearic và lecithin vào 10 ml nước chứa Brij78 ở 75 °C với tốc độ khuấy 1000 vòng/phút Sau đó, hỗn hợp được cô đặc đến 5 ml và thêm vào 100 ml nước ở 0 – 2 °C để tạo thành hỗn dịch nano lipid Kết quả cho thấy kích thước hạt của Brij78-SLN và F68-SLN lần lượt là 103,5 ± 29,2 nm và 220 ± 9,8 nm, với hiệu suất entrapment (EE) tương ứng là 58,2 ± 2,5 % và 75,4 ± 3,2 % Mô hình giải phóng in vitro cho thấy tỷ lệ giải phóng paclitaxel từ F68-SLN và Brij78-SLN rất chậm, chỉ đạt 20% và 7% sau 24 giờ Đánh giá dược động học trên chuột cho thấy cả hai hệ nano lipid đều kéo dài thời gian tuần hoàn, với t1/2β lần lượt là 10,06 giờ và 4,88 giờ, so với paclitaxel tiêm tĩnh mạch chỉ có t1/2β là 1,36 giờ.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Nanjing Jingzhu Bio- Technology (Trung Quốc)
Acid poly(lactic-co-glycolic)
50:50, KLPT 7 – 17 kDa, độ nhớt 0,16 – 0,24 dL/g (dung dịch 0,1% trong cloroform,
Lecithin đậu nành, lecithin chiếm tối thiểu 60%, hàm lượng PC 50,9%
6 Acrysol EL135 (Polyoxyl 35 castor oil)
7 Acrysol K140 (Polyoxyl 40 hydrogenated castor oil)
11 Tween 80 Trung Quốc USP 38-NF 33
12 Polyvinyl alcol (PVA) Trung Quốc NSX
13 Acid phosphoric Trung Quốc USP 38-NF 33
14 Dicloromethan (DCM) Trung Quốc TKHH
16 Acetonitril dùng cho HPLC Merck (Đức) Dùng cho HPLC
17 Methanol dùng cho HPLC Merck (Đức) Dùng cho HPLC
18 Kali dihydrophosphat Merck (Đức) Dùng cho HPLC
19 Một số nguyên vật liệu khác
Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Tên nhà sản xuất, nguồn gốc
1 Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90
Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Horiba Scientific Nano
3 Máy khuấy từ WiseStir Daihan Scientific Co., Ltd
4 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent
5 Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik
6 Máy siêu âm đầu dò Vibra Cell Sonics & Materials, Inc (Mỹ)
7 Máy đo pH Sartorius Mettler Toledo (Mỹ)
8 Cân kỹ thuật Ohaus Đức
9 Cân phân tích Sartorius TE214S Đức
10 Cân phân tích Mettler-Toledo XPE105 Thụy Điển
11 Màng thẩm tích Membra-Cel MC18, 14000
12 Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10000
13 Tủ lạnh sâu Unicryo Mỹ
14 Máy đo phổ hồng ngoại FT/IR-6700
15 Bể siêu âm WUC-A06H Daihan (Hàn Quốc)
15 Một số thiết bị, dụng cụ khác
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC
Nghiên cứu này phân tích ảnh hưởng của các yếu tố trong thành phần công thức và quy trình đến đặc tính của hệ tiểu phân nano chứa DHA và PTX, sử dụng chất mang là acid poly(lactic-co-glycolic) và lecithin Kết quả sẽ giúp tối ưu hóa công thức và quy trình sản xuất, nâng cao hiệu quả của hệ tiểu phân nano trong ứng dụng y học.
Các yếu tố quy trình được khảo sát gồm có:
Các yếu tố thuộc thành phần công thức khảo sát gồm có:
- Tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl)
- Tỷ lệ chất mang PLGA và tổng lượng dược chất (kl/kl)
- Tỷ lệ DHA/PTX (kl/kl)
- Tỷ lệ pha dầu/pha nước (tt/tt)
- Loại chất ổn định pha nước
- Nồng độ chất ổn định trong pha nước
Dựa trên các chỉ tiêu về KTTP, PDI, thế zeta để lựa chọn ra các thành phần công thức và quy trình phù hợp nhất
2.2.2 Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano bào chế được
- Kích thước tiểu phân trung bình (KTTP), chỉ số đa phân tán (PDI), thế Zeta
- Độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano sau khi bào chế
- Hiệu suất nano hóa (EE %) và tỷ lệ dược chất nano hóa (LC %)
- Khả năng giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano trong các môi trường đệm phosphat pH 7,4 và đệm phosphat pH 5,0
- Đánh giá sự có mặt của lecithin trên hệ tiểu phân nano bằng phổ hồng ngoại
- Đánh giá hình thái cấu trúc của tiểu phân nano bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano chứa DHA và PTX với chất mang PLGA và LEC
Hệ tiểu phân nano kết hợp DHA và PTX được phát triển với chất mang PLGA và lecithin, sử dụng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi từ nhũ tương D/N.
- Chuẩn bị pha dầu: Hòa tan DHA, PTX, PLGA và lecithin (LEC) trong 5 ml dicloromethan
- Chuẩn bị pha nước: Dung dịch chất diện hoạt trong nước cất
Trong giai đoạn nhũ hóa, tiến hành nhỏ từ từ từng giọt pha dầu vào pha nước với tốc độ khoảng 2,5 ml/phút bằng micro pipet Để đạt được sự đồng nhất cho nhũ tương D/N, cần sử dụng thiết bị phù hợp.
18 bị siêu âm đầu dò (tần số 20 kHz) Trong quá trình đồng nhất, duy trì nhiệt độ 0 – 5 o C bằng bể nước đá bên ngoài và kết hợp khuấy từ
- Bốc hơi dung môi: Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ nhẹ nhàng trong
3 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi hữu cơ
2.3.2 Các phương pháp đánh giá
2.3.2.1 Phương pháp định lượng dihydroartemisinin và paclitaxel a Điều kiện sắc kí
Dựa trên tài liệu tham khảo và khảo sát sơ bộ, chúng tôi đã tiến hành định lượng DHA và PTX trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện sắc ký cụ thể.
- Cột sắc kí: ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm)
- Đệm phosphat: Hòa tan 4,08 g kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric đặc Lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 μm
- Pha động: ACN và đệm phosphat pH 3,0 với tỷ lệ 57:43 (tt/tt)
- Detector DAD, bước sóng phát hiện: 210 nm
- Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 50 μl, tiêm mẫu tự động
- Nhiệt độ chạy sắc kí: 25 o C b Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng bằng HPLC
- Dung môi pha mẫu (mẫu trắng): ACN và nước cất với tỷ lệ 60:40 (tt/tt)
Để chuẩn bị mẫu chuẩn DHA, cân chính xác 10,0 mg DHA và cho vào bình định mức 100 ml Thêm 60 ml ACN, đậy kín, lắc kỹ và siêu âm trong 15 phút cho tan hoàn toàn Sau đó, bổ sung ACN đến đủ thể tích và lắc đều Từ dung dịch chuẩn gốc với nồng độ khoảng 100,0 μg/ml, pha loãng bằng dung môi thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 5, 10, 20, 50, 100 μg/ml Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm và tiến hành chạy sắc ký để xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ DHA.
Để chuẩn bị mẫu chuẩn PTX, cân chính xác 10,0 mg nguyên liệu PTX và cho vào bình định mức 100 ml Tiếp theo, thêm 60 ml ACN, đậy kín và lắc kỹ trước khi siêu âm trong khoảng 15 phút cho đến khi tan hoàn toàn Cuối cùng, bổ sung ACN đủ thể tích và lắc đều để tạo dung dịch chuẩn gốc.
Nồng độ chính xác khoảng 100,0 μg/ml được pha loãng bằng dung môi pha mẫu để tạo ra các dung dịch chuẩn với nồng độ 1, 5, 10, 20 và 50 μg/ml Các dung dịch chuẩn này sau đó được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 μm Cuối cùng, tiến hành chạy sắc ký các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ PTX.
- Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính R 2 > 0,99
- Mẫu chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa DHA nồng độ chính xác khoảng
100 μg/ml và dung dịch chuẩn chứa PTX nồng độ chính xác khoảng 50 μg/ml
- Mẫu thử: Tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano chứa DHA và PTX như mục
2.3.1 với các thành phần: Pha dầu gồm 10 mg DHA, 5 mg PTX, 15 mg PLGA và 9 mg lecithin; pha nước là dung dịch Acrysol EL135 2% trong 30 ml nước cất Hút chính xác
Cho 2 ml hỗn dịch nano vào bình định mức 10 ml, sau đó thêm khoảng 6 ml ACN và lắc kỹ, siêu âm trong 15 phút Đợi bình nguội về nhiệt độ phòng rồi bổ sung ACN đến vạch, lắc đều và làm lạnh khoảng 4 oC để lipid hóa Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,45 μm và chuẩn bị mẫu thử chỉ chứa DHA và PTX tương tự.
- Mẫu trắng tá dược: Chuẩn bị tương tự như mẫu thử trong đó pha dầu không chứa dược chất
Tiến hành chạy sắc ký cho các mẫu trắng tá dược, mẫu chuẩn và mẫu thử Ghi nhận các sắc ký đồ tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn.
• Độ tương thích hệ thống
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp chứa DHA và PTX với nồng độ lần lượt khoảng 100 μg/ml và 50 μg/ml, sau đó lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn trong điều kiện sắc kí đã chọn để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc kí thông qua các giá trị độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu (tR) và diện tích pic (S).
- Yêu cầu: %RSD của thời gian lưu và diện tích pic không vượt quá 2% c Xác định nồng độ DHA và PTX trong mẫu thử
Nồng độ của DHA và PTX trong mẫu thử được tính theo công thức:
Ct, Cc là nồng độ của dược chất trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn (μg/ml)
St, Sc là diện tích pic của dược chất trong mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu.s)
D là hệ số pha loãng của mẫu thử
2.3.2.2 Đánh giá kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích thước tiểu phân nano
- Phương pháp: Tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering – DLS)
Khi chiếu chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau, mức độ tán xạ ánh sáng sẽ thay đổi Phân tích cường độ ánh sáng tán xạ giúp đánh giá chuyển động Brown và xác định kích thước tiểu phân trung bình bằng phương trình Stokes – Einstein.
Để tiến hành pha loãng hỗn dịch nano, cần sử dụng nước cất đã qua màng lọc 0,2 μm với lượng vừa đủ để chỉ số đếm (count rates) đạt từ 200 đến 400 kcps Mẫu pha loãng sẽ được đo trên máy Zetasizer NanoZS90 với cuvet nhựa, ở điều kiện khúc xạ ánh sáng 1,3310 và nhiệt độ 25 oC Để đánh giá hệ tiểu phân nano, phân bố kích thước tiểu phân được xem xét qua chỉ số đa phân tán (PDI) Giá trị PDI từ 0,1 đến 0,25 cho thấy sự phân bố hẹp của kích thước tiểu phân, trong khi giá trị PDI lớn hơn 0,5 chỉ ra sự phân bố rộng.
Khi một điện trường được áp dụng lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ thuận với thế zeta Tốc độ di chuyển này được xác định thông qua phân tích chuyển động của tiểu phân bằng ánh sáng tán xạ Thế zeta được tính toán dựa vào độ nhớt của môi trường và áp dụng định luật Smoluchowski – Huckel.
- Tiến hành tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân trung bình với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng
2.3.2.4 Đánh giá độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano sau khi bào chế
Thí nghiệm đánh giá độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano được thực hiện bằng cách theo dõi các đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano trong các điều kiện bảo quản khác nhau.
- Tiến hành: Bào chế hỗn dịch nano cho công thức được lựa chọn như ở mục
2.3.1 Hỗn dịch nano sau khi bào chế được đựng trong ống nghiệm và bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm (24 – 26 o C) hoặc ở điều kiện ngăn mát tủ lạnh (2 – 8 o C) Tiến hành xác định kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán và thế zeta của các mẫu ngay sau bào chế và sau các khoảng thời gian: 1 tuần và 6 tuần
2.3.2.5 Đánh giá hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất nano hóa
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng
Chuẩn bị mẫu và tiến hành chạy sắc kí theo phương pháp ở mục 2.3.2.1 Kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả chạy sắc kí hai dược chất
Tên dược chất Nồng độ
R s (giữa pic DHA α và PTX)
Rs (giữa pic PTX và DHA β )
Dựa vào sắc kí đồ thu được có thể thấy:
Trên sắc ký đồ, mẫu trắng không có pic lạ trong khoảng thời gian lưu của DHA và PTX Tương tự, sắc ký đồ của mẫu chuẩn đơn DHA cũng không ghi nhận pic lạ trong khoảng thời gian lưu của PTX Đối với mẫu chuẩn đơn PTX, không xuất hiện pic lạ trong khoảng thời gian lưu của DHA.
- Trên các sắc kí đồ, thời gian lưu của dược chất ở mẫu thử tương ứng với ở mẫu chuẩn, các pic rõ nét, tách biệt rõ ràng
Như vậy, có thể kết luận phương pháp HPLC có độ đặc hiệu tốt với hai dược chất
3.1.2 Độ tương thích hệ thống
Chuẩn bị hỗn hợp DHA-PTX với nồng độ khoảng 100,0 μg/ml cho DHA và 50 μg/ml cho PTX Tiến hành định lượng theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.2.1, và kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả độ tương thích hệ thống
DHA PTX Đồng phân 𝛂 Đồng phân 𝛃
Kết quả phân tích độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) cho diện tích pic cho thấy %RSD = 1,29% đối với α-DHA, 1,61% đối với β-DHA và 0,25% đối với PTX, đều thỏa mãn yêu cầu %RSD ≤ 2% khi định lượng bằng HPLC Về thời gian lưu, %RSD lần lượt là 0,08% cho α-DHA, 0,12% cho β-DHA và 0,25% cho PTX, tất cả đều nhỏ hơn 1%, đáp ứng yêu cầu phân tích.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn với nồng độ 5, 10, 20, 50 và 100 μg/ml cho DHA và 1, 5, 10, 25, 50 μg/ml cho PTX Tiến hành sắc kí theo hướng dẫn ở mục 2.3.2.1 và ghi lại kết quả đáp ứng pic của các dung dịch chuẩn Từ đó, xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dược chất, với kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.1.
Bảng 3.3 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của DHA và PTX trong pha động
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của DHA trong pha động
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của PTX trong pha động y = 2,7821x + 1,6767 R² = 0,9999
Kết quả cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính rõ rệt giữa diện tích pic và nồng độ DHA trong khoảng từ 5,0 đến 100,0 μg/ml, cũng như giữa diện tích pic và nồng độ PTX trong khoảng từ 1,0 đến 50,0 μg/ml, với hệ số tương quan R đạt ≥ 0,995.
Phương pháp HPLC với điều kiện sắc kí được mô tả ở mục 2.3.2.1 cho thấy khả năng định lượng đồng thời DHA và PTX trong hệ tiểu phân nano chứa kết hợp hai dược chất này.
Kết quả bào chế hệ tiểu phân nano chứa đồng thời DHA và PTX với chất mang
3.2.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố quy trình Đối với việc bào chế hệ tiểu phân nano phối hợp DHA và PTX với chất mang PLGA và LEC bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương thì năng lượng và thời gian siêu âm là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến đặc tính của tiểu phân nano như kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích thước tiểu phân [7] Do đó, ảnh hưởng của 2 yếu tố này được khảo sát
3.2.1.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của năng lượng siêu âm
Năng lượng siêu âm đóng vai trò quan trọng trong việc phân tán pha dầu vào pha nước, tạo ra những giọt dầu nhỏ và đồng nhất, giúp sản xuất các tiểu phân phân tán với kích thước và chỉ số phân tán thấp trong hỗn dịch nano Quá trình bào chế hệ tiểu phân nano DHA và PTX được thực hiện với các thành phần cố định, bao gồm pha dầu chứa 10 mg DHA, 5 mg PTX, 15 mg PLGA và 9 mg LEC, cùng với pha nước là dung dịch Acrysol EL135 2,0% trong 30 ml nước cất Các điều kiện siêu âm được khảo sát với tần số 20 kHz, thời gian 5 phút và cường độ siêu âm từ 0% đến 100% công suất tối đa (130W) Kết quả đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân DHA và PTX được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.3.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính hóa lý của hệ tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD)
Mẫu Cường độ siêu âm (%) KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV)
CT6 100 113,50 ± 1,71 0,248 ± 0,003 - 33,60 ± 3,39 Trong đó, (-) có nghĩa là không đo
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC (n = 3, TB ± SD)
Khi không sử dụng năng lượng siêu âm, chỉ cần biện pháp khuấy từ đơn giản, sự tách pha giữa dầu và nước có thể dễ dàng quan sát Hệ thống tạo thành sẽ tồn tại dưới dạng hỗn dịch với các tiểu phân lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường Việc tăng cường độ siêu âm từ 20% trở lên sẽ ảnh hưởng đến quá trình này.
Khi cường độ siêu âm đạt 100%, hệ tiểu phân tạo thành có kích thước nano với kích thước trung bình (KTTP) giảm xuống còn 113,50 nm và chỉ số phân bố kích thước (PDI) thấp hơn 0,25 Hiện tượng này xảy ra do năng lượng siêu âm tỷ lệ thuận với cường độ siêu âm, dẫn đến việc tăng lực chia nhỏ các giọt dầu, giúp chúng phân tán nhanh vào pha nước Kết quả là các giọt dầu trong nhũ tương thu được có kích thước nhỏ và đồng đều, đảm bảo độ ổn định vật lý của hệ với thế zeta lớn hơn 30 mV Do đó, cường độ siêu âm 100% được chọn để khảo sát yếu tố tiếp theo.
3.2.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thời gian siêu âm là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến đặc tính vật lý của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC, bên cạnh năng lượng siêu âm Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát tác động của thời gian siêu âm với các khoảng thời gian 1,5 phút, 3 phút, 5 phút, 7 phút và 10 phút, theo quy trình bào chế hệ tiểu phân nano CT6 Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.5 và hình 3.4.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano (n
Mẫu Thời gian siêu âm (phút) KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV)
Trong đó, (-) có nghĩa là không đo
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC (n = 3, TB ± SD)
Khi thời gian siêu âm được tăng từ 1,5 phút lên 5 phút, KTTP có xu hướng giảm do tăng tổng mức năng lượng tác động trong quá trình nhũ hóa, dẫn đến việc phân cắt các tiểu phân lớn thành kích thước nhỏ hơn Tuy nhiên, khi thời gian siêu âm tiếp tục tăng từ 5 phút đến 9 phút, KTTP lại có xu hướng tăng Đồng thời, PDI của hệ thống giảm dần khi thời gian siêu âm được kéo dài từ 1,5 phút đến 9 phút, kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây.
Việc kéo dài thời gian siêu âm có thể làm tăng nguy cơ nhiễm tạp kim loại từ đầu dò vào hỗn dịch nano và tốn thời gian bào chế Hỗn dịch nano được bào chế trong 5 phút cho kích thước tiểu phân nhỏ nhất, với giá trị PDI thấp (dưới 0,25) và trị tuyệt đối thế zeta trên 30 mV, cho thấy độ ổn định cao trong môi trường phân tán Do đó, thời gian siêu âm 5 phút được chọn để khảo sát các yếu tố thuộc về công thức.
3.2.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế 3.2.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl)
Lớp lipid bao ngoài polyme không chỉ tăng cường tính tương thích sinh học mà còn đóng vai trò như một rào cản vật lý, giúp giảm thiểu sự rò rỉ thuốc khỏi hệ tiểu phân nano Ngoài ra, lớp lipid còn hoạt động như một chất hoạt động bề mặt trong quá trình nhũ hóa, ổn định hỗn dịch nano sau khi bốc hơi dung môi hữu cơ từ pha nội Việc điều chỉnh tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl) có thể tác động đến các đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano.
Việc xác định tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl) tối ưu là rất quan trọng trong việc phát triển hệ tiểu phân nano chứa DHA và PTX Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ này, hệ tiểu phân nano được bào chế theo công thức CT6 với các thành phần pha dầu bao gồm 10 mg DHA, 5 mg PTX, 15 mg PLGA cùng với các khối lượng khác nhau của lecithin.
30 ml dung dịch Acrysol EL135 2% (kl/tt) bằng phương pháp trong mục 2.3.1 Kết quả được trình bày như bảng 3.6 và hình 3.5
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl) đến đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC (n = 3, TB ± SD) Mẫu
Tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl)
KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV)
CT6 0,6:1 113,50 ± 1,71 0,248 ± 0,003 -33,60 ± 3,39 CT14 0,75:1 124,80 ± 2,26 0,269 ± 0,008 -32,15 ± 3,89 CT15 1:1 112,40 ± 3,17 0,265 ± 0,008 -30,45 ± 0,35 Trong đó, (-) có nghĩa là không đo
Tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl) có ảnh hưởng đáng kể đến các đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC, với dữ liệu được thu thập từ ba lần thử nghiệm (n = 3, TB ± SD).
Khi tăng tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl), kích thước tiểu phân nano có xu hướng giảm do lecithin hoạt động như một chất diện hoạt, giúp giảm sức căng bề mặt giữa pha dầu và pha nước Tuy nhiên, khi tỷ lệ lecithin/PLGA tăng từ 0,6:1 đến 0,75:1, kích thước tiểu phân lại tăng lên Nguyên nhân là do lượng lipid thừa có thể vượt quá nồng độ micell tới hạn (CMC) của lecithin, dẫn đến sự hình thành liposome kích thước từ 100 đến 1000 nm Sự tăng này cũng giải thích hiện tượng PDI của hệ tiểu phân nano gia tăng đáng kể khi tỷ lệ lecithin/PLGA vượt quá 0,6:1, với giá trị PDI cao hơn 0,25.
Các công thức CT6, CT14 và CT15 đều có trị tuyệt đối của thế zeta lớn hơn 30 mV, chứng tỏ rằng các hệ này sở hữu độ ổn định vật lý cao.
Công thức CT6 được chọn vì có giá trị PDI tốt (nhỏ hơn 0,25) và KTTP nhỏ nhất, đảm bảo LC của hệ Tỷ lệ lecithin/PLGA (kl/kl) được xác định là 0,6:1 cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang PLGA và tổng lượng dược chất (kl/kl) Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang và dược chất đến tính chất của hệ tiểu phân nano, tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano chứa DHA và PTX theo công thức CT6 với các thành phần pha dầu gồm 10 mg DHA, 5 mg PTX, 9 mg LEC và PLGA với các khối lượng khác nhau; pha nước là 30 ml dung dịch Acrysol EL135 2% (kl/tt) bằng phương pháp trong mục 2.3.1 Kết quả được trình bày như bảng 3.7 và hình 3.6
Đánh giá một số tính chất của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC đã lựa chọn
Hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC được bào chế theo công thức CT6, với kích thước hạt trung bình là 113,50 ± 1,71 nm, chỉ số phân tán PDI là 0,248 ± 0,003 và thế zeta đạt -33,60 ± 3,39 mV Bài viết tiếp theo sẽ đánh giá một số tính chất khác của hệ tiểu phân này.
3.3.1 Đánh giá độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano sau khi bào chế
Tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano theo công thức CT6 và đánh giá độ ổn định vật lý của hệ theo phương pháp đã nêu Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.12.
Bảng 3.12 Độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano sau khi bào chế (n = 3, TB ± SD)
Thời gian Ngay sau bào chế
115,20 ± 3,00 Xuất hiện dược chất kết tủa sau
4 tuần nên không tiến hành đo
- 23,90 ± 4,38 - - 30,90 ± 0,85 Trong đó, (-) có nghĩa là không đo
Nhận xét: Hệ tiểu phân nano ổn định trong thời gian 6 tuần ở điều kiện bảo quản từ 2 đến 8 o C và trong thời gian 1 tuần ở điều kiện bảo quản từ 24 đến 26 o C
3.3.2 Đánh giá hiệu suất nano hóa (EE) và tỷ lệ dược chất nano hóa (LC) Để xác định EE và LC của hệ tiểu phân nano được bào chế theo công thức CT6, tiến hành như phương pháp ghi ở mục 2.3.2.5 Kết quả được trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3.13 Kết quả đánh giá hiệu suất nano hóa (EE) và tỷ lệ dược chất nano hóa
Lượng dược chất toàn phần (mg)
Lượng dược chất tự do (mg)
3.3.3 Đánh giá khả năng giải phóng thuốc in vitro từ hệ tiểu phân nano đã lựa chọn
Bài viết tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano dựa trên công thức CT6 và đánh giá khả năng giải phóng thuốc in vitro theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.2.6 Kết quả nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng 3.14 và các hình 3.10, 3.11, 3.12.
Bảng 3.14 Phần trăm giải phóng của DHA và PTX từ hệ tiểu phân nano theo thời gian trong hai môi trường đệm pH 5,0 và pH 7,4 (n = 3, TB ± SD)
Môi trường pH 5,0 Môi trường pH 7,4
%gp PTX %gp DHA %gp PTX %gp DHA
Hình 3.10 Đồ thị giải phóng DHA từ hệ tiểu phân nano theo thời gian ở hai môi trường đệm pH 5,0 và pH 7,4 (n = 3, TB ± SD)
Hình 3.11 Đồ thị giải phóng PTX từ hệ tiểu phân nano theo thời gian ở hai môi trường đệm pH 5,0 và pH 7,4 (n = 3, TB ± SD)
%gp DHA (pH 5,0) %gp DHA (pH 7,4)
%gp PTX (pH 5,0) %gp PTX (pH 7,4)
Hình 3.12 Đồ thị giải phóng DHA và PTX từ hệ tiểu phân nano theo thời gian ở hai môi trường đệm pH 5,0 và pH 7,4 (n = 3, TB ± SD) Nhận xét:
Trong môi trường pH 5,0, gần giống với pH của khối u, hệ tiểu phân nano có khả năng giải phóng đồng thời hai loại dược chất Điều này cho phép hệ tiểu phân nano phát huy tác dụng hiệu quả trong việc tiêu diệt tế bào khối u.
Quá trình giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC diễn ra qua hai giai đoạn Trong giai đoạn đầu, thuốc được giải phóng mạnh mẽ trong 12 giờ đầu, với tỷ lệ giải phóng DHA đạt 78,06 ± 18,89% ở pH 5,0 và 73,14 ± 23,41% ở pH 7,4 Tương ứng, tỷ lệ giải phóng PTX lần lượt là 40,54 ± 6,67% và 30,28 ± 5,80% Giai đoạn sau, dược chất được giải phóng kéo dài, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hệ tiểu phân nano sử dụng PLGA.
Sự tồn tại của dược chất hấp phụ trên bề mặt tiểu phân nano có thể là nguyên nhân dẫn đến việc giải phóng ban đầu nhanh hơn so với dược chất được bao gói trong cốt polyme.
Lượng DHA và PTX giải phóng từ hệ tiểu phân nano trong môi trường đệm pH 5,0 cao hơn so với pH 7,4, điều này liên quan đến tính chất phân hủy của PLGA trong các môi trường pH khác nhau Sự ăn mòn toàn bộ (bulk erosion) là phương thức phân hủy chính của PLGA, xảy ra qua quá trình cắt ngẫu nhiên liên kết este của khung polyme phân bố đồng nhất.
%gp PTX (pH 5,0) %gp DHA (pH 5,0)
%gp PTX (pH 7,4) %gp DHA (pH 7,4)
Sự ăn mòn của các tiểu phân diễn ra nhanh hơn trong môi trường acid do pH thấp xúc tác cho quá trình chia cắt các cầu nối este của khung polyme, dẫn đến việc giải phóng thuốc nhanh hơn Nghiên cứu của Varghese và cộng sự (2016) cho thấy Lecithmer ®, một loại nano lai lipid-polyme sử dụng PLGA và lecithin đậu nành, có khả năng giải phóng daunorubicin (DNR) và lornoxicam (LNX) cao hơn ở pH 5,5 so với pH 7,4 Điều này cho thấy lợi ích trong việc giải phóng thuốc có chọn lọc tại môi trường acid của khối u.
3.3.4 Kết quả đánh giá hình thái cấu trúc hệ tiểu phân nano đã bào chế được bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC đã được bào chế theo công thức CT6 và được đánh giá hình thái cấu trúc thông qua phương pháp ghi chép Kết quả đánh giá được trình bày trong hình 3.13 và hình 3.14.
Hình 3.13 Hình ảnh chụp SEM của hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC ở tỷ lệ 2,00 àm
Hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC ở tỷ lệ 1,00 được quan sát qua hình ảnh chụp SEM cho thấy chúng có hình dạng tròn và kích thước tương ứng với kết quả đo từ máy Nanosizer, với kích thước nhỏ hơn 200 nm.
3.3.5 Kết quả đo phổ hồng ngoại FT-IR Để đánh giá tương tác hóa học của các thành phần trong bột đông khô chứa tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC, tiến hành quét phổ FT-IR các mẫu nguyên liệu DHA, PTX, LEC, PLGA, MAN, hỗn hợp vật lý (PM), nano sau khi đông khô (NPs) theo mục 2.3.2.8 Kết quả được thể hiện ở hình 3.15
Hình 3.15 Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (DHA, PTX, LEC, PLGA, manitol
(MAN)), hỗn hợp vật lý (PM) và nano sau khi đông khô (NPs)
- Phổ hồng ngoại của hỗn hợp vật lý DHA, PTX, LEC, PLGA, MAN xuất hiện đầy đủ các pic đặc trưng của các nguyên liệu
So sánh phổ hồng ngoại của mẫu nano sau khi đông khô với phổ hồng ngoại của các nguyên liệu DHA, PTX, LEC, PLGA và manitol (MAN) cho thấy kết quả được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15 So sánh phổ hồng ngoại của mẫu nano sau đông khô với phổ hồng ngoại của các nguyên liệu DHA, PTX, LEC, PLGA, MAN
Các pic trên phổ IR của các mẫu nguyên liệu (cm -1 )
Các pic tương ứng trên phổ
IR của nano sau đông khô
Sự thiếu hụt pic 825 cm -1 trên phổ hồng ngoại của mẫu nano đông khô có thể là do pic này bị che lấp bởi các đỉnh hấp thụ từ PLGA và MAN.
- Từ các kết quả trên, có thể kết luận:
+ Không có tương tác hóa học giữa các thành phần trong bột đông khô chứa tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC
+ Sự có mặt của LEC và dược chất trong mẫu nano bào chế được
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu và tiến hành thực nghiệm, khóa luận đã đạt được một số kết quả sau:
1 Đã xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC Đã xây dựng được công thức tốt nhất thông qua quá trình khảo sát một số yếu tố thuộc về quy trình và công thức bào chế
Công thức cụ thể như sau:
- Dung môi pha dầu: 5 ml dicloromethan
Acrysol EL135 với nồng độ 2% trong 30 ml nước
Thông số quá trình: Cường độ siêu âm đạt 100% của công suất 130W với tần số
20 kHz ở nhiệt độ 0 – 4 o C trong thời gian siêu âm 5 phút Thời gian bốc hơi dung môi là 3 giờ ở nhiệt độ phòng
2 Đánh giá được một số đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano bào chế được
- Tiểu phân nano DHA-PTX/PLGA-LEC được bào chế theo công thức tốt nhất như trên (n = 3) có:
+ KTTP là 113,50 ± 1,71 nm, chỉ số đa phân tán PDI là 0,248 ± 0,003, thế zeta đo được là -33,60 ± 3,39 mV
+ Hiệu suất nano hóa (EE) với DHA là 66,41 ± 0,53%, với PTX là 98,73 ± 0,89% Tỷ lệ dược chất nano hóa (LC) với DHA là 18,17 ± 0,32%, với PTX là 12,62 ± 0,59%
+ Khả năng giải phóng dược chất sau 24 giờ ở môi trường đệm pH 5,0 đối với DHA là 81,81%, PTX là 54,34%; tại pH 7,4 đối với DHA là 74,60%, PTX là 39,12%
+ Độ ổn định trong các điều kiện bảo quản ở nhiệt độ 24 – 26 o C và 2 – 8 o C lần lượt là 1 tuần và 6 tuần
- Hình ảnh chụp SEM cho thấy hệ nano có hình cầu, kích thước nhỏ dưới 200 nm
