TỔNG QUAN
Thông tin về dược chất
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của PTX
Công thức phân tử: C47H51NO14
Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [12]
Tên khoa học: 5b,20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2a,4,10b,13a-tetrayl 4,10-diacetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropanoat]
Bột có màu trắng hoặc gần như trắng, tồn tại dưới dạng tinh thể Độ tan của bột này rất thấp, thực tế không tan trong nước (độ tan trong nước < 0,7 μg/ml) và chỉ tan một chút trong octanol, propylen glycol và butanol Tuy nhiên, nó dễ dàng tan trong các dung môi như cremophor EL, methanol, ethanol, cloroform, aceton và dimethyl acetamid.
Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực từ -49,0º đến -55,0º ở dạng khan [12] Đặc điểm dược động học
Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh mạch và giảm theo mô hình 2 pha Thuốc có khả năng phân bố rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, với sự ảnh hưởng của liều lượng và thời gian truyền Tỷ lệ gắn kết với protein dao động từ 89% đến 98% Trong giai đoạn ổn định, thể tích phân bố thuốc đạt khoảng 5-6 lít/kg trọng lượng cơ thể.
Trong nghiên cứu, lượng thuốc truyền từ 1 đến 6 giờ đạt 67,1 lít/m², trong khi lượng thuốc của người tiêm truyền trong 24 giờ dao động từ 227 đến 688 lít/m², cho thấy thuốc có khả năng khuếch tán ra ngoài mạch và gắn kết với các thành phần mô Thời gian bán thải của thuốc trong huyết thanh là từ 6 đến 13 giờ, cụ thể là 6,4 giờ nếu tiêm truyền trong 1-6 giờ, và từ 15,7 đến 52 giờ nếu tiêm truyền từ 24 giờ trở lên Sau khi truyền tĩnh mạch, khoảng 2-13% thuốc được thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, cho thấy ngoài thận, còn có các đường đào thải khác, với khoảng 70% thải qua phân, trong đó 5% là dạng chưa chuyển hóa Thuốc PTX được chuyển hóa tại gan qua cytochrom P450, isoenzym CYP2C8 và CYP3A4, tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là 6α-hydroxypaclitaxel, với độ thanh thải dao động từ 0,3-0,8 lít/giờ/kg (tương đương 6,0-15,6 lít/giờ/m²).
PTX tăng cường quá trình trùng hợp dime tubulin, dẫn đến sự hình thành và ổn định các ống vi thể bằng cách ức chế quá trình giải trùng hợp Điều này ngăn chặn sự tái cấu trúc bình thường của mạng ống vi thể, một yếu tố quan trọng trong quá trình phân bào giảm nhiễm và hoạt động của ty lạp thể Đồng thời, PTX gây ra các cấu trúc bất thường trong các ống vi thể trong quá trình phân bào, làm phá vỡ các nhiễm sắc thể Ngoài ra, PTX còn ức chế sự tăng sinh tế bào, điều hòa đáp ứng miễn dịch và ngăn chặn hình thành các cấu trúc bất thường trong vi quản trong quá trình phân bào.
Điều trị ung thư buồng trứng di căn được chỉ định khi các phương pháp điều trị thông thường như anthracyclin và platin không hiệu quả hoặc bị chống chỉ định.
PTX kết hợp với doxorubicin là phác đồ điều trị bổ trợ hàng đầu cho ung thư vú di căn, đặc biệt khi liệu pháp thông thường với anthracyclin thất bại hoặc ung thư vú tái phát trong vòng 6 tháng sau điều trị Phương pháp này cũng được áp dụng trong điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư Kaposi liên quan đến AIDS.
- Định tính: Đo góc quay cực, đo phổ hồng ngoại IR, sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Định lượng: Phương pháp HPLC với detector UV tại bước sóng 227 nm [12]
Hình 1.2.Công thức cấu tạo của DHA
Tên khoa học: (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl-3,12- epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol [13]
Khối lượng phân tử: 284,35 g/mol [13]
DHA là một tinh thể hình kim, màu trắng, có vị đắng và không mùi Chất này rất ít tan trong nước và dầu, nhưng tan tốt trong ethanol 96% cũng như các dung môi như ether và cloroform Về độ ổn định, DHA kém bền về mặt hóa học và dễ bị phân hủy khi có sự hiện diện của sắt kim loại hoặc chất khử sinh học trong máu Tại nhiệt độ 37ºC, DHA ổn định trong khoảng pH từ 2-6; pH càng acid hoặc kiềm thì DHA càng dễ bị phân hủy Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy độ ổn định của DHA trong huyết tương kém hơn so với dung dịch đệm pH 7,4, với thời gian bán thải của DHA trong huyết tương là 2,3 giờ, trong khi trong đệm pH 7,4 là 5,5 giờ.
Năng suất quay cực của DHA nằm trong khoảng 140-146º, với hệ số C = 1,0026 trong cloroform C12 là một cacbon bất đối, tạo ra hai đồng phân quang học α và β Nghiên cứu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X cho thấy DHA chủ yếu tồn tại dưới dạng α, tuy nhiên, trong dung dịch, cả hai dạng α và β đều có mặt.
Nhiệt độ nóng chảy: 145-150ºC [18]
5 Đặc điểm dược động học
Nghiên cứu trên động vật cho thấy DHA hấp thu tốt qua đường uống với tỷ lệ liên kết protein huyết tương đạt 50% Liều 20 mg/kg cho thời gian bán thải 2,1 giờ và hoàn toàn được thải trừ sau 3,04 giờ, phân bố đều ở các cơ quan, đặc biệt là gan và tim DHA chủ yếu được thải trừ qua nước tiểu (82,7%) và một phần qua phân, không làm tăng độc tính khi sử dụng đồng thời với các thuốc khác Nghiên cứu trên người cho thấy DHA hấp thu hiệu quả với liều 1,1 mg/kg và 2,2 mg/kg, nồng độ huyết tương cao nhất đạt sau 1,33 giờ, thời gian bán thải từ 1,57-1,63 giờ Tuy nhiên, DHA ít được bài tiết qua nước tiểu, với chỉ 0,10%-0,15% liều dùng trong 7 giờ, cho thấy sinh khả dụng thấp do khả năng hòa tan kém và sự phân hủy bởi dịch dạ dày ruột.
DHA được biết đến là một chất diệt ký sinh trùng sốt rét hiệu quả, đặc biệt là đối với P falciparum Ngoài ra, DHA còn có tác dụng chống khối u thông qua hai cơ chế: tạo ra các gốc tự do từ việc phân cắt cầu andoperoxid yếu và phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid với nước, dẫn đến hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl Tác dụng dược lý của DHA phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể, với các gốc tự do sản xuất quá mức có khả năng oxy hóa lipid, gây tổn thương tế bào và dẫn đến tự chết của tế bào ung thư Trong môi trường khối u với pH thấp và nồng độ ion sắt cao, DHA chỉ sản xuất gốc tự do tại vị trí khối u, do đó có độc tính rất thấp và ít ảnh hưởng đến mô bình thường Độc tính của DHA, với LD50 khi dùng đường uống là 834,5 mg/kg đối với chuột thí nghiệm, cho thấy tính an toàn tương đối của nó.
Nghiên cứu về độc tính trường diễn cho thấy khi chuột được cho uống liên tục với liều 20 mg/kg và 60 mg/kg mỗi ngày, sức khỏe của chúng vẫn bình thường Tuy nhiên, khi liều lượng tăng lên đến 180 mg/kg, gấp 100 lần liều điều trị, có thể dẫn đến những tác động tiêu cực.
Nghiên cứu cho thấy rằng chuột mang thai có dấu hiệu giảm sút khối lượng và kém ăn, trong khi các thử nghiệm về bệnh lý, huyết học và máu ngoại vi đều cho kết quả bình thường Đặc biệt, DHA có thể gây độc tính cho bào thai chuột ở giai đoạn đầu và cuối của thai kỳ Mặc dù không thể rút ra kết luận tương tự cho con người, nhưng vẫn cần thận trọng khi sử dụng DHA cho phụ nữ mang thai Việc định lượng DHA cũng cần được xem xét kỹ lưỡng.
Theo Dược điển Trung Quốc 2015, DHA nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp HPLC với detector UV tại bước sóng 210 nm [13]
Viên nén chứa DHA được quy định bởi Dược điển Trung Quốc 2015 với định lượng thông qua phương pháp đo UV tại bước sóng 238 nm Mẫu trắng sử dụng là dung dịch hỗn hợp natri hydroxid 2% và ethanol theo tỷ lệ 4:1, và hàm lượng DHA được tính toán bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn có cùng nồng độ.
Một số thử nghiệm in vitro, in vivo của DHA khi kết hợp với các thuốc điều trị ung thư
Artemisinin là thuốc chủ lực trong điều trị sốt rét và cũng cho thấy khả năng chống ung thư DHA, một dẫn chất quan trọng và là chất chuyển hóa chính của artemisinin trong cơ thể, đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra có vai trò quan trọng trong điều trị ung thư.
Nghiên cứu của Zhou Hui-Jun và cộng sự (2009) cho thấy DHA có khả năng chống lại sự phát triển của tế bào ung thư phổi Lewis (LLC) in vitro, với IC50 đạt 53,14 μmol/l DHA không chỉ gây độc cho tế bào LLC mà còn làm giảm biểu hiện của thụ thể VEGF KDR/flk-1 Khi thử nghiệm trên chuột, sự kết hợp giữa DHA và cyclophosphamid cho thấy hiệu quả điều trị tốt hơn so với việc sử dụng riêng lẻ từng loại thuốc, đồng thời hoàn toàn ức chế di căn phổi tự phát Các tác giả kết luận rằng DHA là một dược chất tiềm năng trong điều trị ung thư biểu mô phổi, và sự phối hợp DHA với các thuốc chống ung thư khác có thể giảm tác dụng phụ, giảm chi phí và nâng cao hiệu quả điều trị.
Thông tin về EC
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của EC
Ethylcellulose là một ethyl ether của cellulose, được tạo bởi các đơn vị b- anhydroglucose liên kết với nhau bằng liên kết acetal [31]
Bột EC có màu trắng hoặc gần như trắng, không có vị EC không tan trong nước, glycerol và propan-1,2-diol, nhưng có khả năng tan trong nhiều dung môi hữu cơ, tùy thuộc vào tỷ lệ nhóm ethoxy trong polymer Các mẫu EC chứa ít hơn 46,5% nhóm ethoxyl dễ tan trong cloroform, methyl acetat, tetrahydrofuran và hỗn hợp hydrocarbon thơm với ethanol (95%) Ngược lại, EC chứa hơn 46,5% nhóm ethoxy tan tốt trong chloroform, ethanol (95%), ethyl acetat, methanol và toluen.
Khối lượng riêng: 1,12-1,15 g/cm 3 [31]
Nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh: 129-133º [31]
Nhiệt độ nóng chảy: 165-173ºC [31] Độ ổn định: Bền với nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, acid và kiềm [31]
Trên thị trường hiện có nhiều loại EC khác nhau, được phân loại dựa trên độ dài của chuỗi polyme Độ nhớt của EC thường được đo ở nhiệt độ 25ºC với nồng độ 5% (kl/tt).
EC hòa tan trong hỗn hợp dung môi 80% toluen và 20% ethanol (kl/kl) có giá trị độ nhớt từ 7,0-100,0 mPa.s, với độ nhớt tăng lên khi chuỗi polyme của EC dài hơn Các loại EC khác nhau hoặc hỗn hợp của chúng có thể được sử dụng để tạo ra dung dịch với độ nhớt mong muốn Việc sử dụng EC làm chất mang trong hệ nano có nhiều ưu điểm đáng chú ý.
- EC không ion hóa, không tan trong nước, thích hợp mang các dược chất kém tan
EC ổn định trong khoảng pH từ 3-11, cho phép kết hợp với nhiều loại dược chất và tá dược có tính acid hoặc base EC được chứng minh là phù hợp cho việc bao gói và giải phóng có kiểm soát dược chất Nghiên cứu của Ubrich N cho thấy rằng trong bào chế tiểu phân nano chứa propranolol hydrochlorid, EC có khả năng kiểm soát giải phóng thuốc lâu hơn so với một số polyme khác như PLGA và polycaprolacton.
EC là một loại polymer sinh học an toàn, không độc hại và không gây dị ứng Nó đã được công nhận là tá dược an toàn và được FDA chấp thuận cho các chế phẩm sử dụng đường uống, qua da và niêm mạc với liều tối đa hàng ngày lần lượt là 308 mg, 80 mg và 50 mg.
- EC là tá dược rẻ tiền, không gây ô nhiễm môi trường
EC là một loại polyme không phân hủy sinh học, do đó không được khuyến cáo sử dụng cho các sản phẩm tiêm Việc sử dụng polyme này qua đường tiêm có thể gây hại cho thận.
Thông tin về nano polyme
Nano polyme là hệ mang thuốc sử dụng polyme làm giá mang dược chất, với cấu trúc dạng siêu vi nang hoặc siêu vi cầu Siêu vi nang có cấu trúc nhân vỏ, trong khi siêu vi cầu có cấu trúc dạng cốt, trong đó dược chất được phân tán đều Việc phân biệt giữa siêu vi nang và siêu vi cầu là khá khó khăn Trong cấu trúc này, dược chất có thể hòa tan hoặc phân tán dưới dạng phân tử hoặc tinh thể nano trong polyme, và cũng có thể liên kết cộng hóa trị với polyme Các polyme được sử dụng trong bào chế nano polyme bao gồm polyme tự nhiên, bán tổng hợp và tổng hợp, với ưu tiên cho các polyme phân hủy sinh học, tương thích với cơ thể sống.
Hình 1.4 Hình ảnh siêu vi nang và siêu vi cầu Phương pháp bào chế
Nhũ hóa - bốc hơi dung môi
Nhũ tương là phương pháp tạo nano hiệu quả, trong đó dược chất và polymer được hòa tan vào pha dầu Sau đó, hỗn hợp pha dầu này được nhỏ giọt vào pha nước có chứa chất diện hoạt, giúp hình thành các hạt nano.
Có 10 phương pháp đồng nhất hóa hay siêu âm có thể được áp dụng để giảm kích thước của tiểu phân xuống cấp độ nano Sau đó, quá trình bốc hơi dung môi hữu cơ sẽ giúp thu được hỗn dịch nano Nhũ tương kép N/D/N thường được sử dụng để bao gói các dược chất tan trong nước như peptid, protein hay vaccine, trong khi nhũ tương đơn D/N lại phù hợp với các dược chất không tan trong nước như steroid.
Trong phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi, các đặc tính của tiểu phân nano như kích thước tiểu phân (KTTP), chỉ số phân tán (PDI) và thế zeta bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Những yếu tố này bao gồm tỷ lệ giữa polyme và dược chất, loại và lượng chất diện hoạt, cũng như các thông số quy trình như thời gian và cường độ của quá trình đồng nhất hóa, siêu âm, và tốc độ bốc hơi dung môi.
Nhũ hóa và khuếch tán dung môi là phương pháp tạo nano sử dụng ba pha: pha dầu, pha nước và pha pha loãng Đối với dược chất thân dầu, pha dầu bao gồm polymer, dược chất và dung môi hữu cơ được nhũ hóa vào dung dịch pha nước chứa chất ổn định đã bão hòa trước đó bằng dung môi hữu cơ Nhũ tương được phối hợp với thể tích nước lớn hơn và khuấy nhẹ, giúp dung môi khuếch tán từ giọt pha dầu vào môi trường, hình thành các nano polymer Các dung môi pha dầu được lựa chọn cần có khả năng tan một phần trong nước, chẳng hạn như alcol benzylic và ethyl acetat.
Kích thước của tiểu phân trong phương pháp nhũ hóa phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm lực cắt trong quá trình nhũ hóa, thành phần hóa học của pha dầu, nồng độ polyme, tỷ lệ pha dầu và kích thước của giọt dầu trong nhũ tương chính.
Kỹ thuật phun điện trường “electrospraying” là phương pháp phun dưới dạng giọt mịn đối với một chất lỏng bằng cách tác động lực điện trường
Thiết bị phun điện trường “electrospraying” bao gồm đầu súng phun mao quản kết nối với nguồn điện cao thế và điện cực tròn nối đất Khi có điện trường mạnh mẽ tạo ra ngoài đầu súng phun, pha lỏng được phun ra dưới dạng mặt khum sẽ kéo dài và phân tán thành các giọt nhỏ nhờ lực điện trường Trong quá trình giọt nhỏ di chuyển từ súng đến bộ phận thu mẫu, dung môi bay hơi, tạo thành các nano polymer rắn.
Quá trình polyme hóa xảy ra khi một monome được polyme hóa trong sự hiện diện của một chất ổn định thích hợp Dung môi được chọn phải có khả năng hòa tan cả monome và polyme dùng làm chất ổn định, nhưng không hòa tan polyme tạo thành Do đó, polyme hóa thực chất là quá trình kết tủa polyme hình thành từ sự kết hợp của dung dịch đồng nhất chứa các monome, chất khởi đầu và chất gây phân tán.
Kết tủa do thay đổi dung môi
Phương pháp kết tụ được thực hiện thông qua ba thành phần chính: polyme, dung môi hòa tan polyme và dung môi không hòa tan polyme Dung môi hòa tan thường là dung môi hữu cơ có khả năng trộn lẫn với nước và dễ dàng loại bỏ qua bốc hơi, ví dụ như aceton hoặc hỗn hợp aceton và ethanol.
Ngoài ra, còn nhiều phương pháp khác có thể được áp dụng để bào chế nano polymer, bao gồm phương pháp tạo gel ion, tạo liên kết chéo, phun mù, sử dụng dung môi siêu tới hạn, phun sấy, polymer hóa, muối hóa, và thay đổi dung môi.
Một số nghiên cứu liên quan
Một số nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA
Nghiên cứu của tác giả Lê Thiện Giáp (2020) đã tiến hành khảo sát và bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp PTX, DHA và PEG Nội dung nghiên cứu bao gồm tổng hợp phức hợp PTX, DHA và PEG, xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano, đánh giá các đặc tính lý hóa và độc tính tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư HT-29 Kết quả cho thấy tiểu phân nano có kích thước khoảng 110 nm, PDI 0,337, với DHA có hiệu suất entrapment (EE) là 76,68% và nồng độ chứa (LC) là 16,36%, trong khi PTX có EE là 98,80% và LC là 9,94% Thử nghiệm giải phóng in vitro cho thấy hệ tiểu phân nano có khả năng giải phóng dược chất tương tự nhau ở cả hai môi trường đệm phosphat pH 5,0 và pH 7,4, với khoảng 30% dược chất được giải phóng trong 4 giờ đầu và 80% sau 24 giờ Nghiên cứu cũng xác định chỉ số kết hợp giữa DHA và PTX ở các tỷ lệ khác nhau, với tất cả chỉ số kết hợp đều nhỏ hơn 1, cho thấy sự tương tác giữa hai thuốc.
Nghiên cứu cho thấy rằng hệ nano có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư hiệu quả hơn so với việc sử dụng PTX và DHA tự do trong các thí nghiệm in vitro.
Năm 2018, tại trường Đại học Dược Hà Nội, tác giả Trịnh Thị Hằng và Vũ Thị Kim Phượng đã nghiên cứu tiểu phân nano chứa đồng thời PTX và DHA, sử dụng phương pháp đồng nhất hóa nóng để bào chế hệ nano lipid Nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp HPLC với cột C18 để định lượng đồng thời PTX và DHA, với các điều kiện sắc ký như tỷ lệ ACN: đệm phosphat pH 3,0 là 58:42, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 50 μl và bước sóng phát hiện 210 nm Hệ nano bào chế có kích thước tiểu phân nhỏ hơn 160 nm và chỉ số PDI dưới 0,4, tuy nhiên, điểm yếu của các hệ tiểu phân này là cần sử dụng lượng chất mang lớn, dẫn đến chỉ số LC rất thấp, dưới 3%.
Năm 2009, Danhier Fabienne và cộng sự đã nghiên cứu bào chế nano paclitaxel sử dụng PLGA-PEG làm chất mang, với quy trình bao gồm việc hòa tan các thành phần trong aceton và lọc để loại bỏ dược chất tự do Kết quả cho thấy tiểu phân nano có kích thước 116 nm và PDI 0,18 Thử nghiệm giải phóng in vitro cho thấy thuốc giải phóng nhanh trong 4 giờ đầu (46,9% ± 5,7%) và đạt 75,3% ± 2,7% sau 11 ngày Thử độc tính trên dòng tế bào HeLa cho thấy, ở nồng độ 25 μg/ml Taxol, khả năng sống của tế bào giảm xuống dưới 8% sau 24 giờ, với IC50 là 15,5 μg/ml Khi PTX được bao gói trong tiểu phân nano, nồng độ 25 μg/ml và 12,5 μg/ml hoàn toàn ức chế khả năng sống của tế bào, giảm 40% khả năng sống ở nồng độ thấp hơn (2,5 đến 0,025 μg/ml) IC50 cho tế bào HeLa giảm từ 15,5 μg/ml đối với Taxol xuống 5,518 μg/ml đối với các tiểu phân nano sau 24 giờ ủ.
Năm 2018, Tao Jin và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo tiểu phân nano chứa docetaxel và DHA, đồng thời đánh giá tác dụng chống di căn của chúng trong các tế bào 4T1 của ung thư vú di căn Các dẫn chất của PEG và docetaxel được tổng hợp với độ nhạy cảm pH 4, tạo thành chất mang bao gói hiệu quả.
DHA là một loại tiểu phân nano có kích thước 142,5 nm và chỉ số PDI 0,102, với tỷ lệ LC 7,5% ± 0,5% và EE 90,1 ± 4,8% Các hạt nano này nhạy cảm với pH, cho phép giải phóng thuốc trong môi trường acid của khối u, đồng thời thể hiện độc tính tế bào tốt với IC50 đạt 7,0 μg/mL Chúng có khả năng ức chế chu trình tế bào và ngăn chặn sự di chuyển cũng như xâm lấn của tế bào ung thư Cơ chế tác dụng chống di căn của các hệ nano liên quan đến việc điều hòa giảm biểu hiện của p-AKT, NF-B và MMP.
Một số nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano với chất mang EC
EC, một dẫn xuất cellulose bán tổng hợp không tan trong nước, nổi bật với khả năng mang thuốc hiệu quả và tính tương thích sinh học cao Do đó, EC đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu với vai trò là chất mang trong hệ tiểu phân nano.
Kumar K S và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano EC chứa cisplatin nhằm giảm độc tính và nâng cao hiệu quả điều trị Tiểu phân nano được chế tạo bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi, sau đó được gắn vàng và oxyd sắt để kiểm soát quá trình giải phóng Kết quả cho thấy các tiểu phân nano có hình cầu với kích thước từ 100-300 nm Thử nghiệm giải phóng in vitro cho thấy trong môi trường acid HCl 0,1M, thuốc giải phóng nhanh hơn so với trong môi trường đệm phosphate pH 7,4 Tốc độ giải phóng dược chất của tiểu phân nano gắn vàng chậm hơn so với tiểu phân nano gắn oxyd sắt, cho thấy tiểu phân nano gắn vàng có khả năng kiểm soát giải phóng tốt hơn, với khả năng giải phóng dược chất đạt 93% trong HCl 0,1 M và 98% trong PBS.
- đệm phosphat salin), nano EC/cisplatin-Fe3O4 là 60% trong 0,1 M HCl và 75% PBS, nano EC/Cis-Au là 46% trong 0,1 M HCl và 69% trong PBS) [21]
Amolkumar B Lokhande và cộng sự (2013) đã phát triển tiểu phân nano repaglinid với chất mang EC nhằm cải thiện sinh khả dụng và thời gian bán thải của thuốc điều trị tiểu đường này Repaglinid thường gây ra các tác dụng phụ như đau đầu, đau cơ xương và ảnh hưởng đến tiêu hóa khi sử dụng đường uống thường xuyên Để khắc phục những nhược điểm này, các tác giả đã bào chế tiểu phân nano EC bao gói dược chất, sử dụng phương pháp khuếch tán dung môi kết hợp với đồng nhất hóa ở áp suất cao Kết quả cho thấy hệ tiểu phân nano có kích thước 90,48 nm, 148,4 nm và 240,7 nm, tăng theo nồng độ polymer, với hiệu suất entrapment (EE) đạt 97,66 ± 0,88% ở công thức có tỷ lệ DC/polyme cao hơn (1/2) Nghiên cứu in vitro cho thấy thuốc được cải thiện đáng kể trong khả năng phát huy tác dụng.
Trong nghiên cứu về giải phóng thuốc, có hai cơ chế chính là khuếch tán và ăn mòn Ở pH 7,4, trong 1 giờ đầu, lượng thuốc được giải phóng chỉ đạt khoảng 2-5% Sau 12 giờ, tỷ lệ này tăng lên khoảng 11-18% [36].
Tác giả Nguyễn Ngọc Chiến (2020) đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano fenofibrat bao EC bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi tại Việt Nam Hệ nano này được rắn hóa bằng cách hấp phụ lên các chất mang, với tiểu phân nano có kích thước trung bình 100 nm, chỉ số phân tán PDI thấp (khoảng 0,22-0,24), thế zeta khoảng -10 mV, hiệu suất entrapment (EE) đạt 97,0% và nồng độ chất mang (LC) 30,0% Sau khi rắn hóa, bột thu được có hàm lượng fenofibrat trung bình khoảng 22-25%, và độ hòa tan trong môi trường natri lauryl sulfat 0,72% đạt trên 80% sau 30 phút.
Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu ứng dụng EC như chất mang trong hệ nano vẫn còn hạn chế Mục tiêu chính của nghiên cứu này là bào chế các tiểu phân nano polymer EC chứa PTX và DHA, đồng thời đánh giá một số đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano được bào chế.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Dihydroartemisinin Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương
4 Ethylcellulose Colorcon (Trung Quốc) NSX
5 Lecithin Kanto Chemical (Nhật Bản) NSX
6 Tween 80 Guangdong Guanghua Sci-Tech
Co., Ltd (Trung Quốc) NSX
8 PEG 400 Sino-Japan Chemical NSX
10 Dicloromethan Guangdong Guanghua Sci-Tech
Co., Ltd (Trung Quốc) NSX
11 Natri clorid Dominion Salt (New Zealend) NSX
12 Dinatri hydrophosphat Guangdong Guanghua Sci-Tech
Co., Ltd (Trung Quốc) NSX
13 Kali dihydrophosphat Xylong Scientific Co., Ltd
14 Nước tinh khiết Việt Nam
HPLC Fisher – Mỹ Dùng cho HPLC
HPLC Fisher – Mỹ Dùng cho HPLC
17 Kali dihydrophosphat Merck (Đức) Dùng cho HPLC
18 Acid phosphoric đặc Merck (Đức) Dùng cho HPLC
Thiết bị và dụng cụ
- Máy siêu âm đầu dò Vibra Cell, Sonics & Materials, INC, công suất tối đa 130
- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer NanoZS90 (Anh)
- Máy khuấy từ Ika Labortechnik (Đức)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 (Mỹ)
- Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik GmbH-Z326k (Đức)
- Máy lắc KS125 Basic IKA Labortechnik (Anh)
- Máy đo thế zeta và phân bố KTTP Horiba SZ-100V2 (Nhật Bản)
- Máy đo phổ hồng ngoại FT/IR 6700 JASCO (Nhật Bản)
- Máy TEM-JEM1010-JEOL (Mỹ)
- Màng thẩm tích Membrance Cel kích thước 14000 Da (Mỹ)
- Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10000 Da, Millipore, Billerica, MA (Mỹ)
- Máy đo pH Eutech instrument pH 510 (Singapo)
- Tủ lạnh sâu Esco Lexicon® II ULT Freezer (Singapo)
- Máy đông khô FDU-2110 EYELA-ETC (Nhật Bản)
- Bể siêu âm WUC-A06H, Daihan (Hàn Quốc)
- Cân kỹ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thủy tinh khác.
Nội dung nghiên cứu
Xây dựng công thức và xác định một số thông số quy trình bào chế tiểu phân nano chứa PTX và DHA với chất mang EC
Các yếu tố thuộc về quy trình khảo sát gồm có: Công suất siêu âm, thời gian siêu âm
Các yếu tố quan trọng trong thành phần công thức khảo sát bao gồm tỷ lệ EC so với dược chất, tỷ lệ lecithin, loại chất diện hoạt pha ngoài, tỷ lệ chất diện hoạt pha ngoài và tỷ lệ pha nước Việc lựa chọn các thành phần công thức và quy trình phù hợp nhất dựa trên các chỉ tiêu về KTTP, PDI, EE cùng với sự thuận lợi trong quá trình bào chế.
17 Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano bào chế được
- Kích thước tiểu phân trung bình, chỉ số đa phân tán, thế zeta
- Hiệu suất nano hóa, tỷ lệ dược chất nano hóa
- Đánh giá khả năng giải phóng thuốc in vitro
- Đánh giá độ ổn định KTTP
- Đánh giá một số đặc tính khác (dựa trên hình ảnh TEM, phổ FT-IR).
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA
Tiểu phân nano polyme được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi
Sơ đồ quy trình được trình bày ở hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế hệ tiểu phân nano polymer chứa PTX, DHA
- Chuẩn bị pha nội: Dược chất, EC, lecithin được hòa tan trong 5 ml dung môi DCM ở nhiệt độ thường Lắc đều để được dung dịch đồng nhất
- Chuẩn bị pha ngoại: Chất diện hoạt hòa tan trong nước với nồng độ thích hợp
- Giai đoạn nhũ hóa: Nhỏ từng giọt pha nội vào pha ngoại với tốc độ 2,5 ml/phút
Nhũ tương dầu trong nước được đồng nhất bằng cách sử dụng máy siêu âm đầu dò kết hợp với khuấy từ, với công suất và thời gian siêu âm phù hợp Trong quá trình đồng nhất, nhiệt độ được duy trì ở mức 0-5ºC nhờ vào nước đá, cùng với tốc độ khuấy từ 400 vòng/phút.
- Bốc hơi dung môi: Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ nhẹ nhàng trong
2 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi hữu cơ thu được hỗn dịch nano
Các phương pháp đánh giá Đánh giá kích thước, phân bố kích thước tiểu phân
Kích thước tiểu phân (KTTP) được xác định thông qua phương pháp tán xạ ánh sáng động (dynamic light scattering) Khi chiếu tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân sẽ được ghi lại trên màn chắn Bằng cách phân tích sự dao động cường độ ánh sáng tán xạ, chúng ta có thể đánh giá chuyển động Brown và xác định kích thước hạt thông qua phương trình Stokes-Einstein Kết quả thu được là KTTP trung bình từ 20 lần đo.
Hỗn dịch nano được tạo ra bằng cách bốc hơi dung môi và sau đó phân tán vào một lượng nước phù hợp để đạt tốc độ đếm từ 200-400 kcps Mẫu được đo trên máy Zetasizer ở nhiệt độ 25℃ để đánh giá thế zeta của hệ tiểu phân nano.
Nguyên tắc xác định thế zeta liên quan đến chuyển động của tiểu phân trong điện trường, nơi tiểu phân di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ thuận với thế zeta Tốc độ này được xác định thông qua việc phân tích chuyển động của tiểu phân bằng ánh sáng tán xạ Thế zeta được tính toán dựa vào độ nhớt của môi trường và theo định luật Smoluchowski-Huckel.
Tiến hành tương tự như phương pháp xác định KTTP nhưng sử dụng cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng
Phương pháp định lượng PTX, DHA a, Điều kiện sắc ký
Dựa trên tài liệu tham khảo [4], [5] và các điều kiện thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành định lượng DHA và PTX trong các mẫu bằng phương pháp HPLC Các điều kiện sắc ký được thiết lập để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.
- Cột sắc ký: ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 mmì250 mmì5 àm)
Pha động ACN sử dụng đệm phosphat pH 3,0 (tỷ lệ 57:43, tt/tt), trong đó đệm này bao gồm 4,08 g kali dihydrophosphat hòa tan trong 1 lít nước cất và được điều chỉnh đến pH 3,0 bằng acid phosphoric Sau đó, dung dịch được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.
- Detecter UV, bước sóng phát hiện: 210 nm
- Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl
- Dung môi pha mẫu là: ACN : H2O = 57:43 (tt/tt)
- Dung môi pha mẫu (mẫu trắng): ACN : đệm phosphat pH 3,0 (57:43, tt/tt)
Để chuẩn bị mẫu chuẩn DHA, cân chính xác 20,0 mg nguyên liệu DHA và cho vào bình định mức 20 ml Thêm 10 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15 phút để DHA tan hoàn toàn Bổ sung ACN đến đủ thể tích và lắc đều Từ dung dịch chuẩn gốc với nồng độ khoảng 1000,0 µg/ml, pha loãng bằng dung môi pha mẫu để tạo ra các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 5,0 µg/ml đến 100,0 µg/ml Cuối cùng, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc kích thước 0,45 µm và tiêm vào hệ thống HPLC để xác định nồng độ DHA.
Để chuẩn bị mẫu chuẩn PTX, cần cân chính xác khoảng 10,0 mg nguyên liệu PTX và cho vào bình định mức 20 ml Tiếp theo, thêm 10 ml ACN, đậy kín, lắc kỹ và siêu âm trong khoảng 15 phút Cuối cùng, bổ sung vừa đủ ACN để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ chính xác.
Để xác định nồng độ, từ dung dịch chuẩn gốc 500 àg/ml, pha loãng bằng dung môi để tạo ra các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 àg/ml đến 50 àg/ml Sau đó, lọc dung dịch qua màng lọc kích thước 0,45 µm và tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC.
PTX trong dung dịch chuẩn
Mẫu dược chất phân tử tự do được chuẩn bị bằng cách lấy 2 ml hỗn dịch chứa tiểu phân nano và cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000 Da Sau đó, tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút tại nhiệt độ 10℃ Cuối cùng, lấy phần dịch lọc trong phía dưới màng siêu lọc để định lượng bằng phương pháp HPLC.
Mẫu dược chất toàn phần được chuẩn bị bằng cách lấy 2 ml hỗn dịch nano cho vào bình định mức 10 ml, thêm 5 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15 phút Sau đó, bổ sung ACN đến vạch định mức và lắc đều Dịch lọc được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm và sau đó được tiêm vào sắc ký để xác định nồng độ dược chất toàn phần Đồng thời, cần thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp HPLC.
- Tiến hành: Pha dãy dung dịch chuẩn PTX - DHA và tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như mục a - 2.3.2.3
- Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ dược chất
- Tiến hành: Pha lần lượt:
Chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa PTX với nồng độ khoảng 50 àg/ml và dung dịch chuẩn chứa DHA với nồng độ khoảng 100 àg/ml Sau đó, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 àm để đảm bảo độ chính xác.
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp PTX - DHA với nồng độ 50 àg/ml và 100 àg/ml cho hai dược chất trong dung dịch, sau đó lọc qua màng lọc có kích thước 0,45 àm.
Tiến hành tiêm các mẫu chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp trong điều kiện sắc ký như mục a - 2.3.2.3
- Yêu cầu: pic DHA và PTX tách nhau hoàn toàn
Độ tương thích hệ thống
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp PTX - DHA với nồng độ 50 àg/ml và 100 àg/ml, sau đó lọc qua màng lọc kích thước 0,45 àm Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trong điều kiện sắc ký đã chọn để khảo sát độ tương thích hệ thống Đánh giá dựa trên các giá trị độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu và diện tích pic.
Giá trị RSD của diện tích pic và thời gian lưu phải không vượt quá 2,0% Phương pháp xác định hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất nano hóa là rất quan trọng trong nghiên cứu này.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Khảo sát phương pháp định lượng đồng thời DHA và PTX
Tiến hành pha chế dung dịch placebo, chuẩn đơn DHA, chuẩn đơn PTX và dung dịch hỗn hợp DHA và PTX theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.3 Kết quả đáp ứng của các dung dịch placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử được trình bày chi tiết trong các hình ảnh ở phụ lục 1.
Dựa vào sắc ký đồ thu được có thể thấy:
Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn đơn DHA, pic của α-DHA xuất hiện với thời gian lưu 8,55 phút và pic của β-DHA có thời gian lưu 12,26 phút Đối với mẫu chuẩn đơn PTX, pic của PTX có thời gian lưu là 10,14 phút Trong mẫu chuẩn hỗn hợp, pic của α-DHA có thời gian lưu 8,52 phút, pic của β-DHA là 12,20 phút và pic của PTX có thời gian lưu 10,07 phút.
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, không có sự xuất hiện của các pic lạ tại khoảng thời gian lưu của DHA và PTX Đối với mẫu chuẩn DHA, cũng không có pic lạ xuất hiện trong khoảng thời gian lưu của PTX, và tương tự, mẫu chuẩn PTX không ghi nhận pic lạ trong khoảng thời gian lưu của DHA.
Trên các sắc ký đồ, thời gian lưu của dược chất trong mẫu thử tương ứng với mẫu chuẩn, cho thấy các pic rõ nét và tách biệt rõ ràng Độ phân giải giữa PTX và α-DHA là khoảng 2,66, trong khi độ phân giải giữa β-DHA và PTX là khoảng 3,02.
Như vậy, các điều kiện sắc ký đã lựa chọn là phù hợp, phương pháp lựa chọn đạt yêu cầu về độ đặc hiệu Độ tương thích hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp đã pha trong điều kiện sắc ký được chọn nhằm khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ tương thích hệ thống
DHA PTX Đồng phân α Đồng phân β
Nhận xét: Về thời gian lưu, độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu đều có giá trị RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các mẫu trong phân tích bằng phương pháp HPLC phải đạt giá trị ≤ 2% để đáp ứng yêu cầu chất lượng Các mẫu đều có diện tích pic phù hợp và thỏa mãn tiêu chí chung về độ lệch chuẩn tương đối, đảm bảo độ tuyến tính trong quá trình định lượng.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn DHA với nồng độ 5, 10, 20, 50, 100 μg/ml và dãy dung dịch chuẩn PTX với nồng độ 1, 5, 10, 20, 50 μg/ml Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả Kết quả mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dược chất được trình bày trong bảng 3.2, 3.3 và hình 3.1, 3.2.
Bảng 3.2 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA trong pha động
Đồ thị trong Hình 3.1 cho thấy mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA, trong khi Bảng 3.3 minh họa mối liên hệ giữa diện tích pic và nồng độ PTX trong pha động.
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ PTX
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ DHA trong khoảng từ 5 đến 100 μg/ml, cũng như nồng độ PTX trong khoảng từ 1 đến 50 μg/ml, với hệ số tương quan r² > 0,999 Phương trình hồi quy được xác định là y = 2,6328x + 2,337, với R² = 0,9996.
Nồng độ DHA (àg/ml) y = 129,41x + 24,275
Nồng độ PTX (àg/ml)
Bào chế tiểu phân nano chứa PTX, DHA
Để tăng cường khả năng vận chuyển thuốc đến khối u, các hạt tiểu phân nano cần được lưu giữ lâu trong tuần hoàn và có kích thước phù hợp để vượt qua các khe hở liên bào của thành mạch khối u Nghiên cứu cho thấy các tiểu phân nano có kích thước nhỏ hơn 200 nm là lý tưởng cho mục tiêu này Hơn nữa, việc có phân bố kích thước tiểu phân hẹp cũng rất quan trọng để nâng cao hiệu quả điều trị, với giá trị PDI nhỏ hơn 0,25 cho thấy sự phân bố hẹp của kích thước tiểu phân, trong khi giá trị PDI lớn hơn biểu thị sự phân bố rộng.
Để đáp ứng yêu cầu về hệ tiểu phân nano chứa hai dược chất có kích thước nhỏ hơn 200 nm và PDI < 0,25, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình bào chế tiểu phân nano Các yếu tố quy trình được khảo sát trong điều kiện cố định với công thức bao gồm pha nội là 5 ml dung dịch DCM chứa 5 mg PTX, 10 mg DHA, 15 mg EC và 15 mg lecithin Pha ngoại là dung dịch Tween 80 nồng độ 1,5% trong 30 ml nước, với tốc độ phối hợp pha nội vào pha ngoại là 2,5 ml/phút và quá trình bốc hơi dung môi hữu cơ diễn ra trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
Kết quả ảnh hưởng của công suất siêu âm
Công suất siêu âm đóng vai trò quan trọng trong việc phân tán pha dầu và nước, giúp tạo ra các tiểu phân kích thước nhỏ Thí nghiệm được thực hiện trong thời gian 5 phút với công suất siêu âm dao động từ 0 đến 130 W Kết quả của nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.3.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Công thức Công suất siêu âm (W) KTTPTB(nm) PDI
Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng của công suất siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Khi không có tác dụng của lực siêu âm, hệ không thể tạo thành kích thước nano mà chỉ tồn tại dưới dạng hỗn dịch có kích thước quan sát được bằng mắt thường Khi công suất siêu âm tăng từ 52 W lên 130 W, kích thước tiểu phân nano và chỉ số PDI có xu hướng giảm dần Điều này cho thấy lực siêu âm đóng vai trò quan trọng trong việc phân cắt các giọt dầu, tạo ra nhũ tương nano Lực siêu âm lớn không chỉ tăng khả năng phân cắt mà còn giảm độ nhớt của hệ, giúp giảm kích thước tiểu phân nano Công suất siêu âm 130 W cho giá trị KTTPTB và PDI nhỏ nhất, do đó, công suất này được chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thời gian siêu âm là yếu tố quan trọng trong quy trình bào chế, ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân nano (KTTPTB) và chỉ số phân tán (PDI) Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát với thời gian siêu âm từ 3 đến 9 phút và thu được những kết quả đáng chú ý.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Công thức Thời gian siêu âm
Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Khi thời gian siêu âm được tăng từ 3 phút lên 5 phút, chỉ số KTTPTB và PDI của hệ tiểu phân nano giảm dần Tuy nhiên, khi thời gian siêu âm đạt 7 phút, KTTPTB và PDI gần như không thay đổi.
Nghiên cứu của Cho Eun Jung và cộng sự cho thấy việc sử dụng năng lượng cao có thể tạm thời làm giảm kích thước của các tiểu phân nano Tuy nhiên, sau một thời gian nhất định, năng lượng cao hơn lại thúc đẩy sự tích tụ của các tiểu phân đã được phân tán ban đầu, do tăng cường tương tác giữa các tiểu phân nano với năng lượng bề mặt cao.
Để tiết kiệm năng lượng siêu âm trong quá trình bào chế, thời gian siêu âm được lựa chọn là 5 phút cho các khảo sát tiếp theo, nhằm đánh giá ảnh hưởng của các thành phần trong công thức.
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang EC và DC
Chất mang polyme có vai trò rất quan trọng đối với việc hình thành tiểu phân nano
DC có thể được bao gói trong polyme hoặc hấp phụ lên bề mặt chất mang để tạo ra các tiểu phân nano Tỷ lệ polyme/DC quá thấp có thể dẫn đến việc dược chất không được bao gói hoàn toàn, trong khi tỷ lệ quá cao sẽ làm khó khăn cho việc phân bố đồng nhất trong các tiểu phân nano và giảm độ hòa tan (LC) Do đó, việc khảo sát các công thức với tỷ lệ EC/DC khác nhau là cần thiết, giữ nguyên lượng dược chất PTX 5 mg, DHA 10 mg và thay đổi lượng EC, nhằm tìm ra tỷ lệ tối ưu.
Thời gian siêu âm (phút)
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ EC/DC tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Công thức Tỷ lệ EC/DC (kl/kl) KTTPTB (nm) PDI
Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ EC/DC tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Khi tỷ lệ EC/DC là 1/3, kích thước tiểu phân (KTTPTB) nhỏ nhưng phân bố không đồng đều (PDI > 0,3) Sau khi bốc hơi dung môi, nhiều tiểu phân có thể quan sát bằng mắt thường, có thể do dư lượng chất tự do chưa được bao gói hoàn toàn Khi tăng lượng EC, KTTPTB cũng tăng lên, trong khi PDI hầu như không thay đổi Trong các công thức khác, CT5 với tỷ lệ EC/DC là 3/3 cho hệ nano có KTTPTB nhỏ nhất và PDI thấp nhất.
Nghiên cứu của Budhian Avinash và cộng sự cho thấy việc tăng nồng độ polymer trong pha nội dẫn đến sự gia tăng kích thước tiểu phân nano Nguyên nhân là do nồng độ polymer cao làm tăng độ nhớt của pha dầu, từ đó giảm khả năng phân cắt của lực siêu âm Bên cạnh đó, lượng polymer tăng cũng làm giảm LC của hệ tiểu phân nano Vì vậy, tỷ lệ EC/DC được lựa chọn là 3/3 cho các công thức tiếp theo.
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ lecithin/EC
Lecithin là một loại phospholipid tự nhiên có tính kỵ nước, được sử dụng phổ biến trong ngành thực phẩm và dược phẩm Nó được công nhận như một tá dược an toàn, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Tỷ lệ EC/DC (kl/kl)
32 toàn, tương thích sinh học Lecithin cũng được sử dụng như một chất diện hoạt để tăng độ ổn định và khả năng bao gói dược chất [17]
Tiến hành khảo sát các công thức với tỷ lệ lecithin/EC thay đổi (giữ nguyên lượng
EC là 15mg, thay đổi lượng lecithin), thu được kết quả:
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ lecithin/EC tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Công thức Tỷ lệ lecithin -
Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ lecithin/EC tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Khi thêm lecithin vào quá trình pha chế, chỉ số KTTPTB giảm nhưng PDI lại tăng Việc tăng lecithin từ 0 mg lên 15 mg làm giảm KTTPTB đáng kể, nhưng khi tăng lên 25 mg, sự thay đổi không đáng kể Đặc biệt, trong CT5, việc bổ sung 15 mg lecithin đã làm tăng đáng kể EE của DHA so với khi không có lecithin Nghiên cứu của Martin-Banderas và cộng sự cũng cho thấy lecithin không chỉ tăng EE của hệ tiểu phân nano mà còn cải thiện độ ổn định Hơn nữa, lecithin là thành phần của màng tế bào, nên có tính tương thích sinh học cao, giúp nâng cao sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano Do đó, tỷ lệ lecithin/EC được chọn là 3/3 cho các khảo sát tiếp theo.
Tỷ lệ lecithin/EC (kl/kl)
Khảo sát ảnh hưởng của loại chất diện hoạt pha ngoại
Chất diện hoạt trong pha ngoại đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định nhũ tương nano, ngăn chặn sự kết tụ của các tiểu phân và duy trì sự ổn định của hỗn dịch nano Việc lựa chọn loại chất diện hoạt phù hợp sẽ giúp tạo ra hệ nano với các đặc tính vật lý tốt hơn và độ ổn định cao hơn Trong nghiên cứu này, các chất diện hoạt như Tween 80, Poloxamer 188, PVA và PEG 400 với nồng độ 1,5% đã được khảo sát trong điều kiện phòng thí nghiệm, cho kết quả đáng chú ý.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt pha ngoại tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Công thức Loại chất diện hoạt KTTPTB (nm) PDI
Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng của loại chất diện hoạt pha ngoại tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Các chất diện hoạt như PEG 400, PVA và Poloxamer 188 tạo ra hệ tiểu phân nano có kích thước lớn hơn 200 nm Trong đó, PEG 400 và Poloxamer 188 cho thấy sự phân bố kích thước tiểu phân không đồng đều, dẫn đến việc hình thành hỗn dịch có thể quan sát bằng mắt thường sau khi bốc hơi dung môi Ngược lại, Tween 80 tạo ra tiểu phân nano với cảm quan tốt hơn, không nhìn thấy tiểu phân bằng mắt thường.
34 nhỏ và PDI < 0,2 Do đó, chúng tôi chọn Tween 80 là chất diện hoạt cho các khảo sát tiếp theo
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt pha ngoại
Đánh giá một số đặc tính của của hệ tiểu phân nano đã lựa chọn
Tiến hành bào chế và đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano CT5, kết quả trình bày dưới đây:
Kết quả đánh giá thế zeta của hệ tiểu phân nano
Thế zeta là chỉ số quan trọng để đánh giá độ ổn định của hệ tiểu phân phân tán; giá trị tuyệt đối của thế zeta càng cao thì lực đẩy giữa các tiểu phân càng lớn, dẫn đến hệ càng ổn định Kết quả đo cho thấy tiểu phân nano bào chế được (CT5) có thế zeta là -32,8 ± 2,4mV.
Hệ tiểu phân nano với giá trị tuyệt đối của thế zeta lớn hơn 30 mV cho thấy tính ổn định tĩnh điện cao, nhờ vào lực đẩy giữa các tiểu phân nano cùng dấu điện.
Kết quả đánh giá hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất nano hóa của hệ tiểu phân nano được xác định theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.3.3.3 Thông tin chi tiết về kết quả này được trình bày trong bảng.
Bảng 3.11 Hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất nano hóa củahệ tiểu phân nano
Nhận xét cho thấy PTX có hiệu quả hấp thu cao (99,54%), trong khi DHA có hiệu quả hấp thu thấp hơn đáng kể (61,08%) Nghiên cứu của Vineeth P và các cộng sự đã chỉ ra rằng khả năng nạp một dược chất của PTX vượt trội hơn so với DHA.
Sự tan ít trong nước của các chất vào tiểu phân nano phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm độ tan của dược chất trong môi trường nước, tốc độ kết tụ của polyme khi phối hợp pha nội với pha ngoại, và ái lực của dược chất với cấu trúc polyme PTX, với độ tan trong nước rất thấp (dưới 0,7 μg/ml), gần như không tan, trong khi DHA có độ tan cao hơn (134,8 μg/ml) Điều này có thể lý giải cho việc hiệu suất entrapment (EE) của PTX lớn hơn so với DHA.
Kết quả đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano
Tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano theo công thức tối ưu đã được khảo sát và thử nghiệm, sử dụng phương pháp như đã nêu trong mục 2.3.2.4 Kết quả thu được được trình bày trong hình.
Hình 3.10 Đồ thị thể hiện tỷ lệ PTX, DHA giải phóng từ hệ tiểu phân nano theo thời gian ở hai môi trường đệm pH 5,0 và pH 7,4
Nhận xét cho thấy rằng DHA có sự giải phóng nhanh chóng trong cả hai môi trường đệm, đặc biệt trong 6 giờ đầu Cụ thể, ở môi trường đệm pH 5,0, DHA giải phóng đạt 63,87%, trong khi ở pH 7,4, con số này là 55,93% Sự giải phóng ồ ạt này có thể liên quan đến hiệu suất entrapment (EE) thấp của DHA, chỉ đạt 61,08%, dẫn đến nhiều dược chất còn ở dạng tự do Nguyên nhân có thể là do sự liên kết lỏng lẻo giữa phân tử dược chất và chất mang trên bề mặt tiểu phân, hoặc do sự hấp phụ của dược chất lên bề mặt tiểu phân nano.
DHA pH 5,0 PTX pH 5,0 DHA pH 7,4 PTX pH 7,4
PTX cho phép giải phóng dược chất từ từ trong cả hai môi trường đệm nhờ vào hiệu suất nano hóa thuốc cao đạt 99,54% Dược chất được giải phóng thông qua cơ chế khuếch tán qua cốt polyme hoặc ăn mòn polyme.
Trong môi trường đệm pH 7,4, cả hai dược chất đều giải phóng chậm hơn so với pH 5,0, đặc biệt là PTX, với 50,01% giải phóng ở pH 5,0 sau 24 giờ, trong khi chỉ 16,31% ở pH 7,4 Điều kiện pH 5,0 tương tự như môi trường khối u, cho thấy hệ thống có khả năng bảo vệ thuốc tốt hơn trong môi trường tuần hoàn, giúp đưa thuốc tới khối u và giải phóng nhanh hơn tại đích.
Kết quả đánh giá sơ bộ độ ổn định của hệ tiểu phân nano
Hỗn dịch nano thường kém ổn định, do đó cần được chuyển sang trạng thái khô sau khi bào chế Đông khô là phương pháp phổ biến để thực hiện điều này, nhưng trong quá trình đông khô, hệ tiểu phân nano có thể dễ dàng kết tụ do tác động của nhiệt độ và áp suất Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ ổn định của hỗn dịch nano trong điều kiện đông đá - rã đông và thu được kết quả đáng chú ý.
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của thí nghiệm đông đá - rã đông tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
Nhận xét cho thấy sau 3 chu kỳ đông đá - rã đông, hệ tiểu phân nano KTTPTB và PDI chỉ tăng nhẹ (Sf/Si = 1,14 < 1,2), chứng tỏ rằng hệ tiểu phân nano này có độ bền khá tốt trong điều kiện làm lạnh sâu.
Kết quả đánh giá hình thái cấu trúc của hệ tiểu phân nano được thực hiện bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy những đặc tính quan trọng của tiểu phân Phương pháp này cho phép phân tích chi tiết kích thước, hình dạng và cấu trúc của tiểu phân, từ đó cung cấp thông tin cần thiết để hiểu rõ hơn về tính chất và ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau.
Hình 3.11 Ảnh chụp TEM của tiểu phân nano PTX - DHA
Nhận xét về ảnh chụp TEM của mẫu tiểu phân nano CT5 cho thấy các tiểu phân nano có hình cầu với kích thước đồng đều, tương tự như kích thước đo được trên máy Zetasizer Đồng thời, việc đánh giá thành phần và tương tác hóa học được thực hiện thông qua phổ hồng ngoại FT-IR.
Khi tiến hành đo phổ hồng ngoại của mẫu tiểu phân nano PTX – DHA (CT5) và hỗn hợp vật lý theo phương pháp đã nêu ở mục b - 2.3.2.6, chúng tôi thu được kết quả như thể hiện trong hình 3.12.
Hình 3.12 Phổ IR của tiểu phân nano PTX - DHA, hỗn hợp vật lý và các nguyên liệu
Trên phổ IR của DHA có pic đặc trưng là 847, 876, 1093 cm -1 (liên kết C-O-O-C), pic 3374 (liên kết O-H)
Trên phổ IR của PTX có pic đặc trưng là 1735 (liên kết C=O của este), 1647 (liên kết C=O của amid) ,1244 (liên kết C-N)
Trên phổ IR của EC có pic đặc trưng là 1281 (liên kết C-O-C của ether)
Trên phổ IR của lecithin có pic đặc trưng là 1746 (liên kết C=O của este), 1066 (đặc trưng cho nhóm phosphat)
Trên phổ hồng ngoại (IR) của hỗn hợp vật lý PTX, DHA, EC và lecithin, các đỉnh đặc trưng của nguyên liệu xuất hiện đầy đủ, cho thấy không có sự tương tác nào xảy ra giữa chúng.
