Khái quát về bệnh nhiễm khuẩn th-ờng gặp ở ng-ời
Hiện t-ợng kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh
Theo Tiến sĩ J Ewards, Chủ tịch Hiệp hội các bệnh nhiễm khuẩn Hoa
Cuộc nghiên cứu chống vi khuẩn đang gặp khó khăn nghiêm trọng, báo hiệu một mối nguy lớn cho con người trong cuộc chiến chống lại các loại vi khuẩn.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam hiện đang nằm trong số những quốc gia có tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh cao nhất châu Á, cùng với Trung Quốc Biểu hiện rõ rệt của tình trạng kháng kháng sinh này chủ yếu xuất hiện ở các chủng vi khuẩn như Tụ cầu vàng.
(Staphilococcus aureus); PhÕ cÇu khuẩn (Streptococcus pneumoniae); Trùc khuÈn
Các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella terrigena là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh viêm nhiễm nghiêm trọng, bao gồm viêm tiết niệu, viêm họng, viêm màng não mủ, viêm hoá mủ và nhiễm trùng máu cấp tính.
Theo báo cáo của Vụ Điều Trị (Bộ Y Tế) thì hầu hết các thuốc kháng sinh hiện nay đã bị kháng từ thấp đến cao (30 - 80%) trong đó
Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn phế cầu Streptococcus pneumoniae đang gia tăng đáng kể, với tỷ lệ đề kháng đối với Erythromycin và Trimoxazol vượt quá 70% vào năm 2004 Đặc biệt, tỷ lệ kháng Chloramphenicol cũng tăng từ 9,4% vào năm 2002 lên 35,6% vào năm 2004.
+Đối với vi khuẩn Escherichia coli (thường gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết), tỷ lệ kháng thuốc ở Ampicillin là 88%,
Amoxycillin là 38,9%, Chloramphenicol, Trimoxazol là trên 50%; Gentamycin, Ciprofloxacin trên 40%; Cefotaxim trên 20%
+ Đối với vi khuẩn Klebsiella terrigena Ampicillin hầu như không còn tác dụng, tỷ lệ kháng thuốc lên tới 97% và với Amoxycillin là 42%
Theo nghiên cứu của Nguyễn Trọng Chính [11], thì tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây viêm đ-ờng tiết niệu nh- sau:
+ Đối với chủng vi khuẩn Staphilococcus aureus có sức đề kháng cao với Ampicillin là 88,2%, Cephalixin, Gentamicin và Ciprofloxacin trên 40%, Cefotaxim trên 20%
+ Đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa có tỉ lệ kháng với một số loại kháng sinh nh- sau: Ampicillin 95,42%, Cefotaxim 49,62%, Ceftriazon 40,45%, Gentamicin 42,30%, Cprofloxacin 40,42%
Hai chủng vi khuẩn này không chỉ thể hiện khả năng kháng thuốc mạnh mẽ mà còn có sự đa kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, đạt tỉ lệ rất cao khi được kết hợp trong quá trình điều trị.
Tình trạng kháng thuốc có nhiều nguyên nhân, trong đó việc sử dụng kháng sinh tuỳ tiện và không đúng cách là nguyên nhân chủ yếu Việc sử dụng không đúng liều lượng và không tuân thủ khoảng cách giữa các lần dùng sẽ trực tiếp ảnh hưởng đến vòng xoắn kháng kháng sinh, dẫn đến sự gia tăng kháng thuốc.
Nhiễm khuẩn => Điều trị không thích hợp => Không tiệt trừ được vi khuẩn => Chọn lọc các vi khuẩn đề kháng => Nhiễm khuẩn lan tràn => Tăng kháng thuốc => Nhiễm khuẩn
+ Vi khuẩn có thể kháng kháng sinh bằng cách thay đổi mục tiêu (nơi kháng sinh gắn vào và thể hiện tác dụng)
+ Làm giảm sự tiếp xúc của kháng sinh với các mô mục tiêu (thay đổi sự xâm nhập hay đẩy kháng sinh khỏi tế bào nhiễm vi khuẩn)
+ Làm giảm lượng kháng sinh tiếp xúc với mô mục tiêu hay bất hoạt kháng sinh bằng enzym do vi khuẩn tiết ra
Đề kháng kháng sinh có thể được chia thành hai loại: đề kháng giả, chỉ xuất hiện trong những môi trường nhất định, và đề kháng thật, khi vi khuẩn hoàn toàn không bị ảnh hưởng bởi kháng sinh.
Đề kháng kháng sinh có thể xảy ra qua hai hình thức: tự nhiên và thu được do đột biến di truyền Đề kháng tự nhiên được truyền dọc qua các thế hệ (ông, cha, con, cháu), trong khi đề kháng thu được có thể truyền ngang giữa các vi khuẩn hoặc lây nhiễm từ người sang người, động vật sang người, và từ môi trường Quá trình này tạo ra áp lực chọn lọc, dẫn đến sự phát triển của các cá thể và dòng vi khuẩn đề kháng.
Một số vi khuẩn gây bệnh th-ờng gặp ở ng-ời
Tụ cầu vàng (Staphilococcus aureus)
S aureus là cầu khuẩn Gram d-ơng, xếp hình chùm nho kích th-ớc 0,8
Vi khuẩn có kích thước khoảng 1 μm, có khả năng làm đông huyết tương Nhiệt độ phát triển lý tưởng là 37º C, với pH trong khoảng 7,2-7,4 Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc có đường kính từ 2-3mm, hình dạng S (tròn, lồi, bóng, đục, bờ rõ rệt).
Sau 36 giờ, sắc tố màu vàng xuất hiện trên thạch máu, với các khuẩn lạc tròn, ớt và bóng Những khuẩn lạc này có thể tạo thành vòng tan huyết hoàn toàn hoặc hình thành vòng xung quanh khuẩn lạc, được gọi là tan máu β.
Staphilococcus aureus gây bệnh ở ng-ời chủ yếu là các bệnh cấp tính [4]
- Bệnh ngoài da: Mụn nhọt ,đôi khi có thể gây ác tính đối với các biến chứng gây viêm nghẽn tĩnh mạch xoang hang (bệnh đinh râu….)
- Nhiễm khuẩn huyết: Xẩy ra khi cơ thể suy yếu, có thể gây cấp tính hoặc mãn tính bằng các bệnh viêm x-ơng, viêm phổi, viêm cơ…
Nhiễm độc thức ăn là tình trạng xảy ra khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm tụ cầu vàng, dẫn đến việc cơ thể sản sinh độc tố gây ra triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy nghiêm trọng, hạ nhiệt độ cơ thể và có thể gây choáng.
* Thử nghiệm: lên men đ-ờng Manitol; Coagulaza d-ơng tính; Dezoxyribo nucleaza (khi nuôi cấy trên môi tr-ờng DNA) d-ơng tính; phản ứng Catalaza d-ơng tính.
Klebsiella terrigena
Klebsiella terrigena là một loại trực khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, thường sống trong môi trường đất và nước Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 37º C, trong khi pH lý tưởng dao động từ 7,2 đến 7,4 Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc của Klebsiella terrigena sẽ có hình dạng S đặc trưng.
M (có vỏ), đ-ờng kính 3-3,5mm Trên canh thang, làm đục đều canh thang và có lắng cặn [2]
Klebsiella terrigena là một vi khuẩn thường sống trong đường tiêu hóa, trên da và trong môi trường xung quanh Chúng chỉ gây bệnh khi xuất hiện ở những vị trí không bình thường trong cơ thể.
- Xuất hiện máu gây ra một số bệnh nh- nhiễm khuẩn huyết
- Xuất hiện ở n-ớc tiểu gây viêm đ-ờng tiết niệu
- Xuất hiện ở dịch phổi gây viêm màng phổi (đặc biệt với ng-ời già và trẻ sơ sinh)
- Xuất hiện ở màng bụng gây viêm phúc mạc
• Tính chất sinh hoá: Thử nghiệm Ureaza âm tính; Indol âm tính; LDC d-ơng tính; có khả năng lên men đ-ờng Lactoza, Mantoza, Sarcaroza, glucoza; không sinh H 2 S.
PhÕ cÇu khuÈn (Streptococcus pneumoniae)
Streptococcus pneumoniae là những song cầu hình ngọn nến, hai đầu nhọn quay ra ngoài, hai đầu to đứng giáp vào nhau, đ-ờng kính 0,5 – 1,25μm
Phế cầu khuẩn có khả năng nhuộm màu Gram và bắt màu Gram (+) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 37ºC, với pH lý tưởng từ 7,2 đến 7,4 Trên môi trường thạch thường, phế cầu khuẩn tạo thành các khuẩn lạc khô, xù xì, trong khi trên thạch máu, chúng phát triển dễ dàng với khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, giống như giọt sương, và xung quanh có vòng tan máu α hoặc β.
Phế cầu là tác nhân gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, bao gồm viêm cấp đường hô hấp trên và dưới, viêm phổi, viêm màng não, viêm tai giữa, và có thể dẫn đến nhiễm khuẩn huyết nguy kịch.
• Tính chất sinh hoá: Thử nghiệm Guellung.
Trùc khuÈn Gram ©m (Escherichia coli)
Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí tuỳ tiện, có khả năng di động nhờ tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử Các chủng có độc lực thường có vỏ capsul, trong khi các chủng không có động lực thì không có capsul Kích thước trung bình của vi khuẩn này là 0,5μ x 1,3μ với hai đầu tròn, và một số dòng có lông bám (pili) Nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37°C, nhưng chúng cũng có thể sinh trưởng ở 40°C với pH 7,4 Trên môi trường thạch thường, E coli tạo thành các khóm tròn màu trắng đục (dạng S) có kích thước 2-3mm sau 24 giờ nuôi cấy, nhưng nếu để lâu, khóm sẽ trở nên khô nhăn (dạng R) Trên môi trường thạch máu, có các chủng dung huyết β và không dung huyết α.
Escherichia coli là vi khuẩn thường có trong phân của vật chủ, nhưng chỉ gây bệnh khi di chuyển đến vị trí không thích hợp hoặc khi hệ miễn dịch của cơ thể yếu Những yếu tố như sỏi mật hoặc u xơ tiền liệt tuyến có thể tạo điều kiện cho sự phát triển của chúng Vi khuẩn này có thể gây ra nhiều loại nhiễm khuẩn, bao gồm nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết, viêm ruột thừa, nhiễm khuẩn vết thương, viêm màng bụng và viêm màng phổi.
• Tính chất sinh hoá: lên men đ-ờng Glucoza có sinh hơi; sinh Indol; đỏ metyl d-ơng tính; không sinh H 2 S.
Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
Pseudomonas aeruginosa là loại vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc
Tế bào có hình dạng que mỏng, kích thước từ 1,5 - 3μm, đôi khi tồn tại dưới dạng hình cầu hoặc hình sợi Chúng di chuyển bằng một chùm tiên mao ở cực và không có bào tử hay vỏ nhầy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là từ 30-37ºC và pH từ 7,2-7,4 Trong môi trường nuôi cấy, tế bào thường phát ra mùi đặc trưng do sinh ra Kimetyamin Trên môi trường thạch, chúng tạo thành khuẩn lạc lớn, tròn, không trong và có màu xanh lá cây, sau đó chuyển sang màu nâu.
Pseudomonas aeruginosa thường ít xuất hiện trong môi trường tự nhiên, chủ yếu tồn tại trên da hoặc niêm mạc của vật chủ Chúng có thể được tìm thấy trong môi trường bệnh viện, nước và giường bệnh Loại vi khuẩn này chỉ gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi, dẫn đến các bệnh như nhiễm khuẩn huyết, viêm đường tiết niệu, viêm phúc mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn vết thương, đặc biệt trong điều kiện vệ sinh kém và khi sử dụng dụng cụ không được tiệt trùng.
• Tính chất sinh hoá: Oxidaza d-ơng tính; lactoza âm tính; indol âm tính; H 2 S âm tính; làm lỏng gelatin.
Chất kháng khuẩn thực vật
L-ợc sử nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng khuẩn thực vật
Trước khi các hợp chất kháng sinh tổng hợp ra đời, con người đã sử dụng cây cỏ thiên nhiên để chữa bệnh từ thời cổ xưa, như ở Trung Quốc, Việt Nam, Ai Cập và Hy Lạp Tại Việt Nam, vào thế kỷ 14, Phan Phù Tiên Tuệ Tĩnh, hay còn gọi là Lãn Ông, đã nghiên cứu và áp dụng nhiều dược liệu để điều trị bệnh thương hàn và kiết lị một cách hiệu quả.
Cuối thế kỉ 19 một số tác giả đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của cây hoa Bia ( Humulus lupulus L.) Hai chất đ-ợc lấy ra là Humulon và
Lupulon có tác dụng với cầu khuẩn và vi khuẩn lao
Vào năm 1887, Martini đã chiết xuất đ-ợc Thymol từ cây Thymus Vugaris có tác dụng diệt khuẩn
Năm 1934, nhà khoa học Nhật Bản Testsumoto đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của 16 loại nước ép từ 19 loại gia vị, phát hiện chúng có tác dụng đối với vi khuẩn thương hàn và tả Đến năm 1943, Osborn tiếp tục nghiên cứu tính kháng khuẩn ở thực vật bậc cao, khảo sát 2300 chế phẩm thuộc 166 họ thực vật và phát hiện rằng trong số các cao chiết từ 63 chi, 28 họ có khả năng ức chế sự sinh trưởng của ít nhất một loại vi khuẩn, bao gồm Tụ cầu vàng và E.coli.
Năm 1971, S.A Vichkanova đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn và virus của 122 loại tinh dầu, trong đó có 13 chế phẩm (10%) có tác dụng ức chế mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Tại Việt Nam, nghiên cứu thực nghiệm về tính kháng khuẩn chỉ được tiến hành trong ba thập kỷ qua, khởi đầu với công trình nghiên cứu của cố
GS Đặng Văn Ngữ (1956) nghiên cứu trên 500 cây đã khẳng định nhiều cây cho tác dụng kháng khuẩn mạnh
Nghiên cứu của BS Nguyễn Văn Hưởng và cộng sự vào năm 1959 đã tiến hành khảo sát trên 1000 cây thuốc để đánh giá tính kháng khuẩn, từ đó phát triển chế phẩm Tô Mộc điều trị tiêu chảy với hiệu quả đáng kể.
Viện Y Học cổ truyền Việt Nam, hoạt động từ năm 1959 đến 1992, đã tiến hành nghiên cứu hơn 1500 cây thuốc, phát hiện 192 loài thuộc 73 họ thực vật có tác dụng tốt in vitro, bao gồm Tô mộc (Caesalpinia sappan L.), Đơn Tướng Quân (Eugenia formosa Wall) và Lá Móng (Lawsonia inermis L.).
1.3.2 - u điểm nổi bật của kháng khuẩn thực vật
Hiện nay, kháng thuốc do lạm dụng kháng sinh tổng hợp đang trở thành vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu, kèm theo nhiều tai biến nguy hiểm có thể dẫn đến tử vong Vì lý do này, xu hướng sử dụng kháng sinh tự nhiên từ cây cỏ đang ngày càng phổ biến, nhờ vào những đặc tính nổi bật mà chúng mang lại.
Nguồn nguyên liệu thiên nhiên phong phú với đa dạng loài dễ trồng, thu hoạch và chế biến Quá trình bào chế đơn giản nhờ vào tính bền vững và khả năng hòa tan trong nước của các chất kháng sinh từ thực vật.
- Có một bề dầy lịch sử, sử dụng và kinh nghiêm dân gian quí giá
Trong điều trị vết thương phần mềm, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng sinh thực vật có hiệu quả vượt trội so với kháng sinh tổng hợp Việc sử dụng kháng sinh từ cây thuốc không chỉ giúp làm sạch vết thương nhanh chóng mà còn thúc đẩy quá trình bong hoại tử và phát triển tổ chức hạt non Ngoài ra, các thành phần như men, vitamin và nguyên tố vi lượng trong cây thuốc còn hỗ trợ làm đầy miệng vết thương, giúp quá trình hồi phục diễn ra nhanh hơn.
Kháng sinh thực vật, mặc dù không mạnh mẽ như kháng sinh tổng hợp, vẫn có khả năng chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn Đặc biệt, hiện tượng kháng thuốc chưa được ghi nhận đối với các loại kháng sinh này, cho thấy tiềm năng của chúng trong điều trị.
- Rất ít độc do đó không gây ra những tai biến nguy hiểm nh- kháng sinh tổng hợp
- Giới hạn an toàn về mặt độc chất của kháng sinh thực vật lớn hơn của kháng sinh tổng hợp rất nhiều.
Các nhóm hợp chất kháng khuẩn trong thực vật
Ancaloit là những hợp chất hữu cơ chứa nitơ, thường có cấu trúc vòng và phản ứng kiềm Chúng thường xuất hiện trong thực vật, nổi bật với dược tính mạnh và khả năng phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng.
Nhiều hợp chất Ancaloit như Quinin và Emetin cho thấy hoạt tính sinh học mạnh mẽ trong việc ức chế vi khuẩn, trong đó tác dụng kháng khuẩn của Becberin được coi là quan trọng nhất Các Ancaloit này có hiệu quả tốt đối với các loại vi khuẩn như tụ cầu vàng, thương hàn, tả và lỵ.
Hợp chất Glycozit, còn được gọi là Heterosid, được hình thành từ sự kết hợp giữa đường và các thành phần không phải đường Tại Bắc Mỹ, người dân đã sử dụng cây Echinaceae angustifolia chứa Glycozit để điều trị nhiễm khuẩn từ rất lâu.
Boiteau đã phân lập thành công hợp chất glycosid có tên gọi là Asiaticosid từ cây rau má (Centella asiatica) Hợp chất này cho thấy khả năng chống vi khuẩn lao hiệu quả ở nồng độ chỉ 15 microgam/ml, với liều công hiệu thấp hơn nhiều so với liều độc.
Saponin, hay còn gọi là Saponosid, là một glycosid phổ biến trong thực vật, có nguồn gốc từ từ Latin "Sapo" nghĩa là xà phòng, do khả năng tạo bọt giống như xà phòng Chất này có khả năng làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt khi lắc với nước, và có tác dụng nhũ hóa cũng như tẩy sạch Saponin có thể làm vỡ hồng cầu ngay cả ở nồng độ rất loãng và độc đối với cá, do khả năng tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp, dẫn đến mất các chất điện giải cần thiết.
Saponin Tritecpen có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ, ảnh hưởng đến cả hệ miễn dịch và liệu pháp điều trị Các Saponin trong quả Eisculus hypocaslanum L cho thấy khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Tụ cầu Ngoài ra, Saponin Steroid từ một số loài Dioscorea cũng có tác dụng chống lại một số loại nấm Saponin từ rễ cây cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng kháng khuẩn này.
Hedera belix L có tác dụng với Tụ cầu vàng và các loài nấm [20] d) Các loại Flavonoit:
Flavonoit là nhóm hợp chất phổ biến nhất trong thiên nhiên, với khoảng 2000 loại đã được xác định cấu trúc Chúng là các chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản kiểu C6-C3-C6, trong đó mỗi C6 là một vòng benzen liên kết với C3 Cấu trúc của flavonoit có thể là vòng kín hoặc hở, và mỗi vòng có thể chứa một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế, do đó, chúng thuộc nhóm Poliphenol có tính axit.
Năm 1947, Naghski đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của Flavonit quercetin và phát hiện rằng tác dụng kháng khuẩn của nó kém trong môi trường kiềm, nhưng lại mạnh mẽ trong môi trường axit, đặc biệt đối với vi khuẩn Tụ cầu vàng, E.coli và Liên cầu khuẩn.
Hợp chất tecpen là một hợp chất bao gồm ba đơn vị isopren kết hợp với một vòng Lacton, chủ yếu được tìm thấy trong các cây thảo và cây bụi, đặc biệt là trong họ Asteraceae Trong các loại cây này, hợp chất Lacton secquitecpen thường tập trung ở các bộ phận trên mặt đất như lá và hoa.
Vào năm 1976, M.A Rubinnic đã chứng minh qua nhiều năm nghiên cứu rằng Lacton secquitecpen tự nhiên có tác dụng mạnh mẽ đối với các đơn bào ký sinh Các hợp chất Quinon cũng được nhắc đến trong nghiên cứu này.
Quinon là các diketon không no, khi trải qua quá trình khử sẽ chuyển đổi thành poliphenol Các poliphenol này có khả năng dễ dàng bị oxi hoá để tái tạo thành quinol Tính đến năm 1971, đã có hơn 450 hợp chất quinon được phân lập trong tự nhiên Những hợp chất này mang màu sắc đa dạng như vàng, cam, đỏ, tím, góp phần tạo nên màu sắc phong phú của thực vật.
Nhiều chất Quinon, cả tự nhiên lẫn tổng hợp, có hoạt tính kháng khuẩn cao nhờ sự hiện diện của các nhóm Cacbonyl và khả năng tạo liên kết Hiđro Các hợp chất như Dimetoxy 1,4-benzoquinol và 1,4 Naptonquinon cho thấy tính kháng khuẩn mạnh mẽ Đặc biệt, 2 metoxy 1,4 Naptoquinon có hiệu quả kháng khuẩn cao đối với vi khuẩn Gram dương, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của các chất Quinon trong lĩnh vực y tế.
Tinh dầu là các hợp chất thơm, dễ bay hơi có trong cây cối Từ lâu, con người đã nhận ra giá trị của các dược liệu chứa tinh dầu, đặc biệt là các loại gia vị như hồ tiêu, gừng và quế Các tinh dầu này không chỉ mang lại hương vị thơm ngon mà còn có tác dụng diệt khuẩn hiệu quả và mạnh mẽ.
Năm 1964, BS Nguyễn Văn H-ởng cùng các cộng sự tại Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu các loại tinh dầu như tinh dầu Ngổ (Enhydra pluctuans), tinh dầu Hồi (Illicium verum) và tinh dầu Long não (Cinnamomum camphora) Kết quả nghiên cứu cho thấy các loại tinh dầu này có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ đối với nhiều loại vi khuẩn, bao gồm Staphylococcus, Streptococcus heamolyticus và Salmonella typhi.
* Ngoài những chất chính trên trong cây còn nhiều hợp chất khác cũng có tính kháng khuẩn t-ơng đối mạnh nh- Chlorophyll, Cumarin….
NÊm Linh chi
Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi
Linh Chi, một loại nấm quý hiếm, đã được phát hiện từ khoảng 2000 năm trước và được ghi chép trong cuốn "Thần nông bản thảo" Tác giả Lý Thời Trân của "Bản thảo cương mục" cũng đã giới thiệu về Linh Chi với khoảng 2000 từ và 6 loại khác nhau vào năm 1595 Mặc dù có trong sách cổ, Linh Chi ít được sử dụng, chủ yếu dành cho vua chúa và người giàu Trong 20 năm qua, sự kết hợp giữa các nhà khoa học hiện đại và lương y có kinh nghiệm đã giúp làm sáng tỏ nhiều bí mật về nấm Linh Chi, mặc dù vẫn còn nhiều vấn đề chưa có kết luận rõ ràng.
Theo tài liệu [8] về nấm Linh chi ng-ời ta phân loại nh- sau:
Hiện nay, trên toàn thế giới có 386 tên loài thuộc họ Linh chi, trong đó 221 loài được công nhận bởi các nhà khoa học, còn lại là các loài bị xếp nhầm và gần 10 loài chưa được định loại Các loài này được phân chia thành nhiều chi, bao gồm: Linh chi bóng (Ganoderma) với 166 loài, Hắc Chi bào tử hình cầu (Amauroderma) với 96 loài, Linh chi bào tử có rãnh dọc (Haddowia) với 5 loài, Linh chi bào tử có mạng lưới (Humpheraya) với 10 loài, Linh chi hải miên (Tomophagus) với 2 loài, và Linh chi không bóng (Elfvingia) với 51 loài, đôi khi được gộp chung vào Linh chi bãng Tại Việt Nam, đã định tên được hơn 40 loài Linh chi, còn hàng chục loài khác chưa được xác định Thông thường, Linh chi được chia thành 6 loại dựa vào vị và màu sắc, bao gồm: Thanh chi (màu xanh), Hồng chi (màu hồng, còn gọi là Xích chi), Hoàng chi (màu vàng), Bạch chi (màu trắng, còn gọi là Ngọc chi), Hắc chi (màu đen, còn gọi là Huyền chi) và Tử chi (màu tím).
Loại mà chúng tôi dùng để thử khả năng kháng khuẩn là Linh chi đỏ có tên khoa học là Ganoderma lucidum Karst
Linh Chi là một loại nấm gỗ đặc trưng với cuống nấm lệch sang một bên, có hình tròn hoặc dẹt, dài từ 0,5 đến 3 cm Cuống nấm có khả năng phân nhánh và thường uốn khúc Lớp vỏ cuống nấm mang màu đỏ, nâu đỏ hoặc nâu đen, không có lông và phủ kín bề mặt tán nấm.
Mũ nấm non có hình trứng, khi trưởng thành chuyển sang hình thận, hình tròn hoặc hình quạt Bề mặt mũ nấm có những vân đồng tâm với màu sắc đa dạng từ vàng tranh, vàng nghệ, vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, đến nâu tím, bóng loáng như được đánh vecni Đường kính mũ nấm dao động từ 5-12cm và độ dày từ 0,8-1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm.
Nấm có thụ tầng màu trắng ngà, chuyển sang màu vàng khi già, với nhiều lỗ nhỏ li ti là các ống thụ tầng chứa bào tử Cấu trúc của nấm là một hệ sợi trong suốt, không màu, có đường kính từ 1 đến 3cm và không phân nhánh Khi nấm trưởng thành, bào tử được phát tán từ phiến nấm có màu nâu sẫm.
• Đặc điểm phân bố và nuôi trồng:
Nấm Linh Chi thường mọc hoang ở những vùng núi cao lạnh, đặc biệt là tại tỉnh Tứ Xuyên (Trung Quốc) và Đà Lạt (Việt Nam), cũng như nhiều địa điểm khác.
Gần đây, việc nuôi trồng nhân tạo đã phát triển mạnh mẽ trên toàn thế giới, với Nhật Bản và Hàn Quốc dẫn đầu Tại Việt Nam, nuôi trồng nhân tạo cũng đã trở nên phổ biến trong cộng đồng, mặc dù sản lượng hiện tại vẫn chưa cao.
Thời vụ nuôi trồng bắt đầu từ 15/1 đến 15/3 và từ 15/8 đến 15/9 d-ơng lịch với một số điều kiện nuôi trồng nh- sau [17]
- Nhiệt độ thích hợp: Giai đoạn nuôi sợi (20 0 C – 30 0 C), giai đoạn quả thể từ (22 0 C - 28 0 C)
- Độ ẩm: Độ ẩm cơ chất (60% - 62%), độ ẩm không khí (80% - 95%)
- Độ thoáng khí: Trong suốt quá trình nuôi hệ sợi và phát triển thể quả, nấm Linh chi luôn cần có sự thông thoáng tốt
Trong quá trình nuôi trồng, giai đoạn phát triển hệ sợi không yêu cầu ánh sáng, trong khi giai đoạn hình thành quả thể cần ánh sáng tán xạ từ mọi hướng Để đạt hiệu quả tối ưu, cường độ ánh sáng cần được cân đối và đồng đều từ các phía.
- Độ pH: Linh Chi thích nghi trong môi tr-ờng trung tính đến axit yếu (pH 5,5 - 7)
- Dinh d-ỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn xenlulozơ
Trong nấm Linh Chi có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, với hàm l-ợng rất cao, thuộc các nhóm hợp chất khác nhau
- Nhóm hợp chất Tecpennoit: Đặc biệt là Triterpen (chủ yếu thuộc nhóm lanostan), gồm có các axit Ganoderic A, B, C, D, E, F, G, L, H, I, K, L, M,
O, P, Q, R, S, T, U, V, X, Y và Z , các axit Lucidenic A, B, C, D, E, F, G , các Lucidon A, B, và C Các Ganodermanontriol, Ganodermatriol [7]
- Các loại Enzim: Lysozym, Protease acid và một số enzim khác nh- Lacase, Endopolygalacturonase, Celulase, Amylase [7]
Các nguyên tố khoáng vi lượng như Ca, Mg, Na, Mn, Fe, Zn, Cu và đặc biệt là Germanium đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe Nghiên cứu mới nhất từ Viện nghiên cứu Linh Chi hoang dại Trung Quốc cho thấy hỗn hợp 6 loại Linh Chi có hàm lượng Germanium cao hơn so với nhâm sâm từ 5 đến 10 lần.
- Ngoài ra còn có các hợp chất khác nh- : Alcaloit, Aminoaxit, axit béo nh- các axit Tetracosanoic, Stearic, Palmitic, Behenic [7]
- Có hàm l-ợng Ergesterol từ 0,3 - 0,4% [7]
- Theo nghiên cứu của Viện nghiên cứu Quảng Đông Trung Quốc thì một số chất trong nấm Linh Chi có hàm l-ợng nh- sau [19]
- N-ớc chiếm 12%, Licnhin 13 - 14%, hợp chất Nitơ 1,6 - 2,1%, hợp chất Phenol 0,8 - 1%, tro 0,022%, Xenlulozơ 54 - 56%, Chất béo 1,9 - 2%, Chất khử 4-5%
Khả năng ứng dụng nấm Linh chi trong y học
Theo tạp chí Cancer Recearch (UK) [30]
Linh Chi có một số tác dụng chữa bệnh sau đây:
- Phòng ngừa viêm cuống phổi
- Kháng viêm, kháng độc tố
- Chống ung bứu, kháng siêu vi
- Trợ tim, làm giảm cholesterol, làm dẻo thành động mạch
- Giúp th- giãn thần kinh, th- giãn bắp thịt
- Long đờm (nghiên cứu ở chuột)
- Tăng c-ờng hoạt động của nang th-ợng thận
Những đặc tính này có đ-ợc nhờ: beta hetoro - beta glucans có khả năng chống ung bứu, kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch Axit
Ganodermic triterpenes có khả năng kháng di ứng, hạ cholesterol, giảm huyết áp
Theo kinh nghiệm đông y, nấm Linh Chi được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý như suy nhược thần kinh, chóng mặt, mất ngủ, viêm phế quản mãn tính, bệnh bụi silic phổi lao, tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, bệnh động mạch vành tim, viêm gan, đau dạ dày, chán ăn, thấp khớp và thống phong Ngoài ra, nấm Linh Chi còn có thể được dùng để xông trị viêm mũi.
Nghiên cứu về ứng dụng nấm Linh chi trong y học đã được thực hiện qua nhiều thử nghiệm trên tế bào động vật và điều trị trực tiếp trên con người, cho thấy kết quả khả quan tại nhiều quốc gia Tại Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã ghi nhận những kết quả tích cực liên quan đến tác dụng của nấm Linh chi.
- Thăm dò tác động của bột sinh khối và bào tử nấm Linh chi
(Ganoderma lucidum Karst) lên cấu trúc mô học tinh hoàn chuột nhắt trắng
(Mus musculus L ) dòng Swiss bị chiếu xạ Do Nguyễn Thị Chính và Trinh Xuân Hậu Tr-ờng Đại học KHTN, Đại Học Quốc gia Hà Nội thực hiện [23]
- Kháo sát ảnh h-ởng của cao chiết nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) lên artemia và một số tế dòng bào ung th- Do Huỳnh Thị Lệ
Duyên và cộng sự Tr-ờng Đại học KHTN, Đại học Quốc gia TP HCM thực hiện [23]
Mặc dù nấm Linh chi có tiềm năng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh, nhưng nghiên cứu về khả năng này vẫn còn hạn chế và chưa được chú trọng nhiều.
Ch-ơng 2 Ph-ơng pháp nghiên cứu
Đối t-ợng nghiên cứu
Cao lỏng nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) được chiết xuất bằng nhiều dung môi khác nhau, bao gồm cao chiết nước, cao chiết cồn etylic 75%, cao chiết metanol và cao chiết cloroform.
* Các chủng vi khuẩn gây bệnh đ-ợc phân lập và định loại tại phòng
Vi sinh (Bệnh viện TW K71 – Tỉnh Thanh Hoá)
- Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)
- Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aerugins)
- PhÕ cÇu khuÈn (Streptococcus pneumoniae)
- Trùc khuÈn Gram ©m (Escherichia coli.)
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2007 đến tháng 5/2008 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh và Phòng thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Khoa Sinh - Đại học Vinh, cùng với Phòng Vi sinh của Bệnh viện K71 tại tỉnh Thanh Hoá.
Ph-ơng pháp nghiên cứu
Ph-ơng pháp phân lập và định loại
Tại Bệnh viện Trung ương K71 Thanh Hoá, các chủng vi khuẩn đã được phân lập và định loại bằng các bộ KIT chuyên dụng Cụ thể, bộ KIT Thanh API 20E được sử dụng để xác định các trực khuẩn Gram (-) thuộc họ Enterobactericeae, trong khi bộ KIT API 20NE được áp dụng cho các trực khuẩn Gram (-) không thuộc họ Enterobactericeae.
Ph-ơng pháp bảo quản giống vi khuẩn
Vi khuẩn đ-ợc bảo quản bằng môi tr-ờng thạch th-ờng (thạch thịt pepton) và môi tr-ờng canh thang Glucoza, trong điều kiện nhiệt độ thấp
• Môi tr-ờng thạch th-ờng
Công thức: N-ớc thịt: 1000 ml
Cao thịt: 1g NaCl tinh khiÕt: 5g Thạch sợi: 20g
- Pha chế: Cân đong đủ n-ớc thịt, cao thịt, muối và cho vào nồi đun nóng, sau đó cho thạch vào đun tan
- Kiểm tra và điều chỉnh pH (7,4 - 7,6) bằng NaOH 20%, lọc qua môi tr-ờng khi còn nóng, phân phối vào bình cầu, hấp khử trùng 110 0 C trong vòng 30 phút
• Môi tr-ờng canh thang Glucoza 0,2%
Để pha chế, cần cân đủ các thành phần môi trường và đun nóng nước thịt bò Sau đó, cho các thành phần vào nấu cho tan Điều chỉnh pH về 7,4 bằng NaOH 20% Cuối cùng, phân phối vào bình cầu và tiến hành hấp khử trùng ở 110°C trong một khoảng thời gian nhất định.
30 phút Yêu cầu: môi tr-ờng có màu vàng t-ơi, không lắng cặn
• Môi tr-ờng thạch máu
Công thức: Thạch th-ờng 250ml
Máu thỏ đã loại tơ huyết 15ml
Để pha chế môi trường thạch, trước tiên cần đun nóng 250ml môi trường thạch trong bình cầu và để nguội đến 50°C Sau đó, cho 15ml máu thỏ vào bình thạch và lắc đều để máu hòa tan hoàn toàn Cuối cùng, đổ môi trường vào đĩa Petri hoặc ống nghiệm, để ống nghiệm nằm nghiêng cho thạch đông lại.
Môi tr-ờng thạch máu và canh thang Glucoza dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn tr-ớc khi dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn.
Ph-ơng pháp chiết các loại cao từ nấm Linh chi
Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) được phơi khô ở nhiệt độ 50°C trong tủ sấy Dược liệu này có thể được nghiền nhỏ bằng máy nghiền công nghiệp hoặc thái lát mỏng nếu dùng để sắc nước.
+ Các loại dung môi: dung môi cồn etylic75%, dung môi metanol, dung môi Cloroform và dung môi n-ớc
Bộ chiết chuyên dụng cho phương pháp chiết liên tục, hay còn gọi là phương pháp chiết hồi lưu, bao gồm các dụng cụ cần thiết như hệ thống cất thu hồi dung môi, nồi nhiệt, giấy lọc và các dụng cụ thủy tinh khác.
• Tiến hành theo ph-ơng pháp chiết nóng:
Việc chiết d-ợc liệu đ-ợc tiến hành theo các ph-ơng pháp và điều kiện chiết xuất khác nhau đối với từng loại dung môi [5, 15]
Để chiết xuất dược liệu, cần chuẩn bị 150g dược liệu đã sấy khô và thái thành lát mỏng khoảng 0,5-1mm Sau đó, cho vào dụng cụ chiết và đun trong 24 giờ, chia thành 4 lần với thời gian khác nhau: lần 1 sắc trong 8 giờ, lần 2 trong 7 giờ, lần 3 trong 5 giờ và lần 4 trong 4 giờ Cuối cùng, gộp tất cả dịch chiết lại và tiến hành cất dung môi cho đến khi còn 50ml, tương đương với tỷ lệ cao 3:1 (3g dược liệu/1ml dịch chiết).
Dung môi được sử dụng bao gồm cồn 75%, metanol và cloroform, tất cả đều có nhiệt độ sôi thấp: metanol (T s d, 509 °C), cồn etylic (T s x, 100 °C) và cloroform (T s a, 15 °C) Dược liệu khô 150g được tán bột, đóng túi và chiết xuất bằng phương pháp chiết liên tục trong 12 giờ, chia thành 3 lần với thời gian khác nhau Dịch chiết của 3 lần được gộp lại, lọc và tiến hành cất thu hồi dung môi bằng dụng cụ cất thông dụng, cô đặc đến tỉ lệ cao lỏng (3:1).
Dịch chiết ở dạng cao lỏng có tỉ lệ (3:1) → tỉ lệ gốc (3 gam dựơc liệu/ 1ml dịch chiết) Đ-ợc bảo quản trong tủ lạnh
* Khối l-ợng d-ợc liệu, ph-ơng pháp chiết xuất, thời gian chiết xuất
Dung môi Khối l-ợng mÉu Thêi gian Sè lÇn chiÕt
Etylic 75% 150g 12 giờ 3 Chiết liên tôc 5 0 ml
C 3 H 7 (OH) 150g 12 giờ 3 Chiết liên tôc 50 ml
(CHCl 3 ) 150g 12 giờ 3 Chiết liên tôc 50 ml
+ Cao lỏng không bị cháy khét và lẫn tạp, bã d-ợc liệu
Ph-ơng pháp chiết xuất và xác định một số hoạt chất trong nấm
Saponins, flavonoids, sesquiterpene lactones, cardiac glycosides, and alkaloids were extracted and identified according to the references [5, 15].
Kỹ thuật thử hoạt tính kháng khuẩn
- Đĩa Petri có đ-ờng kính 9cm làm bằng thuỷ tinh trung tính đáy phẳng
- Bình cầu dùng để pha môi tr-ờng
- Panh, pipetman, que tăm bông vô khuẩn, đột thạch bằng đồng, que trang thuỷ tinh, th-ớc đo vòng vô khuẩn, tủ ấm b) Hoá chất:
• Dung dịch đệm: PBS hoặc n-ớc muối sinh lí 0,9% để pha huyền dịch vi khuẩn Công thức:
- N-íc cÊt: 1000 ml Lắc đều, điều chỉnh pH = 7,4, hấp -ớt 120 0 C 30 phút
- Dịch chiết n-ớc, hàm l-ợng: 150g/50 ml
- Dịch chiết metanol, hàm l-ợng: 150g/50 ml
- Dịch chiết cloroform, hàm l-ợng: 150g/50 ml
- Dịch chiết cồn etylic 75%, hàm l-ợng: 150g/50 ml
• Ph-ơng pháp pha dịch chiết
Dịch chiết nấm Linh chi đ-ợc chiết bằng các dung môi khác nhau, sau đó cô đến tỉ lệ cao 3:1 đây đ-ợc xem là tỉ lệ gốc
Từ tỉ lệ gốc đ-ợc pha loãng ra theo các tỉ lệ: (2:1); (1,5:1); (1:1) bằng n-ớc cất và dung môi thích hợp
* Ph-ơng pháp pha loãng ra các tỉ lệ cao khác nhau đ-ợc thể hiện trong bảng sau:
Tỉ lệ cao pha loãng
(2 : 1) ( 1,5 : 1) (1 : 1) + Tỉ lệ (3:1) t-ơng đ-ơng với: 3g d-ợc liệu/ 1ml dịch chiÕt
+ LÊy 10ml cao tõ 50ml cao gèc (3:1) Pha loãng bằng 5ml H 2 O cÊt -> ta đ-ợc tỉ lệ cao (2:1)
+ LÊy 10ml cao tõ 50ml cao gèc
Pha loãng bằng 10ml H 2 O cÊt >
Ta đ-ợc tỉ lệ cao (1,5 : 1)
+ LÊy 10ml cao tõ 50ml cao gèc Pha loãng bằng 20ml H 2 O cÊt >
Ta đ-ợc tỉ lệ cao
* Riêng với dung dịch cao lỏng CHCl 3 , việc pha loãng ra các nồng độ khác nhau, phải dùng dung môi là CHCl 3
• Môi tr-ờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi tr-ờng nuôi cấy là môi tr-ờng thạch máu và môi tr-ờng thạch th-ờng Pepton n-ớc thịt
Các môi tr-ờng có độ dày 4 - 4,5mm 25 - 30ml thạch với một đĩa petri cã ®-êng kÝnh 9 cm c) Vi khuÈn:
Dùng 6 chủng vi khuẩn thuần khiết, đã đ-ợc nuôi cấy trên môi tr-ờng thạch máu qua đêm
Ph-ơng pháp xác định l-ợng vi khuẩn:
• Ph-ơng pháp độ đục chuẩn:
Pha dung dịch vi khuẩn bắt đầu bằng việc sử dụng một đĩa thạch nuôi cấy thuần chủng đã mọc qua đêm Dùng que cấy vô khuẩn, chấm vào 10 khuẩn lạc để tạo thành một ống đầy, sau đó hòa tan vào 1ml dung dịch đệm PBS hoặc nước muối sinh lý Độ đục của dung dịch này được so sánh với chuẩn Mc, Parland 0,5, tương đương với 10^8 CFU/1ml (dung dịch 1) Tiếp theo, lấy 0,05ml hỗn dịch vi khuẩn đã chuẩn bị và hòa tan với 5ml nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều bằng máy lắc để tạo thành dung dịch tương đương 10^6 CFU/1ml (dung dịch 2).
• Ph-ơng pháp đột lỗ thạch
- Đặt đĩa thạch vào tủ ấm 15 phút cho khô mặt
- Pha dịch huyền phù vi khuẩn
- Dùng pipetman vô trùng có thể tích 1ml hút 0,5ml dịch huyền phù vi khuẩn cho lên trung tâm đĩa thạch
- Dùng que trang thủy tinh vô trùng, trang đều vi khuẩn khắp mặt thạch
- Dùng đột lỗ thạch đã khử trùng đục 6 lỗ trên mặt thạch, mỗi lỗ cách nhau 2cm và cách mép đĩa 1cm
- Dùng kim vô trùng lấy thạch đã đột ra khỏi đĩa
- Dùng Pipetman cho vào mỗi lỗ 0,4ml dung dịch chất thử đã pha loãng theo các nồng độ khác nhau
- Để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho dịch thử khuếch tán đều trong thạch
- Cho vào tủ ấm ở 37 0 C trong vòng 18 - 24 gìơ
• Ph-ơng pháp đặt khoanh giấy kháng sinh:
Ph-ơng pháp này áp dụng với loại cao đ-ợc chiết bằng dung môi hữu cơ nh- CHCl 3 [13]
- Khoanh giấy kháng sinh đ-ợc chế tạo từ giấy watman số 2, có đ-ờng kính từ 6 - 8 mm, theo qui định của d-ợc điển
- Khoanh giấy kháng sinh đ-ợc khử trùng trong tủ xấy ở 100 o C trong
1 giờ, sau đó đ-ợc bảo quản trong bình hút ẩm
Sử dụng pipetman vô trùng để hút 0,4ml dịch chiết đã pha loãng với các nồng độ khác nhau, sau đó nhỏ lên khoanh giấy lọc vô trùng Tiến hành làm bay hơi dung môi ở nhiệt độ thích hợp để đạt được kết quả tối ưu.
- Khoanh giấy tẩm dịch chiết đ-ợc đuợc bảo quản ở điều kiện vô
- Đặt 6 khoanh giấy kháng sinh lên các đĩa thạch đã cấy vi khuẩn, đối với đĩa có đ-ờng kính 9cm
Đặt các đĩa trong môi trường ngoài trong 1 giờ để dịch chiết khuyếch tán Sau đó, chuyển vào tủ ấm nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C Sau 18 đến 24 giờ, quan sát vòng vô khuẩn nếu có.
Ph-ơng pháp thu thập và xử lý số liệu
+ Đối với thạch đục lỗ: dùng xilanh hút hết dịch thử, dùng th-ớc kẻ li đo kích th-ớc vòng vô khuẩn (tính bằng mm)
+ So sánh đ-ờng kính vòng vô khuẩn của từng nồng độ pha loãng
+ So sánh đ-ờng kính vòng vô khuẩn của từng loại dịch chiết đ-ợc chiết bằng các dung môi khác nhau
+ Lập bảng và đồ thị trên phần mềm Microsolf Excel
Ch-ơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Hiệu suất chiết nấm Linh chi
Chúng tôi đã tiến hành tính toán khối lượng hợp chất chiết được từ 1ml dung dịch cao chiết sử dụng các dung môi khác nhau Kết quả cho thấy khối lượng hợp chất chiết thu được từ 1g dược liệu nấm Linh chi, được trình bày chi tiết trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Khối l-ợng hợp chất chiết đ-ợc trong 1g d-ợc liệu (DL) nấm Linh chi
Cao chiÕt cloroform Khối l-ợng hợp chất/1ml cao
80,0mg/1ml 90,0mg/1ml 80,5mg/1ml 90,0mg/1ml
Khối l-ợng hợp chất đ-ợc/1gDL
26,7mg/1gDL 30,0mg/1gDL 28,0mg/1gDL 30,0mg/1gDL
Kết quả từ bảng trên cho thấy nước và cloroform là hai dung môi có hiệu quả chiết xuất cao nhất, với khối lượng hợp chất thu được lần lượt là 30,0mg/1g dược liệu Tiếp theo là metanol với 28,0mg/1g dược liệu, trong khi cồn 75% cho hiệu quả thấp nhất, chỉ đạt 26,7mg/1g dược liệu.
Kết quả phân tích thành phần hoá học của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
Tại Phòng thí nghiệm Hoá sinh thuộc Khoa Sinh, Đại học Vinh, chúng tôi đã tiến hành các phản ứng đặc hiệu để xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh Chi, dựa trên tài liệu tham khảo.
Bảng 3.2: Kết quả phân tích định tính một số hợp chất có trong nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum)
Phản ứng Kết quả Kết luận
- Phản ứng Salkowski: Dung dịch có màu từ vàng đến hồng
- Phản ứng với NaOH (0,1N): tạo bọt
- Phản ứng với HCl (0,1N): tạo bọt
- Phản ứng với H 2 S0 4 đặc: dung dịch có màu vàng t-ơi
- Phản ứng với Na0H (10%): dung dịch có màu vàng cam
- Phản ứng với thuốc thử Mayer: tạo kết tủa bông trắng
- Phản ứng với thuốc thử Baljet: dd có màu vàng cam
5 Glycozit tim - Phản ứng với thuốc thử
Baljet: dd có mầu hồng xỉn
Table 2 indicates that Ganoderma lucidum, commonly known as Lingzhi mushroom, contains various bioactive compounds, including Saponins (both Steroidal and Triterpenoid types), cardiac Glycosides, Alkaloids, Sesquiterpene lactones, and Flavonoids, which are categorized into Isoflavonoids and Flavanones.
Kết quả nghiên cứu tính kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi đến các chủng vi khuẩn nghiên cứu
Cao chiết với dung môi là n-ớc (cao chiết n-ớc)
Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết n-ớc đối với các chủng vi khuẩn sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
Tỷ lệ pha loãng dịch cao chiÕt Đ-ờng kính vòng vô khuẩn (mm)
18 - 24 giê Sau 48 giê Sau 72 giê
Qua Bảng 3.3, chúng ta nhận thấy:
Tỉ lệ cao chiết nước (1:1) và (1,5:1) có khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus trong khoảng thời gian 18-24 giờ Tuy nhiên, sau 48 giờ, vòng vô khuẩn không còn tồn tại, cho thấy vi khuẩn đã phát triển trở lại với kích thước vòng vô khuẩn bằng 0.
Tỉ lệ cao chiết n-ớc 2:1 cho thấy khả năng ức chế đáng kể đối với Staphylococcus aureus, với kích thước vòng vô khuẩn đạt 20,5mm và giảm xuống bằng 0 sau 72 giờ Các chủng vi khuẩn khác cũng có kích thước vòng vô khuẩn bằng 0 sau 48 giờ, cho thấy hiệu quả ức chế mạnh mẽ của chiết n-ớc.
Tỉ lệ cao chiết n-ớc (3:1) cho thấy khả năng ức chế hiệu quả đối với các vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena và Escherichia coli sau khoảng thời gian 18-24 giờ Đặc biệt, sau 48-72 giờ, kích thước vòng vô khuẩn vẫn giữ nguyên, cho thấy tính ổn định của hoạt chất trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.
Nh- vậy, cao chiết n-ớc có tác dụng ức chế với 4 chủng vi khuẩn là:
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Klebsiella terrigena không ức chế được Streptococcus pneumoniae Tỉ lệ pha loãng 3:1 tạo ra kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất và ổn định trong 72 giờ theo dõi Các tỉ lệ pha loãng khác chỉ có hiệu quả với một số chủng vi khuẩn nhất định, kích thước vòng vô khuẩn không ổn định và có xu hướng giảm dần hoặc biến mất sau 48-72 giờ theo dõi.
Cao chiết với dung môi là cồn etyli 75% (cao chiết cồn)
Qua Bảng 3.4, ta nhận thấy:
Tỉ lệ cao chiết cồn 1:1 và 1,5:1 cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus chỉ sau 18-24 giờ Sau 48 giờ theo dõi, kích thước vòng vô khuẩn ghi nhận là 0.
- Tỉ lệ cao chiết cồn (2 : 1) có khả năng ức chế Staphilococcus aureus và
Klebsiella terrigena sau 18 - 24 giờ; kích th-ớc vòng vô khuẩn bằng (0) sau 48 giê theo dâi
Tỉ lệ cao chiết cồn (3:1) có khả năng ức chế hiệu quả hai chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Klebsiella terrigena trong khoảng thời gian 18 - 24 giờ Kích thước vòng vô khuẩn không có sự thay đổi đáng kể sau 48 - 72 giờ theo dõi.
Bảng 3.4: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cồn đối với các chủng vi khuẩn sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
Tỷ lệ pha loãng dịch cao chiÕt Đ-ờng kính vòng vô khuẩn (mm)
18 - 24 giê Sau 48 giê Sau 72 giê
Cao chiết cồn etylic 75% có khả năng ức chế hiệu quả hai chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Klebsiella terrigena, nhưng không có tác dụng với Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Streptococcus pneumoniae Tỉ lệ 3:1 tạo ra kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất và kích thước này duy trì ổn định sau 72 giờ theo dõi Trong khi đó, các tỉ lệ pha loãng cao hơn dẫn đến kích thước vòng vô khuẩn nhỏ hơn, và sau 48 giờ, kích thước này trở về 0.
Cao chiết với dung môi là metanol (cao chiết metanol)
Bảng 3.5: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết metanol đối với các chủng vi khuẩn sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
Tỷ lệ pha loãng dịch cao chiÕt Đ-ờng kính vòng vô khuẩn (mm)
18 - 24 giê Sau 48 giê Sau 72 giê
Qua Bảng 3.5 ở trên chúng ta nhận thấy:
Tỉ lệ chiết xuất metanol 1:1 và 1,5:1 cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus sau 18-24 giờ Đặc biệt, sau 48 giờ, kích thước vòng vô khuẩn đạt giá trị 0.
- Tỉ lệ cao chiết metanol (2:1) có khả năng ức chế với 3 chủng vi khuẩn là:
Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella terrigena sau 18-
24 giờ Sau 48 giờ kích th-ớc vòng vô khuẩn của Pseudomonas aeruginosa bằng
(0), còn của Staphilococcus aureus và Klebsiella terrigena đều giảm xuống; sau
- Tỉ lệ cao chiết metanol (3:1) có khả năng ức chế đối với 4 chủng là:
Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena và Escherichia coli sau 18- 24 giờ và kích th-ớc vòng vô khuẩn vẫn không thay đổi sau 48 -72h
Cao chiết metanol cho thấy khả năng ức chế đối với bốn chủng vi khuẩn thử nghiệm: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena và Escherichia coli, nhưng không có tác dụng đối với Streptococcus pneumoniae Tỷ lệ 3:1 tạo ra kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất và không thay đổi sau 72 giờ theo dõi Các tỷ lệ pha loãng khác chỉ ức chế một số chủng nhất định và sau 48-72 giờ, kích thước vòng vô khuẩn đều giảm xuống còn 0.
3.3.4 Cao chiết với dung môi là cloroform (CHCl 3 ) (cao chiết cloroform)
Qua Bảng 3.6 chúng ta nhận thấy :
- Tỉ lệ cao chiết (1:1), (2:1), (1,5:1) có khả năng ức chế đối với
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella terrigena và Escherichia coli sau 18 - 24 giờ không làm thay đổi kích thước vòng vô khuẩn; tuy nhiên, Staphylococcus aureus giữ nguyên kích thước sau 72 giờ, trong khi các chủng còn lại bắt đầu thu hẹp kích thước vòng vô khuẩn sau 72 giờ.
Tỉ lệ cao chiết 3:1 cho thấy khả năng ức chế hiệu quả đối với các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella terrigena và Escherichia coli sau 18 - 24 giờ Kích thước vòng vô khuẩn của cả bốn chủng vi khuẩn này không thay đổi sau 72 giờ theo dõi.
Nh- vậy, cao chiết clorform có tác dụng ức chế đối với 4 chủng đ-ợc thử nghiệm là: Staphilococcus aureus, Klebsiella terrigena, Escherichia coli,
Streptococcus pneumoniae không có khả năng ức chế Pseudomonas aeruginosa Tỉ lệ chiết clorform 3:1 tạo ra kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất và không thay đổi sau 72 giờ theo dõi Trong khi đó, với các tỉ lệ pha loãng khác, kích thước vòng vô khuẩn giữ nguyên sau 48 giờ, nhưng bắt đầu giảm sau 72 giờ.
Bảng 3.6: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cloroform đối với các chủng vi khuẩn sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
Tỷ lệ pha loãng dịch cao chiÕt Đ-ờng kính vòng vô khuẩn (mm)
18 - 24 giê Sau 48 giê Sau 72 giê
1 : 1 17,5 mm 17,5 mm 16,5 mm 1,5 : 1 18,7 mm 18,7 mm 17,5 mm
Một số đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết
ảnh h-ởng của độ pha loãng đến hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết
§èi víi cao chiÕt n-íc:
Biểu đồ 3.1 ảnh h-ởng của độ pha loãng đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết n-ớc
Đối với cao chiết cồn:
Biểu đồ 3.2 ảnh h-ởng của độ pha loãng đến hoạt tính kháng khuẩn
Tỷ lệ pha loãng (cao : n-íc) Đ - ờ n g k ín h v ò n g k h á n g k h u ẩ n ( m m )
Tỷ lệ pha loãng (cao : cồn) Đ - ờ n g k ín h v ò n g k h á n g k h u ẩ n ( m m )
§èi víi cao chiÕt metanol:
Biểu đồ 3.3 ảnh h-ởng của độ pha loãng đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết metanol
§èi víi cao chiÕt cloroform:
Biểu đồ 3 4 ảnh h-ởng của độ pha loãng đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cloroform
Tỷ lệ pha loãng (cao : n-ớc) Đ - ờ n g k ín h vò n g k h á n g kh u ẩ n (m m )
Tỷ lệ pha loãng (cao :cloroform) Đ -ờng k ính v òng k háng k huẩn (m m )
Qua Biểu đồ 3.1; 3.2; 3.3 và 3.4, cho thấy:
Kích thước vòng vô khuẩn và thời gian tồn tại của nó tỉ lệ thuận với độ đậm đặc của các loại cao chiết Trong nghiên cứu, tỷ lệ 3:1 cho cả 4 loại cao chiết đã đạt kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất, và kích thước này duy trì ổn định sau 72 giờ theo dõi.
Khi tỉ lệ pha loãng của cao chiết tăng lên, khả năng ức chế vi khuẩn sẽ giảm xuống, chỉ ảnh hưởng đến một số chủng nhất định tùy thuộc vào loại cao Đồng thời, kích thước vòng vô khuẩn cũng giảm, và sau 48 hoặc 72 giờ, kích thước vòng vô khuẩn có thể đạt giá trị bằng 0.
Đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao qua độ pha loãng tối thiểu có thể gây ức chế
loãng tối thiểu có thể gây ức chế
Bảng 3.7 Độ pha loãng tối thiểu của các loại cao có thể gây ức chế các chủng vi khuẩn
Tỷ lệ pha loãng tối thiểu có thể gây ức chế vi khuẩn
(Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn) Cao chiÕt n-íc
(22,5 mm) Qua Bảng 3.7, chúng ta nhận thấy rằng:
Nghiên cứu về vi khuẩn Staphylococcus aureus cho thấy, với tỷ lệ chiết xuất cao (1:1) của bốn loại cao, khả năng ức chế vi khuẩn được ghi nhận, tạo ra vòng vô khuẩn Kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất được quan sát ở cao chiết nước (17,5mm) và cao chiết chloroform (30,5mm).
Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa yêu cầu tỉ lệ tối thiểu 2:1 để xuất hiện vòng vô khuẩn Chỉ có cao chiết cồn và metanol ở tỉ lệ này mới tạo ra vòng vô khuẩn, trong khi cao chiết nước lại cho kích thước vòng vô khuẩn lớn hơn, đạt 16,0 mm.
Tỉ lệ tối thiểu có khả năng ức chế vi khuẩn Escherichia coli được xác định là 1:1 với cao chiết cloroform, 3:1 với cao chiết n-ước và cao chiết cồn 75%.
- Với Klebsiella terrigena thì tỉ lệ tối thiểu có khả năng ức chế là tỉ lệ
(1:1) với cao chiết cloroform và tỉ lệ (2:1) với 3 loại cao chiết còn lại, trong đó cao chiết n-ớc cho kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn nhất (20,0 mm)
Tỉ lệ tối thiểu của cao chiết cloroform cần thiết để ức chế Streptococcus pneumoniae là 1:1, với kích thước vòng vô khuẩn đạt 22,5 mm.
Nh- vậy, tỉ lệ tối thiểu có khả năng gây ức chế đối với các chủng vi khuẩn của từng loại cao là không giống nhau.
So sánh hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết ở tỉ lệ (3:1)
Trong số 4 tỉ lệ pha loãng đã được nghiên cứu, tỉ lệ (3:1) cho thấy nồng độ cao chiết đậm đặc nhất và hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ nhất, với vòng kháng khuẩn ổn định sau 72 giờ theo dõi Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của từng loại cao chiết ở tỉ lệ (3:1) lại có sự khác biệt rõ rệt đối với từng loại vi khuẩn, như được thể hiện qua Bảng 3.8 và Biểu đồ 3.5.
Bảng 3.8 So sánh hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao ở tỷ lệ (3 : 1)
Tên chủng vi khuÈn Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn (mm) Cao n-íc
Cao cồn Cao metanol Cao cloroform
Staphilococcus aureus 28,0 mm 22,5 mm 24,5 mm 39,5 mm
Escherichia coli 19,0 mm - 20,0 mm 21,7 mm
Klebsiella terrigena 21,0 mm 18,5 mm 19,5 mm 20,7 mm
Biểu đồ 3.5 So sánh hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao ở tỷ lệ (3:1)
- Với tỉ lệ cao chiết n-ớc (3:1) thì Staphilococcus aureus cho kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn nhất (28mm) sau đó đến Pseudomonas aeruginosa và
St ap hi lo co cc us a ur eus
Ps eudo m ona s a er ugi no sa
Es che ric hi a c ol i
K le bs ie lla te rr ige na
St re pt oc oc cus p ne um oni ae Đ - ờn g k ín h vòn g vô k h u ẩn ( m m )
Cao chiÕt n-ícCao chiết cồnCao chiÕt metanolCao chiÕt cloroform
Klebsiella terrigena, cuối cùng là Escherichia coli; còn Streptococcus pneumoniae cho kết quả âm tính
- Với cao chiết cồn (3:1) chỉ có khả năng ức chế Staphilococcus aureus và
Klebsiella terrigena với kích th-ớc vòng vô khuẩn là (22,5 mm) và (18,5 mmm) Các chủng còn lại cho kết quả âm tính
- Với cao chiết metanol (3:1) có khả năng ức chế 4 chủng vi khuẩn là:
Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena và Escherichia coli Trong đó, Staphilococcus aureus có kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn nhất (24,5mm); tiếp theo là Pseudomonas aeruginosa (20,5 mm);
Escherichia Coli (20,0mm) và thấp nhất là Klebsiella terrigena (19,5 mm)
- Với cao chiết cloroform (3:1), không có tác dụng ức chế đối với
Pseudomonas aeruginosa có khả năng ức chế hiệu quả đối với bốn chủng vi khuẩn khác, trong đó Staphylococcus aureus có kích thước vòng ức chế lớn nhất đạt 39,5 mm, tiếp theo là Streptococcus pneumoniae với 26,7 mm, Escherichia coli 21,7 mm, và cuối cùng là Klebsiella terrigena với kích thước vòng ức chế nhỏ nhất là 20,7 mm.
Nh- vậy, đối với mỗi loại vi khuẩn thì tác động kháng khuẩn của mỗi loại cao có sự khác nhau, trong đó:
+ Đối với Staphilococcus aureus, cao chiết cloroform cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (39,5mm), sau đó đến cao chiết n-ớc (28,0mm)
+ Đối với Pseudomonas aeruginosa, cao chiết n-ớc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (21,0 mm), sau đó đến cao chiết metanol (20,5 mm)
+ Đối với Escherichia coli, cao chiết cloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (21,7 mm), sau đó đến cao chiết metanol (20,0 mm)
+ Đối với Klebsiella terrigena, cao chiết n-ớc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (21,0 mm), sau đó đến cao chiết (20,7 mm)
+ Đối với Streptococcus pneumoniae, cao chiết cloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (26,7 mm)
Kết luận và đề nghị
Kết quả nghiên cứu về các loại cao chiết từ nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) với 5 chủng vi khuẩn gây bệnh nh- sau:
1 Trong số 4 loại dung môi dùng để chiết cao thì: N-ớc và cloroform là hai dung môi cho hiệu quả chiết cao nhất, với khối l-ợng hợp chất thu đ-ợc là (30,0mg/1gDL), tiếp đến là metanol (28,0mg/1gDL) và thấp nhất là cồn 75% (26,7mg/1gDL)
2 Đã xác đ-ợc một số hợp chất có hoạt tính sinh học có trong nấm
Linh chi contains various bioactive compounds, including two types of saponins: steroid saponins and triterpenoid saponins It also comprises cardiac glycosides, alkaloids, sesquiterpene lactones, and flavonoids, which are categorized into isoflavonoids and flavanones.
3 Cao chiết từ nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella terigena, Escherichia coli và Klebsiella terrigena được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm với mức độ khác nhau, tùy thuộc vào loại cao chiết và tỷ lệ pha loãng được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính.
Cao chiết n-ớc exhibits inhibitory effects against four bacterial strains: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and Klebsiella terrigena However, it is ineffective against the Streptococcus pneumoniae strain.
Ethanol extract at 75% concentration effectively inhibits two bacterial strains, Staphylococcus aureus and Klebsiella terrigena However, it shows no inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and Streptococcus pneumoniae.
- Cao chiết metanol có khả năng ức chế đối với 4 chủng vi khuẩn là:
Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena và Escherichia coli; không có khả năng ức chế đối với Streptococcus pneumoniae
- Cao chiết clorform có tác dụng ức chế đối với 4 chủng vi khuẩn là:
Staphilococcus aureus, Klebsiella terrigena, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae; không có khả năng ức chế đối với Pseudomonas aeruginosa
4 Tỉ lệ pha loãng của các loại cao chiết ảnh h-ởng trực tiếp đến khả năng kháng khuẩn, thể hiện qua kích th-ớc và thời gian tồn tại của vòng vô khuẩn Đối với cả 4 loại cao chiết, tỉ lệ (3:1) cho vòng vô khuẩn đạt kích th-ớc lớn nhất và kích th-ớc này không thay đổi sau 72 giờ theo dõi Khi tỉ lệ pha loãng tăng lên thì tuỳ thuộc vào loại cao chiết và chủng vi khuẩn mà kích th-ớc vòng vô khuẩn có thể giảm xuống hoặc bằng (0) sau 48 – 72 giờ theo dõi
5 Dựa vào hoạt tính kháng khuẩn và hiệu quả chiết xuất cao từ nấm
Trong nghiên cứu của chúng tôi, loại cao sử dụng tốt nhất cho từng chủng vi khuẩn được xác định như sau: đối với Staphylococcus aureus, cao chiết cloroform và cao chiết nước với tỉ lệ 3:1; đối với Pseudomonas aeruginosa, cao chiết nước tỉ lệ 3:1; đối với Escherichia coli, cao chiết cloroform tỉ lệ 3:1; đối với Klebsiella terrigena, cao chiết nước tỉ lệ 3:1; và đối với Streptococcus pneumoniae, cao chiết cloroform tỉ lệ 3:1.
Do thời gian thực hiện đề tài ngắn, còn nhiều hạn chế và vấn đề chưa được giải quyết Vì vậy, đề tài cần được tiếp tục nghiên cứu theo các hướng phát triển mới.
- Mở rộng thử nghiệm đối với các vi khuẩn gây bệnh khác ở ng-ời
Nấm Linh chi chứa nhiều thành phần hoá học quan trọng, trong đó có các hoạt chất có khả năng ức chế vi khuẩn Việc phân tích chi tiết các thành phần này giúp xác định rõ ràng những hoạt chất cụ thể trong nấm Linh chi có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả.
Nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tách chiết các hợp chất từ nấm Linh chi nhằm phát triển phương pháp điều trị cho từng loại bệnh Việc này không chỉ giúp tối ưu hóa hiệu quả của các hợp chất mà còn mở ra hướng đi mới trong y học cổ truyền và hiện đại.
