Nghiên cứu quy trình điều chế cao chiết giàu baicalin từ vỏ thân cây núc nác quy mô phòng thí nghiệm

TỔNG QUAN

Vài nét về Núc nác

1.1.1 Tên gọi và phân bố

Oroxylum indicum L., thuộc họ Chùm ớt (Bignoniaceae)

Cây mọc hoang và được trồng ở khắp nơi nước ta, ở miền Bắc cũng như ở miền Nam Cây còn mọc ở Trung Quốc, Malaysia, Ấn Độ, Lào, Campuchia [5]

Cây có chiều cao từ 7 đến 12 mét, có thể đạt tới 20 – 25 mét, với thân nhẵn và ít phân nhánh Vỏ cây có màu xám tro, trong khi mặt trong có màu vàng Lá cây được xẻ thành 2 – 3 tầng lông chim, với lá chét hình bầu dục, nguyên, đầu nhọn, kích thước dài từ 7,5 – 15 cm và rộng từ 5 – 6,5 cm Hoa của cây có màu nâu đỏ sẫm, mọc thành chùm dài khoảng 10 cm ở đầu cành, với 5 nhị, trong đó có một nhị nhỏ hơn Quả nang lớn, dài từ 50 – 80 cm, rộng từ 5 – 7 cm, bên trong chứa hạt và được bao quanh bởi một màng mỏng, bóng và trong, có hình chữ nhật.

Bộ phận dùng là vỏ cây Vỏ sau khi bóc thì được làm khô ngay Vỏ dày trên

1 mm, mặt ngoài màu vàng nâu, mặt trong màu vàng nhạt, vị đắng

Để thu hoạch hạt, cần hái những quả đã chín vào cuối thu, sau đó phơi khô và đập để lấy hạt Cuối cùng, hạt cần được phơi lại cho thật khô, tuy nhiên hạt có vị đắng và không có mùi.

The leaves of the Núc nác tree are rich in flavonoids, including Chrysin, Oroxylin A, Scutellarin, and Baicalein Through methanol and ethyl acetate extraction methods, these flavonoids can be effectively isolated using high-speed counter-current chromatography (HSCCC) The identified flavonoids include Chrysin, Baicalein, Baicalein-7-O-glucoside, Baicalein-7-O-diglucoside, Chrysin-7-O-glucuronide, Baicalein-7-O-glucuronide, and Chrysin-diglucoside.

The bark of the Nuc Nac tree is rich in various compounds, including flavonoids, tannins, and sterols at moderate concentrations, along with lower levels of alkaloids, saponins, lignin, fats, and oils Notably, it contains ellagic acid and key flavonoids such as baicalin, chrysin, oroxylin A, scutellarin, and baicalein, as well as other flavonoids like 8,8''-bisbaicalein, 5,7-dihydroxyflavone, hispidulin, and chrysin-7-O-β-D-glucuronide.

Viện Dược liệu thuộc Bộ Y tế Việt Nam nghiên cứu vỏ thân Núc nác Việt Nam và đã phân lập được 2 chất là baicalein và oroxylin A [2]

Hạt cây Núc nác chứa nhiều flavonoid quan trọng như chrysin, baicalein, baicalein-7-O-glucoside, oroxylin B, scutellarein 7-O-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside, oroxin C và oroxin D Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện cả ở Việt Nam và trên thế giới về thành phần hóa học của cây Núc nác, đặc biệt là vỏ thân cây, cho thấy rằng flavonoid là thành phần hóa học chính của cây này.

Tổng quan về baicalin

Baicalin là một hợp chất glucuronic của baicalein

Tên khoa học: 5, 6-Dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H-chromen-7-yl-β-D- glucopyranosidurinic acid

Tan trong NN-dimethylformamid, pyridine, và dung dịch natri hydroxyd, cũng như các dung dịch kiềm khác; tuy nhiên, trong dung dịch kiềm, chất này thường không ổn định và dễ bị chuyển sang màu nâu đen.

- Tan ít trong acid acetic nóng, khó tan trong dung dịch acid, aceton

- Hầu như không tan trong ethyl ether, benzen, chloroform

- Nhiệt độ nóng chảy 203~205ºC

- Cực đại hấp thụ UV trong methanol: 242, 271, 310 nm

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Baicalein và Baicalin

Baicalin ức chế sự liên kết của chemokin với bạch cầu, hạn chế di chuyển của chúng tới tổ chức viêm Khi kết hợp baicalin với chemokin interleukin-8 (IL-8), sự xâm nhập của bạch cầu trung tính giảm xuống Baicalin không cạnh tranh trực tiếp với chemokin để liên kết với thụ thể, mà hoạt động thông qua việc gắn kết chọn lọc với các phối tử chemokin Nó liên kết chéo với nhựa oxim của các chemokin CXC, CC, và C Đặc biệt, baicalin không tương tác với CX3C chemokin hay các cytokine khác như TNF-α và IFN-γ, cho thấy tính chọn lọc trong hoạt động của nó.

Baicalin có khả năng chống virus bằng cách điều chỉnh chức năng protein NS1, một protein đã được chứng minh là có khả năng ức chế phản ứng kháng virus của tế bào thông qua việc giảm cảm ứng interferon và tăng cường tín hiệu phosphoinositide 3-kinase/Akt Bằng cách phá vỡ liên kết NS1-p85β, Baicalin làm thay đổi chức năng của NS1, từ đó kích hoạt phản ứng kháng virus của tế bào thông qua cảm ứng interferon.

Nghiên cứu của Hai-yan Zhu và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng baicalin có hoạt tính chống virus mạnh đối với virus cúm A H3N2 bằng cách ức chế tín hiệu mTOR, dẫn đến hiện tượng "tự chết" của tế bào Tuy nhiên, baicalin có khả năng ngăn chặn hiện tượng này, cho thấy rằng việc điều chỉnh quá trình "tự chết" đóng vai trò quan trọng trong khả năng chống virus của baicalin Việc ức chế "tự chết" của tế bào chủ do nhiễm virus có thể là một cơ chế chống virus tiềm năng của baicalin và một số loại thuốc dược liệu khác.

 Tác dụng chống oxy hóa:

Baicalin có tính chất chống oxy hóa mạnh mẽ, được chứng minh qua khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH và thí nghiệm chelat hóa với sắt Kết quả cho thấy baicalin có tác dụng chống oxy hóa vượt trội hơn hẳn so với axit ascorbic và butylated hydroxytoluene (BHT).

 Tác dụng chống ung thư:

Trong nghiên cứu gần đây, Yang Yu và cộng sự đã chỉ ra rằng baicalin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan, đặc biệt là hai dòng tế bào Hep G2 và SMMC-7721, với hiệu quả ức chế phụ thuộc vào liều lượng Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng cơ chế ức chế này diễn ra thông qua việc gián đoạn pha S của chu kỳ tế bào, giai đoạn quan trọng liên quan đến quá trình tổng hợp DNA trước khi nguyên phân.

Cyclin A và CDK2 đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình chuyển tiếp từ pha S đến nguyên phân, nhưng mức độ của chúng giảm khi điều trị bằng baicalin Nghiên cứu của Franky cho thấy baicalin có tác động ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt như DU145, PC-3, LNCaP và CA-HPV-10 Kết quả cho thấy sự nhạy cảm với baicalin khác nhau giữa các dòng tế bào, trong đó DU145 nhạy cảm nhất và LNCaP kém nhạy cảm nhất Baicalin ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào DU145 ở nồng độ 150 μM trở lên, và sự ức chế này liên quan đến quá trình apoptosis sau một thời gian ngắn tiếp xúc với baicalin.

1.2.3 Một số sản phẩm chứa baicalin

Với nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý của baicalin, một số nghiên cứu phát triển baicalin dưới dạng thành phẩm được tiến hành

Silvia Mir-Palomo đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong việc bào chế baicalin để điều trị viêm da Do baicalin có độ hòa tan trong nước kém và tính thấm qua da thấp, việc kết hợp baicalin vào các túi phospholipid là giải pháp hiệu quả để cải thiện tác dụng tại chỗ Nghiên cứu cho thấy baicalin được kết hợp trong các túi nhỏ (~ 67 nm), đơn phân tán với nồng độ tăng dần đến độ bão hòa Kết quả in vivo cho thấy các nano chứa baicalin có hoạt động chống viêm đáng kể với nồng độ từ 2,5 đến 10 mg/mL, làm giảm tổn thương da do phorbol ester (TPA) gây ra, thậm chí so với dexamethasone, một loại thuốc tổng hợp chống viêm Tổng thể, hệ nano đã cải thiện khả năng thấm của baicalin qua da trong điều trị viêm da.

Trong những năm gần đây, sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ dược liệu, đặc biệt là baicalin, đã phát triển mạnh mẽ tại Trung Quốc Các nghiên cứu cho thấy baicalin có nhiều tác dụng tích cực, bao gồm khả năng làm trắng da và chống nắng hiệu quả.

Baicalin là một thành phần quan trọng trong mỹ phẩm, được công nhận nhờ khả năng giảm hình thành dầu trên da mà không gây ra phản ứng dị ứng, đồng thời làm giảm đáng kể melanin Nghiên cứu cho thấy baicalin được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc da và chống dị ứng Nhiều sản phẩm chăm sóc sức khỏe hiện nay chứa baicalin và được đánh giá cao, như được chỉ ra trong nghiên cứu về việc xác định baicalin trong mỹ phẩm và kem đánh răng bằng phương pháp chiết xuất pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Bảng 1.1 Kết quả phân tích baicalin trong một số sản phẩm chăm sóc sức khỏe [14]

STT Sản phẩm Hàm lượng baicalin (mg/kg)

4 Kem đánh răng làm trắng 25,4

5 Kem đánh răng cổ truyền

Một số phương pháp chiết xuất và làm giàu baicalin

1.3.1 Một số phương pháp chiết xuất baicalin

Nghiên cứu năm 1999 đã xác định điều kiện tối ưu cho phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (SFE) flavonoid từ Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) Nghiên cứu khảo sát nhiệt độ, áp suất và các loại đồng dung môi khác nhau Kết quả cho thấy, với 1g dược liệu, lượng baicalin thu được từ phương pháp SFE đạt 137,6 mg/g, cao hơn so với 113,5 mg/g từ phương pháp siêu âm thông thường Các điều kiện tối ưu của SFE được xác định là sử dụng carbon dioxide siêu tới hạn kết hợp với MeOH và nước theo tỷ lệ 20: 2,1: 0,9, ở nhiệt độ 508ºC và áp suất 200 bar.

Năm 2007, Zhou và cộng sự đã tối ưu hóa quá trình chiết xuất baicalin từ Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis G.) bằng ethanol, nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian chiết, nồng độ EtOH và tốc độ khuấy đến hiệu suất chiết baicalin với quy mô 5 g dược liệu/mẻ Phương pháp HPLC được sử dụng để phân tích baicalin trong dịch chiết Kết quả cho thấy các thông số tối ưu là nhiệt độ 80°C, thời gian 1 giờ, nồng độ EtOH 60% và tốc độ khuấy 400 vòng/phút, đạt hiệu suất chiết baicalin lên đến 83,90%.

Nghiên cứu về chiết xuất flavonoid từ Scutellaria baicalensis Georgi đã thành công trong việc chiết xuất baicalin nhanh chóng bằng chất lỏng ion và vi sóng Chất lỏng ion, bao gồm các cation hữu cơ cồng kềnh và anion vô cơ hoặc hữu cơ, tồn tại ở trạng thái lỏng tại nhiệt độ phòng và có nhiều đặc tính lý hóa nổi bật như độ nhớt điều chỉnh, ổn định nhiệt tốt, khả năng hòa trộn với dung môi hữu cơ và nước, cùng khả năng truyền và hấp thụ vi sóng hiệu quả Những đặc tính này cho thấy chất lỏng ion có tiềm năng lớn trong việc làm dung môi chiết xuất dược liệu Hơn nữa, các đặc tính hóa lý của chất lỏng ion phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất các chất phân tích mục tiêu.

Chất lỏng ion loại 1-alkyl-3-metylimidazolium với các anion và độ dài chuỗi alkyl khác nhau đã được nghiên cứu nhằm tìm ra dung môi tối ưu để chiết baicalin từ Hoàng cầm Kết quả cho thấy, 1-octyl-3-methylimidazolium bromid là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhất và được chọn làm dung môi tối ưu So sánh với các phương pháp chiết khác, kết quả thu được đã chỉ ra sự vượt trội của phương pháp này.

Bảng 1.2 Kết quả so sánh một số phương pháp chiết xuất baicalin [48]

Quy mô Phương pháp Điều kiện Lượng baicalin thu được

1 g dược liệu Chiết hồi lưu, dung môi nước

1 g dược liệu Chiết siêu âm, dung môi nước

1 g dược liệu Chiết hồi lưu, dung môi chất lỏng ion

1 g dược liệu Chiết siêu âm, dung môi chất lỏng ion

Chiết baicalin từ Hoàng cầm bằng phương pháp siêu âm kết hợp với chất lỏng ion 1-octyl-3-methylimidazolium bromid cho thấy hiệu suất tối ưu và thời gian chiết ngắn nhất.

Nghiên cứu của Huilin Ni và cộng sự (2018) đã tối ưu hóa quy trình chiết xuất baicalin từ cây Hoàng cầm bằng nước, sử dụng thiết kế thử nghiệm trực giao L9(3) 4 Các yếu tố như tỷ lệ dung môi chiết, thời gian chiết và thời gian ngâm đã được khảo sát để tối ưu hóa hiệu suất chiết baicalin Phương pháp HPLC được áp dụng để xác định hiệu suất chiết xuất, trong khi phân tích phương sai được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của ba yếu tố này Kết quả cho thấy tỷ lệ dung môi – dược liệu là yếu tố quyết định để đạt hiệu suất chiết tối ưu, với các điều kiện tối ưu là tỷ lệ 1:12, thời gian chiết 30 phút và thời gian ngâm 1 giờ.

1.3.2 Một số phương pháp làm giàu baicalin

Năm 2012, Zhanquan Du và cộng sự đã nghiên cứu việc sử dụng nhựa HPD-100 để hấp phụ baicalin từ dịch chiết Hoàng cầm, cho thấy nhựa này có đặc tính hấp phụ và giải hấp tốt nhất trong số mười loại nhựa được thử nghiệm Các đường đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich được áp dụng để mô tả tương tác giữa chất tan và nhựa ở các nhiệt độ khác nhau Qua các thử nghiệm, hàm lượng baicalin sau khi xử lý bằng nhựa HPD-100 tăng 3,6 lần với năng suất thu hồi đạt 85,7% Kết quả cho thấy quá trình hấp phụ và giải hấp trên nhựa HPD-100 là phương pháp hiệu quả để làm giàu baicalin.

Nghiên cứu chiết xuất bốn flavonoid chính trong Radix Scutellariae bằng phương pháp chiết xuất vi sóng hỗ trợ dung môi eutecti (NADES-MAE) cho thấy dung môi eutecti gồm choline clorua và axit lactic có khả năng chiết xuất hiệu quả ba flavonoid: baicalin, wogonoside, baicalein và wogonin Các tham số của NADES-MAE đã được thử nghiệm và tối ưu hóa, trong đó việc sử dụng nhựa macroporous ME-2 để làm giàu baicalin từ dịch chiết đạt hiệu suất thu hồi lên đến 84,1%.

Các nghiên cứu toàn cầu chủ yếu tập trung vào việc chiết xuất và làm giàu baicalin từ dược liệu Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) Tuy nhiên, Núc nác cũng là một nguồn nguyên liệu chứa flavonoid baicalin, với hàm lượng khác nhau tùy thuộc vào bộ phận cây và địa điểm thu hái Nghiên cứu về Núc nác thu tại Thái Lan cho thấy hàm lượng baicalin trong hạt dao động từ 3,66% đến 6,89%, trong khi quả non có 0,19% và hoa chỉ 0,04% Đặc biệt, hàm lượng baicalin trong vỏ thân cây Núc nác vẫn chưa được đánh giá.

12 hái tại Việt Nam, cũng như quy trình chiết xuất và làm giàu thành phần này từ vỏ thân Núc nác.

Giới thiệu về tối ưu hóa quy trình

Tối ưu hóa quy trình là việc xác định các công thức, thông số và điều kiện cần thiết để sản phẩm đạt chất lượng tối ưu, đáp ứng mong muốn của người thực hiện thí nghiệm.

Việc thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa gồm những bước cơ bản sau:

Để tối ưu hóa hiệu quả, cần xác định rõ các biến đầu ra (biến phụ thuộc) và yêu cầu của chúng, bao gồm các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm, giá thành, lượng nguyên liệu và năng lượng tiêu thụ.

- Xác định các biến đầu vào (biến độc lập) có khả năng ảnh hưởng đến các biến đầu ra

Sàng lọc là quá trình thiết kế và thực hiện các thí nghiệm sơ bộ nhằm phân tích tác động của các biến đầu vào đối với các biến đầu ra Mục tiêu của sàng lọc là loại bỏ những biến đầu vào không hoặc có ít ảnh hưởng, từ đó tối ưu hóa quy trình nghiên cứu.

Thiết kế và thực hiện thí nghiệm nhằm phân tích ảnh hưởng của các biến đầu vào lên các biến đầu ra Từ kết quả thí nghiệm, các mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào được xây dựng, có thể biểu diễn dưới dạng phương trình hồi quy đa thức bậc ≤ 2 hoặc mạng neuron nhân tạo Những mối quan hệ này cho phép dự đoán giá trị của các biến đầu ra chỉ dựa vào giá trị của các biến đầu vào mà không cần thực hiện thêm thí nghiệm.

- Tối ưu hóa các biến đầu ra dựa trên các mối qua hệ đã xây dựng để tìm các giá trị tối ưu của các biến đầu vào

- Làm thí nghiệm theo các giá trị tối ưu của các biến đầu vào vừa tìm được để kiểm tra và điều chỉnh nếu cần [4]

Việc thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa là một quá trình phức tạp và tốn thời gian Hiện nay, nhiều phần mềm máy tính đã được phát triển để hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong công việc này Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Design Expert 11 cùng với phương pháp bề mặt đáp ứng để nâng cao hiệu quả của quá trình thí nghiệm.

(Response surface methodology – RSM) để thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa quy trình chiết xuất baicalin từ vỏ thân cây Núc nác.

Giới thiệu về nhựa macroporous

Nhựa hấp phụ macroporous là các polyme liên kết chéo, không ion hóa, với đặc điểm nổi bật là chứa nhiều lỗ xốp có đường kính lớn hơn 50 Å, cho phép hấp phụ các phân tử nhỏ Quá trình sản xuất nhựa này diễn ra thông qua việc polyme hóa các monome, thường là styren divinylbenzen, kết hợp với các chất độn không polyme hóa như toluen, n-heptan, isooctan và isobutanol Các chất độn này có thể hòa trộn với hỗn hợp monome và không hòa tan trong polyme, chúng sẽ bay hơi trong điều kiện nhất định sau khi polyme hóa, tạo ra những lỗ hổng trong cấu trúc của polyme.

Xét theo độ phân cực, nhựa macroporous được chia làm 4 loại:

Bảng 1.3 Phân loại nhựa macroporous

Cấu trúc Kích thước hạt (mm)

Diên tích bề mặt (m 2 /g) Ví dụ

Phân cực yếu Polystyren 0.3-1.0 500-650 AB8

Các đặc tính quan trọng của nhựa macroporous trong khả năng hấp phụ bao gồm diện tích bề mặt, đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt Diện tích bề mặt lớn giúp tăng cường khả năng hấp phụ, trong khi đường kính lỗ xốp ảnh hưởng đến khả năng tiếp cận của các phân tử Độ phân cực bề mặt cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tương tác với các chất khác, từ đó nâng cao hiệu quả hấp phụ của nhựa.

Nhựa khô thường có diện tích bề mặt từ 100 đến 1000 m²/g và đường kính lỗ rỗng từ 100 đến 300 Å, với sự phân cực thay đổi tùy thuộc vào loại monome và xử lý hóa học sau trùng hợp Hàm lượng divinylbenzen cao, lên đến 20% (kl/kl), tạo ra nhiều liên kết chéo hơn trong hạt nhựa macroporous, giúp chúng chịu được áp suất thẩm thấu cao và các chất oxy hóa mạnh, nhưng đồng thời làm giảm độ xốp Ngoài ra, các yếu tố như bản chất và nồng độ chất pha loãng, bản chất chất mồi và nhiệt độ trong quá trình polyme hóa cũng ảnh hưởng đến đặc tính lỗ xốp của nhựa.

Khả năng hấp phụ chọn lọc của nhựa macroporous chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm bản chất polymer, đường kính lỗ xốp, diện tích bề mặt riêng, độ phân cực và các nhóm chức đặc trưng Ngoài ra, khối lượng phân tử, kích thước và độ phân cực của chất tan cũng đóng vai trò quan trọng, cùng với các điều kiện tiến hành như nồng độ, pH dịch chiết, nhiệt độ hấp phụ và loại dung môi sử dụng.

Nhựa macroporous có khả năng hấp phụ chọn lọc các thành phần trong dung dịch nước nhờ vào các lực tĩnh điện, tương tác hydro, lực VanderWaals và khả năng tạo phức.

Khả năng hấp phụ của một chất lên nhựa phụ thuộc vào khối lượng phân tử, độ phân cực và cấu hình không gian của chất đó, do đó mỗi loại nhựa macroporous sẽ phù hợp với các hợp chất khác nhau Việc chọn lựa nhựa thích hợp chủ yếu dựa vào đặc điểm của chất nghiên cứu, nhựa hấp phụ, đường kính lỗ xốp và diện tích bề mặt hạt nhựa Hấp phụ hoạt chất thiên nhiên lên nhựa macroporous ngày càng được ưa chuộng nhờ vào tính tiện lợi, quy trình vận hành đơn giản, chi phí thấp và không cần sử dụng dung môi hóa chất độc hại.

1.5.2 Ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu các hợp chất từ thiên nhiên

Nhựa macroporous đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như chiết xuất dược liệu, công nghệ sinh học và y sinh học Trong chiết xuất và tinh chế các hoạt chất tự nhiên, nhựa macroporous giúp tinh chế và phân lập các hoạt chất tinh khiết, đồng thời làm giàu hoạt chất trong các cao dược liệu Với cấu trúc đa dạng, giá thành hợp lý, khả năng lặp lại và ổn định tốt, nhựa macroporous chủ yếu được sử dụng với các dung môi.

Nhựa macroporous, với đặc tính "xanh" như nước và ethanol, có khả năng tái sử dụng, phù hợp với nhiều nhóm hoạt chất và chi phí vận hành thấp, là lựa chọn lý tưởng cho quy mô lớn Hiện nay, nhiều quy trình làm giàu hoạt chất sử dụng loại nhựa này đã được triển khai, mang lại hiệu quả cao.

Cây Hoàng liên (Chelidonium majus L.) thuộc họ Papaveraceae, là một dược liệu phổ biến ở châu Âu và châu Á, có khả năng điều trị nhiều bệnh, đặc biệt là bệnh gan và ung thư da Chelidonin, thành phần chính trong các chất chuyển hóa thứ cấp của C majus L., đã được chứng minh có khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư Nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng nhựa D101 để tinh chế chelidonin mang lại nồng độ tăng 14,16 lần, từ 2,67% lên 37,81%, với hiệu suất thu hồi đạt 80,77% Hơn nữa, các sản phẩm chelidonine được làm giàu bằng nhựa macroporous cho thấy hoạt động chống nấm tốt hơn so với sản phẩm chiết xuất thô, cho thấy phương pháp này hiệu quả, chi phí thấp và thân thiện với môi trường.

 Làm giàu aucubin bằng HPD850

Nghiên cứu nhằm phát triển phương pháp tách aucubin hiệu quả từ dịch chiết Eucommia ulmoides đã xác định nhựa macroporous HPD850 là loại phù hợp nhất trong chín loại được khảo sát Các điều kiện tối ưu cho quá trình tách aucubin gồm: nồng độ aucubin ban đầu 9,87 mg/L, thể tích mẫu 13 BV và tốc độ dòng chảy 2 BV/h trong quá trình hấp thụ; rửa bằng 5 BV nước khử ion với tốc độ 3 BV/h; và trong quá trình giải hấp phụ, sử dụng dung dịch EtOH 10–80%, 2 BV cho mỗi phần thể tích EtOH với tốc độ 3 BV/h Dung dịch rửa giải ethanol 40–80% được thu lại và cô đặc, mang lại độ tinh khiết và tỷ lệ thu hồi aucubin tương ứng là 79,41% và 72,92%.

 Sử dụng nhựa macroporous giúp tăng hiệu suất thủy phân naringin

Naringenin là một thành phần quan trọng trong trái cây họ cam quýt, với nhiều tác dụng dược lý như chống ung thư, chống oxy hóa, chống huyết khối và giãn mạch Để sản xuất naringenin, naringin cần được thủy phân bằng enzym naringinase (NGase), nhưng naringin có độ tan kém trong nước, gây khó khăn cho quá trình này Nghiên cứu đã đề xuất sử dụng nhựa macroporous để hấp phụ naringin, nhằm cải thiện hiệu quả thủy phân và sản xuất naringenin Ba loại nhựa XAD-4, XAD-7HP và XAD-16 được khảo sát và cho thấy các đặc tính vật lý của nhựa ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp phụ naringin và quá trình tổng hợp enzym Việc sử dụng nhựa macroporous đã giúp tăng hiệu suất thủy phân naringin bằng enzym, đồng thời tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, dẫn đến việc điều chế naringenin ở quy mô lít với nồng độ cao.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

 Vỏ thân cây Núc nác:

Dược liệu được nghiên cứu là vỏ thân cây Núc nác được thu hái vào tháng 10/2019 tại tỉnh Hòa Bình

Vỏ thân cần được rửa sạch để loại bỏ các chất ô nhiễm bề mặt, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C trong tủ sấy với điều kiện vệ sinh sạch sẽ cho đến khi độ ẩm dưới 10% Cuối cùng, vỏ được bảo quản trong túi PE kín trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Hình 2.1 Hình ảnh cây Núc nác

 Nhựa macroporous: D101, HPD826, AB8, X5, H103 có nguồn gốc Trung Quốc

2.1.2 Chất chuẩn và hóa chất

- Baicalin chuẩn: hàm lượng 95,2%, lô 0117C004.01 (Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương)

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng STT Tên hóa chất Nguồn gốc

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ)

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)

- Các dụng cụ kiểm nghiệm khác.

Nội dung nghiên cứu

Để giải quyết một mục tiêu đề ra, nghiên cứu gồm hai nội dung chính:

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và làm giàu baicalin từ dịch chiết vỏ thân cây Núc nác

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất baicalin từ vỏ thân cây Núc nác

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm giàu baicalin từ dịch chiết vỏ thân cây Núc nác

 Xây dựng quy trình điều chế cao giàu baicalin từ vỏ thân cây Núc nác quy mô phòng thí nghiệm

Chúng tôi đã tiến hành quy trình điều chế cao baicalin từ vỏ thân cây Núc nác với quy mô 1 kg, dựa trên các thông số đã khảo sát và điều chỉnh phù hợp.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng baicalin Định lượng baicalin trong vỏ thân cây Núc nác

Tham khảo tài liệu [16], hàm lượng baicalin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Điều kiện sắc ký:

- Pha động: Acetonitril – Dung dịch acid formic 0,1% (35 : 75, tt/tt)

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

- Bước sóng phát hiện: 280 nm

Cân chính xác khoảng 10 mg baicalin chuẩn, hòa tan trong bình định mức

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp, đầu tiên cần lấy 25 ml nước cất, sau đó pha loãng để đạt được nồng độ trong khoảng từ 4 đến 24 μg/mL Cuối cùng, dung dịch này được lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Cân 0,5 g bột dược liệu (qua rây 1 mm) vào bình nón nút mài, thêm 40 ml ethanol 70%, đun hồi lưu cách thủy trong 3 giờ, sau đó để nguội và lọc Chuyển dịch lọc vào bình định mức 100 ml, rửa bình nón bằng ethanol 70% ba lần, mỗi lần 10 ml, và gộp dịch rửa vào bình định mức Thêm ethanol 70% đến vạch, lắc đều và pha loãng thành dung dịch có nồng độ thích hợp, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử, sau đó xác định hàm lượng baicalin trong mẫu thử dựa vào diện tích píc của dung dịch thử so với dung dịch chuẩn.

- Hàm lượng baicalin trong vỏ cây Núc nácđược tính theo công thức:

Xbaicalin là hàm lượng baicalin trong vỏ cây Núc nác

St và Sc là diện tích píc sắc ký của baicalin trong mẫu thử và mẫu chuẩn

Cc là nồng độ baicalin trong dung dịch chuẩn (μg/mL) k là hệ số pha loãng của mẫu thử mt là khối lượng mẫu thử (g)

R là hàm ẩm của mẫu thử (%) Định lượng baicalin trong dịch chiết

Cách tiến hành tương tự định lượng baicalin trong vỏ cây Núc nác

Cách tiến hành chuẩn bị dung dịch thử: Pha loãng dung dịch thử đến nồng độ thớch hợp và lọc qua màng lọc 0,45àm

Nồng độ baicalin trong dịch chiết được tính theo công thức:

Ct là nồng độ baicalin trong dịch chiết

St và Sc là diện tích píc sắc ký của baicalin trong mẫu thử và mẫu chuẩn

Cc là nồng độ baicalin trong dung dịch chuẩn (μg/mL) k là hệ số pha loãng của mẫu thử

2.3.2 Phương pháp chiết xuất baicalin từ vỏ thân cây Núc nác

2.3.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết baicalin từ dược liệu Cách tiến hành:

Vỏ thân cây Núc nác được sấy khô và xay thành bột thô với kích thước phù hợp Sau đó, tiến hành chiết xuất với các thông số cần khảo sát để xác định hàm lượng.

21 baicalin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp HPLC ở mục 2.3.1 Hiệu suất chiết baicalin được tính theo công thức:

Ct là nồng độ baicalin trong dịch chiết thử (mg/mL)

V là thể tích bình định mức gộp dịch chiết (mL) m là khối lượng dược liệu mẫu thử (g)

Xbaicalin là hàm lượng baicalin trong vỏ cây Núc nác (mg/g)

Khảo sát các yếu tố:

- Kích thước dược liệu bột Núc nác:

Cân 5 g Núc nác, đem đi xay nhỏ Rồi cho qua sàng 2mm, 1mm từ đó thu được 3 phân đoạn kích thước: 0,99, chứng tỏ đường chuẩn có độ tuyến tính cao, đảm bảo tính chính xác cho phép phân tích định lượng baicalin.

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ baicalin y = 76780x - 4310 R² = 0,9985

Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn và tính tỷ lệ thu hồi

Trong bình định mức 100 mL, chuẩn bị dung dịch chuẩn như sau:

Chuẩn baicalin 10,32 mg ì 95,20% ì 1000 àg/g/100 mL = 98,25 àg/mL

Hỳt 1 ml dịch chiết (đó biết nồng độ baicalin là 812,49 àg/mL) vào bỡnh định mức 100ml Dùng pipet chính xác thêm dung dịch chuẩn vào bình định mức với các khoảng mức 50%, 100%, 150% so với lượng baicalin đã có trong mẫu thử Pha loóng với nước cất đến thể tớch Lọc qua màng 0,45 àm Kết quả độ đỳng được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ đúng của baicalin

12 812,49 1179 2009,96 101,57% Ở 3 mức thêm chuẩn, % tìm lại trung bình của baicalin đều nằm trong khoảng

98 – 102%, chứng tỏ phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng

3.1.5 Định lượng dược liệu đầu vào

Tiến hành như mô tả ở mục 2.3.1, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả định lượng nguyên liệu đầu vào

Lần thí nghiệm Khối lượng (g) Hàm ẩm (%) Hàm lượng baicalin (%)

Như vậy, nguyên liệu vỏ thân cây Núc nác đầu vào có hàm lượng baicalin là 5,50%.

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết baicalin từ vỏ thân cây Núc nác

3.2.1 Ảnh hưởng của kích thước dược liệu

Kích thước nguyên liệu đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất, ảnh hưởng đến sự chuyển khối của chất tan và dung môi, cũng như tổng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa chúng Để đánh giá tác động của kích thước nguyên liệu đến quá trình chiết xuất, nghiên cứu đã khảo sát ba kích thước khác nhau: ≤ 1 mm, 1 – 2 mm và 2 – 5 mm.

Thực hiện chiết xuất theo mục 2.3.3, kết quả được thể hiện trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước dược liệu đến hiệu suất chiết baicalin

Kích thước ≤ 1 mm 1 – 2 mm 2 – 5 mm

Khi kích thước dược liệu nhỏ hơn hoặc bằng 1 mm, hiệu suất chiết baicalin đạt mức cao nhất là 39,77% Mặc dù hiệu suất chiết baicalin giảm khi kích thước dược liệu tăng lên từ 1 đến 2 mm, sự giảm này không đáng kể Tuy nhiên, khi kích thước dược liệu vượt quá 2 mm, hiệu suất chiết baicalin tiếp tục giảm.

Kích thước dược liệu 1 – 2 mm được xác định là tối ưu cho quá trình chiết xuất baicalin từ vỏ thân cây Núc nác, vì kích thước này giúp giảm thiểu tạp chất và dễ dàng tinh chế dịch chiết, trong khi kích thước nhỏ hơn 5 mm dẫn đến lượng chất chiết được giảm đáng kể.

3.2.2 Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất

Phương pháp ngâm, hồi lưu và siêu âm là ba kỹ thuật chiết xuất phổ biến nhờ vào tính tiện lợi, chi phí hợp lý và hiệu suất cao Bài viết này sẽ nghiên cứu và so sánh ba phương pháp này nhằm xác định phương pháp chiết xuất tối ưu nhất.

Thực hiện chiết xuất theo mục 2.3.3, kết quả được thể hiện trong bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất đến hiệu suất chiết baicalin

Phương pháp Ngâm Hồi lưu Siêu âm

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết xuất có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết baicalin, với thứ tự khả năng chiết giảm dần là: phương pháp hồi lưu (37,69%), phương pháp siêu âm (29,53%) và phương pháp ngâm (24,86%) Do đó, trong phần tiếp theo, đề tài sẽ lựa chọn phương pháp hồi lưu làm phương pháp chiết xuất chính.

3.2.3 Ảnh hưởng của dung môi chiết

Dung môi chiết xuất đóng vai trò quan trọng trong hiệu suất chiết, với yêu cầu về khả năng hòa tan dược chất, tính chọn lọc, dễ thu hồi, tính an toàn, hiệu suất chiết và chi phí thấp Ethanol (EtOH) là một lựa chọn lý tưởng vì nó rẻ tiền, ít độc hại và dễ thu hồi Nghiên cứu này sẽ khảo sát hiệu quả chiết xuất ở các nồng độ EtOH khác nhau nhằm xác định dung môi tối ưu nhất.

Thực hiện chiết xuất theo mục 2.3.3, kết quả được thể hiện trong bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết xuất đến hiệu suất chiết baicalin

Dung môi Nước cất EtOH 30% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 96%

Hiệu suất chiết baicalin tăng theo nồng độ EtOH, đạt đỉnh tại 70% và giảm khi nồng độ EtOH tăng lên 96% Vì vậy, cần khảo sát các nồng độ 50%, 60% và 70% để đưa vào mô hình RSM.

3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu

Tỷ lệ dung môi/dược liệu đóng vai trò quan trọng trong hiệu suất chiết xuất Khi tỷ lệ này thấp, dược chất sẽ không được chiết kiệt, dẫn đến hiệu suất chiết thấp Ngược lại, tỷ lệ cao hơn giúp chiết kiệt dược chất nhưng cũng làm tăng tạp chất, gây khó khăn trong quá trình tinh chế và tiêu tốn nhiều dung môi hơn Do đó, việc xác định tỷ lệ dung môi/dược liệu tối ưu là cần thiết để giảm thiểu lãng phí dung môi, hạn chế tạp chất và nâng cao hiệu suất chiết.

Thực hiện chiết xuất theo mục 2.3.3, kết quả được thể hiện trong bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu đến hiệu suất chiết baicalin

Hiệu suất chiết baicalin tăng lên khi tỷ lệ dung môi/dược liệu được nâng cao Mặc dù tỷ lệ 14/1 cho thấy hiệu suất chiết cao hơn một chút so với tỷ lệ 12/1, sự khác biệt này không đáng kể.

Khi tỷ lệ dung môi/dược liệu thấp, nguyên liệu không được chiết kiệt, dẫn đến lượng dược chất thu được ít Tăng tỷ lệ dung môi/dược liệu sẽ gia tăng khả năng thu được dược chất, nhưng nếu vượt quá một tỷ lệ nhất định, lượng dược chất sẽ không tăng thêm mà chỉ có thêm tạp chất và lãng phí dung môi Nhóm nghiên cứu đã lựa chọn tỷ lệ từ 8/1 đến 12/1 để áp dụng trong các thí nghiệm của mô hình RSM.

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết

Thời gian chiết xuất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết Thời gian chiết xuất ngắn dẫn đến việc nguyên liệu chưa kịp khuếch tán vào dung môi, gây ra hiệu suất thấp Ngược lại, khi tăng thời gian chiết, hiệu suất sẽ cải thiện do nguyên liệu có đủ thời gian khuếch tán, nhưng đồng thời lượng tạp chất cũng sẽ tăng Nếu thời gian chiết quá dài, lượng dược chất không tăng thêm và có thể gây lãng phí thời gian Do đó, việc khảo sát thời gian chiết là cần thiết để xác định thời gian tối ưu nhất cho quá trình chiết xuất.

Thực hiện chiết xuất theo mục 2.3.3, kết quả được thể hiện trong bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết baicalin

Thời gian 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ

Thời gian chiết có mối quan hệ tỷ lệ thuận với hiệu suất thu được, nhưng khi thời gian chiết vượt quá 3 giờ, hiệu suất hầu như không tăng thêm Điều này xảy ra do quá trình khuếch tán của dược chất từ nguyên liệu sang dung môi cần thời gian Nếu thời gian chiết quá ngắn, dược chất chưa kịp khuếch tán nhiều sẽ dẫn đến hiệu suất thấp Khi kéo dài thời gian chiết, dược chất sẽ khuếch tán ra dung môi theo gradient nồng độ, nhưng đến một thời điểm nhất định, dù thời gian chiết có tăng thêm, lượng dược chất thu được sẽ không còn tăng nữa do dung môi đã bão hòa dược chất.

36 môi là như nhau (cân bằng nồng độ) Nhóm nghiên cứu lựa chọn khoảng thời gian từ 1 – 3 giờ đưa vào các thí nghiệm của mô hình RSM.

Tối ưu hóa quy trình chiết xuất baicalin từ vỏ thân cây Núc nác

Quá trình chiết xuất bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, và sự kết hợp của chúng tác động khác nhau đến hiệu suất chiết Do đó, cần tối ưu hóa để tìm ra điều kiện tốt nhất cho sự tương tác của các yếu tố Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tối ưu hóa các thông số với hàm mục tiêu là hiệu suất chiết baicalin, lựa chọn ba yếu tố chính: thời gian chiết xuất từ 1 đến 3 giờ, tỷ lệ dung môi/dược liệu từ 8/1 đến 12/1, và nồng độ EtOH từ 50% đến 70%.

Bảng 3.10 Các mức thí nghiệm sử dụng trong mô hình RSM

Mã hóa Tên Đơn vị

X2 Tỷ lệ dung môi/dược liệu ml/g 8 – 12 8 10 12

Sau khi tiến hành thực nghiệm, thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.11

Bảng 3.11 Kết quả hàm mục tiêu quy hoạch thực nghiệm

STT Thời gian chiết (giờ)

Tỷ lệ dung môi/dược liệu

Nồng độ EtOH(%) Hiệu suất (%)

Sau khi có kết quả định lượng, số liệu được đưa vào phần mềm Design Expert

11 xử lý và thu được kết quả dưới đây:

Bảng 3.12 Kết quả phân tích phương sai các yếu tố

Yếu tố Tổng bình phương Trung bình bình phương F-value p-value

Mô hình được đánh giá về sự phù hợp và ý nghĩa thông qua các chỉ số tương quan, với các hệ số hồi quy được kiểm định bằng chuẩn F và giá trị p