ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
Tỏi ợc thu mua t i huyện o Lý S n – Qu ng Ngãi M u ợc xác ịnh bằng việ qu n sát iểm gi i phẩu hình thái thực v t học
Chuột nhắt trưởng thành có khối lượng từ 20 - 25 gram, thuộc giống ực, được cung cấp bởi Viện Pasteur Nha Trang và nuôi trong phòng thí nghiệm Di truyền - Giải phẫu - Sinh lý động vật thuộc khoa Sinh - Môi trường Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và có nước uống tự do.
- Carrageenin do hãng Sigma cung c p
- Aspirin do công ty cổ ph n D ợc phẩm D ợc liệu Mê Kông cung c p
- Form l eh t o ng t TNHH Th ng m i hóa ch t Nam Bình cung c p
- Các hóa ch t th ng th ng khác
2.1.4 Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu ợc tiến hành trên củ tỏi thu hái t i Lý S n Qu ng Ngãi Ho t tính kháng viêm của tỏi ợ ánh giá th ng qu á phép thử ho t tính in vivo trên chuột nh t tr ng t i phòng thí nghiệm Di truyền – Gi i ph u – Sinh lý ộng v t thuộc khoa Sinh - M i tr ng tr ng Đ i họ S ph m – Đ i học Đ Nẵng.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Kh o sát nồng ộ g ộc tính c p của cao chiết tỏi
Nghiên cứu đánh giá tính kháng viêm của cao chiết từ tỏi trên chuột nhắt trắng thông qua các chỉ số huyết học như số lượng bạch cầu, tỷ lệ phần trăm bạch cầu trung tính và bạch cầu lympho Bên cạnh đó, thể tích dịch rỉ viêm và tỷ lệ % ức chế phù ở chân chuột nhắt trắng cũng được xem xét để xác định hiệu quả của cao chiết tỏi trong việc giảm viêm.
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Nghiên ứu những t i liệu liên qu n l m sở lý lu n ho ề t i Cá t i liệu l m sở lý lu n nh :
- T i liệu nghiên ứu về quá tr nh viêm v á ph ng pháp nghiên ứu ho t tính kháng viêm
- T i liệu nghiên ứu về huột nh t tr ng
- T i liệu nghiên ứu về th nh ph n hó họ v ho t tính sinh họ ủ tỏi
2.3.2 Phương pháp chiết dịch nghiên cứu
Củ tỏi sau khi thu hái tại Lý Sơn cần được bóc vỏ và nghiền mịn để làm nguyên liệu cho quá trình chiết xuất Nguyên liệu này sẽ được ngâm với dung môi ethanol theo tỉ lệ 1:1 Sau đó, dung môi sẽ được loại bỏ bằng phương pháp cô quay chân không để thu được cao chiết tỏi.
2.3.3 Phương pháp thử độc tính cấp
Xá ịnh ộc tính c p theo ph ng pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành
Cao chiết được pha ở nồng độ 20 gam/ml để khảo sát độc tính cấp tính Thí nghiệm được thực hiện với 30 con chuột, chia thành 5 nhóm (6 chuột mỗi nhóm), bao gồm 1 nhóm đối chứng sinh lý và 4 nhóm thí nghiệm Trước khi cho uống mẫu, các chuột bị nhịn ăn hoàn toàn trong 16 giờ Mẫu được cho uống với liều lượng giảm dần: 1; 0,5; 0,25 và 0,125 gam/kgP Sau khi uống cao chiết, chuột được nuôi dưỡng bình thường và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50.
Xá ịnh LD50 ợc tiến h nh theo ph ng pháp ủ r er nh s u:
LD 50 là liều chết 50% ộng v t thí nghiệm;
LD là liều gây chết 100% cho động vật thí nghiệm; n là số lượng động vật trong một nhóm; a là sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp; b là tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp Đồng thời, chuột chết sẽ được mổ để xét nghiệm mô.
2.3.4 Mô hình nghiên cứu hoạt tính kháng viêm a Gây viêm màng bụng [29]
Chuột nh t tr ng ợc chia ng u nhiên thành 4 lô, mỗi lô 5 con:
- Lô 2: uống aspirin liều 0,15 g/kgP
- Lô 3 và lô 4: uống cao chiết tỏi v i các liều khác nhau
Trong nghiên cứu, các lô chuột được uống thuốc thử ho và dung dịch muối sinh lý liên tục trong 3 ngày Vào ngày thứ 3, sau khi uống thuốc thử, chuột được gây viêm màng bụng bằng dung dịch carrageenin 0,05g kết hợp với 1,4 ml formaldehyd pha trong 100ml dung dịch muối sinh lý Mỗi chuột nhận 1ml dung dịch này vào khoang màng bụng.
Sau 24 gi gây viêm, mổ ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm ịnh l ợng thể tích dịch rỉ viêm, số l ợng b ch c u và công thức b ch c u ngo i vi b Gây viêm cấp bằng mô hình gây phù chân trên động vật thực nghiệm
Chuột nh t tr ng hi th nh 4 l Mỗi l 5 on
- L 1 l hứng tr ng: uống NACL 1%
- L 2 (l hứng ng) uống spirin liều 0,15 g/kgP (ho in ometh in v i liều 0 01g/kg P)
- L 3 4 (l thử nghiệm) : uống o hiết tỏi v i á liều khá nh u
Chuột được sử dụng để nghiên cứu viêm bằng cách tiêm 0,1ml rượu genin 1% (pha trong nước muối sinh lý) vào vùng gân Đo thể tích hồng cầu sau khi tiêm tại các thời điểm 2h, 4h, 6h và 24h để đánh giá mức độ viêm Kết quả được tính toán theo công thức Font ine để xác định độ tăng thể tích hồng cầu Phương pháp xác định công thức bạch cầu cũng được áp dụng trong nghiên cứu này.
Công thức bạch cầu được xác định theo phương pháp Luersep và Uressep Máu được phết lên tiêu bản, nhuộm giếng và quan sát bạch cầu trên kính hiển vi phóng đại 1000 lần Tiến hành đếm 200 bạch cầu liên tiếp nhau ở 4 góc và 2 tiêu bản theo nguyên tắc hình chữ chi Mỗi mẫu máu đếm 5 lần để lấy trung bình chung.
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phương pháp sinh học, sử dụng công cụ phân tích dữ liệu của Microsoft Excel Kết quả thí nghiệm được biểu thị dưới dạng (M ± SD) và (M ± SE) Để đánh giá và so sánh giá trị trung bình giữa các lô thí nghiệm, phương pháp thống kê t - Student được áp dụng Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.