T Ổ NG QUAN
T ổ ng quan v ề b ệ nh viêm kh ớ p d ạ ng th ấ p
Viêm khớp dạng thấp (RA) là một bệnh viêm khớp mạn tính phổ biến, đặc trưng bởi tình trạng viêm đa khớp, gây ra triệu chứng như tê cứng, đau và sưng khớp, đồng thời có thể ảnh hưởng đến các cơ quan khác trong cơ thể Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 750 – 800 trường hợp mới mắc bệnh trên mỗi triệu dân từ 15 tuổi trở lên, với tỷ lệ mắc bệnh là 0,5%, trong đó 80% là nữ giới Mặc dù nguyên nhân chính xác của bệnh vẫn chưa được xác định, nhưng viêm khớp dạng thấp được xem là có tính chất di truyền.
Bệnh viêm khớp dạng thấp được coi là một bệnh tự miễn, xảy ra khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể và được nhận diện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên như đại thực bào và tế bào đuôi gai Những tế bào này sau đó trình diện kháng nguyên cho các tế bào lympho T và B Khi các tế bào lympho T CD4 (T help) được kích hoạt, chúng sản xuất ra các lymphokin như Interleukin-4, 10, và 13, kích thích tế bào lympho B tăng sinh và biệt hóa thành các tương bào, từ đó sản xuất ra các globulin miễn dịch, tạo thành các thể tự kháng.
Màng hoạt dịch khớp xuất hiện tình trạng lắng đọng phức hợp miễn dịch kháng nguyên – kháng thể, dẫn đến sự thực bào và sự hiện diện của bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, và tế bào mastocyt Các tế bào này tiết ra các cytokine như TNF-α, IL-1,2,6, interferon, và VEGF, tạo ra vòng xoắn bệnh lý thúc đẩy quá trình viêm Sự gia tăng mạch dưới tác động của VEGF và xâm nhập của các tế bào viêm khác hình thành màng mạch (mảng pannus), xâm lấn vào đầu xương, sụn khớp và giải phóng các enzym tiêu hủy tổ chức như stromelysin, elastase, collagenase Sự xâm nhập của nguyên bào xơ gây ra phá hủy khớp, dính khớp và tàn tật Quá trình này có sự tham gia của cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, trong đó lympho T đóng vai trò quan trọng.
Tại trung tâm V NU, các nhà khoa học đã nghiên cứu cơ chế bệnh sinh để phát triển các loại thuốc có khả năng kích hoạt hoặc sửa chữa hệ miễn dịch Những thuốc này hoạt động bằng cách ức chế từng loại tế bào và cytokine, nhằm kiểm soát tình trạng viêm của bệnh.
T ổ ng quan v ề Interleukin-6
IL-6 là một glycopeptide có trọng lượng phân tử 26 kDa, được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể số 7, bao gồm 212 axit amin được sắp xếp thành bốn chuỗi α Chất này được sản xuất bởi nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân, nguyên bào sợi, tế bào nội mô và một số tế bào khối u.
IL-6 là cytokine chủ yếu có mặt trong dịch ổ khớp của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA), đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng viêm tại chỗ và toàn thân Nó kết hợp với thụ thể IL-6 màng (MIL-6R) và glycoprotein-130, kích hoạt tế bào viêm như đại thực bào và bạch cầu trung tính, dẫn đến hủy hoại sụn khớp và xương Ngoài ra, IL-6 cũng có thể kích hoạt các tế bào không có thụ thể màng IL-6 miễn là có thụ thể gp-130, thông qua cơ chế thụ thể hòa tan IL-6 (SIL-6R) Sự gia tăng nồng độ IL-6 trong cơ thể có liên quan mật thiết đến sự tiến triển của bệnh RA.
V NU cũng như nồng độ thụ thể IL-6 dạng hòa tan có liên quan đến mức độ trầm trọng và sự tiến triển của bệnh[2, 11]
Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6
Hai con đường truyền tín hiệu kích hoạt phản ứng viêm của IL-6: Truyền tín hiệu cổ điển (classical signalling) qua màng tế bào với vai trò của MIL-6R
Truyền tín hiệu chuyển tiếp (trans-signalling) thông qua SIL-6R [27]
Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó
IL-6 và IL-6R tạo thành phức hợp với protein gp130, đóng vai trò quan trọng trong bệnh viêm khớp dạng thấp Sự tương tác này góp phần vào quá trình viêm và tổn thương khớp, ảnh hưởng đến triệu chứng và tiến triển của bệnh Việc hiểu rõ vai trò của IL-6 có thể giúp phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân viêm khớp dạng thấp.
RA được đặc trưng bởi sự gia tăng các yếu tố dạng thấp như kháng thể IgM và IgG RF trong huyết thanh và khớp Tế bào B đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các yếu tố này.
V NU kháng thể này chứng tỏ ức chế tế bào B là một phương hướng điều trị bệnh RA
IL-6 cũng được xác định là một yếu tố biệt hóa của tế bào B, ảnh hưởng đến quá trình phát triển của nó [2]
Trong bệnh viêm khớp dạng thấp (RA), trong giai đoạn viêm cấp tính, các tế bào như bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và tế bào nội mô giải phóng IL-6, dẫn đến sự gia tăng bạch cầu trung tính trong dịch khớp Bạch cầu trung tính đóng vai trò quan trọng trong viêm và phá hủy khớp nhờ khả năng giải phóng enzym phân giải protein và chất trung gian IL-6 tác động trực tiếp lên bạch cầu trung tính qua thụ thể IL-6 trên màng tế bào, và việc ức chế IL-6 đã được chứng minh có thể ngăn chặn sự bám dính của bạch cầu trung tính Khi bệnh tiến triển, sự chuyển từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính chịu ảnh hưởng lớn từ IL-6 đối với bạch cầu trung tính.
Nồng độ IL-6 cao trong màng hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA) liên quan đến sự gia tăng phản ứng viêm và tình trạng phá hủy khớp Tổn thương khớp trong RA đặc trưng bởi sự bào mòn xương tại vị trí bám của màng hoạt dịch và hẹp khe khớp, được xác định là do hủy cốt bào gây ra trong các nghiên cứu trên người và động vật IL-6 làm tăng số lượng hủy cốt bào bằng cách tác động lên các tế bào gốc tạo máu từ bạch cầu hạt và đại thực bào dòng hạt.
Các phản ứng cấp tính trong cơ thể bao gồm sự phóng thích cytokine tiền viêm và tăng cường protein pha viêm cấp tính, trong đó CRP và IL-6 là những yếu tố quan trọng IL-6, được sản xuất chủ yếu tại gan, kích thích quá trình sản xuất protein pha viêm cấp tính Đối với bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA), nồng độ IL-6 trong huyết thanh có mối tương quan chặt chẽ với nồng độ CRP, cho phép đánh giá tình trạng viêm và mức độ bệnh thông qua việc định lượng CRP trong dịch sinh học.
Nghiên cứu cho thấy rằng các triệu chứng toàn thân và tại chỗ ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp có thể được giải thích bởi tác động của IL-6 Vì vậy, ức chế IL-6 trở thành một mục tiêu hợp lý trong điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp.
1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chếức chế Interleukin-6
Khi xuất hiện đột biến mất đoạn ở protein IL-6, tất cả các protein đều không có hoạt động sinh học Phản ứng miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng IL-6 cho thấy chỉ các đột biến mất đoạn tại trình tự 177, 178 và 179 không gây ra thay đổi đáng kể trong cấu trúc nếp gấp Điều này chứng tỏ rằng các đột biến này không làm mất cấu trúc không gian 3 chiều của protein IL-6 Dù có đột biến tại các trình tự này, IL-6 vẫn duy trì hoạt tính sinh học liên quan đến cấu trúc 3 chiều của nó Tuy nhiên, protein IL-6 với đột biến mất đoạn ở bộ 3 trình tự acid amin 177-179 không thể cạnh tranh với protein IL-6 đầy đủ để liên kết với thụ thể hòa tan SIL-6R, gợi ý rằng ít nhất một trong ba acid amin này có thể tham gia vào vị trí liên kết giữa IL-6 và thụ thể.
Nghiên cứu về thụ thể hòa tan SIL-6R cho thấy rằng đột biến acid amin tại vị trí 177, 178 và 179 ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào chuột, trong đó Arg179 đóng vai trò quan trọng Sự thay thế duy nhất ở vị trí 179 mà vẫn giữ được hoạt tính là từ Arg thành Lys, chứng tỏ tầm quan trọng của điện tích dương tại vị trí này trong việc liên kết IL-6 với thụ thể của nó Do đó, arginine tại vị trí 179 có vai trò quyết định, và việc nhắm vào vị trí này trong cấu trúc chuỗi polypeptide IL-6 có thể làm suy giảm hoạt động bình thường của IL-6.
Quá trình nghiên c ứ u và phát tri ể n thu ố c
Quá trình nghiên cứu và phát triển thường được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm hiện nay được minh họa như hình dưới đây:
Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc
Lựa chọn mục tiêu Xác định hợp chất Hit
Xác định và tối ưu hợp chất
Lựa chọn chất ứng cử làm thuốc
Thử nghiệm lâm sàng pha I,II,III © S chool of Medicine and
Lựa chọn mục tiêu trong phát triển thuốc là việc xác định một mục tiêu cụ thể, đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh Các mục tiêu phân tử thường là thụ thể, enzyme hoặc các phân tử tương tự.
Xác định hợp chất Hit là quá trình tìm kiếm các phân tử có tác dụng dược lý mong muốn thông qua nhiều thử nghiệm ban đầu Những thử nghiệm này giúp dự đoán các tác dụng dược lý mà chúng ta kỳ vọng Thông thường, việc xác định hợp chất Hit được thực hiện thông qua phương pháp sàng lọc thông lượng cao (High Throughput Screening).
Quá trình sàng lọc cao thông qua HTS với các thư viện hợp chất lớn từ 105-106 phân tử cho phép xác định các hợp chất Hit, từ đó phát triển thành các hợp chất khởi đầu cho các khám phá hóa dược sâu hơn Trong giai đoạn xác định và tối ưu hóa hợp chất dẫn đường, thông tin về tính chất dược lực học và dược động học của các hợp chất được thu thập ngày càng nhiều Việc xác thực giả thuyết dược lý ban đầu và đặt ra nghi vấn trong giai đoạn lựa chọn mục tiêu diễn ra song song, dẫn đến việc xác định ứng cử viên làm thuốc cuối cùng, hợp chất duy nhất đáp ứng đủ yêu cầu để tiến hành thử nghiệm lâm sàng.
Sàng lọc ảo là việc áp dụng mô hình phân tử để xác định hợp chất Hit, được sử dụng cho thiết kế bộ hợp chất trong sàng lọc cao (HTS) và dự đoán các bộ hợp chất nhỏ hơn để thực hiện các thử nghiệm với thông lượng thấp hơn.
Sàng l ọ c ả o d ự a trên c ấ u trúc
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (SVBS) là phương pháp dự đoán các hợp chất có khả năng liên kết với protein mục tiêu, thông qua các kỹ thuật tính toán dựa trên kiến thức về cấu trúc 3D của phân tử đích.
Cách tiếp cận cơ bản của SVBS là dự đoán cấu dạng liên kết của từng phân tử nhỏ trong thư viện dữ liệu thông qua quá trình docking Từ đó, năng lượng tự do của phân tử khi liên kết được dự đoán bằng phương pháp scoring Các hợp chất Hit sau đó được xác định bằng cách sắp xếp tất cả các hợp chất trong thư viện dựa trên điểm số đã tính.
V NU và quyết định một điểm ngưỡng Hợp chất có điểm tốt hơn điểm ngưỡng được coi là hợp chất Hit, sau đó sẽđánh giá thêm [14].
Phương pháp Docking
Docking là một phương pháp thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, nổi bật với khả năng dự đoán chính xác sự hình thành liên kết giữa các cấu tử và thụ thể trong túi liên kết Kể từ khi ra đời vào những năm 1980, docking đã trở thành công cụ thiết yếu trong nghiên cứu và phát triển thuốc Phương pháp này không chỉ chỉ ra các liên kết quan trọng mà còn định lượng khả năng liên kết thông qua các hàm tính điểm, giúp phân hạng mức độ mạnh yếu của các cấu tử.
Docking là một bài toán tối ưu nhằm xác định vị trí và cấu hình lý tưởng của cơ chất gắn kết lên protein Mục tiêu chính của quá trình này là tìm cấu hình với năng lượng tự do toàn hệ thấp nhất Để đạt được cấu hình tối ưu, cần liên kết cấu hình không gian với các chỉ số đánh giá khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng các thuật toán tìm kiếm phù hợp.
Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là một thuật toán tìm kiếm quan trọng, thường được áp dụng trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina và GOLD GA dựa trên các lý thuyết về tiến hóa và chọn lọc tự nhiên, bắt đầu bằng việc mã hóa các tham số của cấu trúc ban đầu vào “nhiễm sắc thể” dưới dạng véc tơ Từ nhiễm sắc thể này, thuật toán sẽ tạo ra một quần thể ngẫu nhiên để khám phá một miền năng lượng rộng lớn.
Quá trình đánh giá quần thể cho phép chọn ra các “nhiễm sắc thể” có giá trị năng lượng thấp nhất để tạo ra quần thể tiếp theo Điều này giúp giảm năng lượng trung bình của toàn bộ “nhiễm sắc thể” bằng cách chuyển giao các đặc tính cấu trúc thuận lợi giữa các quần thể Sau nhiều chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, chúng ta cuối cùng sẽ xác định được một “nhiễm sắc thể” phù hợp với mức năng lượng tối thiểu.
Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm để ước lượng năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor, được biểu thị qua hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL) với đơn vị kCal/mol Dự đoán năng lượng liên kết dựa vào việc đánh giá các tương tác hóa lý quan trọng như tương tác liên phân tử, ảnh hưởng solvat và entropy Độ chính xác của dự đoán tăng khi số lượng tham số hóa lý được xem xét nhiều hơn, tuy nhiên, thời gian tính toán cũng sẽ kéo dài Do đó, các hàm tính điểm hiệu quả cần cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ, điều này rất quan trọng khi làm việc với cơ sở dữ liệu lớn.
Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking
Chuẩn bị cấu tử là bước quan trọng trong nghiên cứu hóa học, có thể sử dụng các cấu trúc từ hệ thống dữ liệu như Pubchem và Zinc Nếu không có sẵn, người dùng có thể tạo ra cấu trúc bằng phần mềm như ChemDraw hoặc Chemsketch.
Sau khi hoàn thành cấu trúc 3D, các bước chuẩn bị cho chương trình mô phỏng docking bao gồm việc gắn hydro, thiết lập trường lực và xây dựng file pdbqt.
Để chuẩn bị protein, trước tiên cần lấy cấu trúc 3D từ ngân hàng dữ liệu protein Nếu không có sẵn, có thể sử dụng phương pháp mô phỏng tính tương đồng để xây dựng cấu trúc Sau khi có cấu trúc 3D, cần sử dụng phần mềm để chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking, bao gồm các bước loại bỏ nước và các cấu tử, thêm hydro, gắn trường lực và tạo file pdbqt.
Mô phỏng docking yêu cầu xác định vùng tìm kiếm (grid box) trước khi phần mềm bắt đầu tìm kiếm vị trí và cấu trúc phù hợp của cấu tử.
Kích thước vùng tìm kiếm cần được cân nhắc kỹ lưỡng; nếu quá lớn, sẽ tốn thời gian và giảm hiệu quả lặp lại, trong khi nếu quá nhỏ, phần mềm sẽ không hoạt động hiệu quả.
V NU xác định một vùng tìm kiếm nhỏ, thường nằm ở trung tâm hoạt động của protein Sau khi xác định vị trí và kích thước của vùng này, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm cấu dạng có năng lượng thấp nhất Cấu dạng này cùng với các tương tác của nó với protein sẽ được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng.
MOE, Pymol, Discovery studio… © S chool of Medicine and
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U
Nguyên li ệ u và thi ế t b ị nghiên c ứ u
Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6 phản ánh qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu
Mật độ electron đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hình học của cấu trúc tinh thể tia X, từ đó giúp xác định tọa độ các nguyên tử và dựng nên cấu trúc protein Hình ảnh minh họa cho thấy màu sắc phản ánh mối quan hệ giữa mật độ electron và hình học, với các chỉ số chất lượng hình học được phân loại theo số lượng acid amin ngoại lai: màu xanh (0 acid amin), vàng (1 acid amin), cam (2 acid amin) và đỏ (3 acid amin) Đặc biệt, vị trí 177-179 trong chuỗi acid amin, thuộc vùng hoạt động, có chất lượng tốt (màu xanh) và được lựa chọn để nghiên cứu khả năng gắn kết giữa cấu tử và protein.
Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU
Cơ sở dữ liệu các hợp chất thiên nhiên Việt Nam (VNPD) chứa cấu trúc topo hai chiều của 1.602 hợp chất dược liệu cùng với thông tin về nguồn gốc và tác dụng dược lý đã được nghiên cứu Tuy nhiên, do hạn chế về tài nguyên tính toán, nghiên cứu này chỉ sử dụng dữ liệu từ 500 chất đầu tiên trong VNPD.
Thiết bị sử dụng: Máy tình ACER Aspire V3 – Hệđiều hành Windows 8
Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng được tải hoặc mua từ các nhà phát triển (trang web) bao gồm:
- MarvinSketch (https://chemaxon.com/products/marvin)
- MGLtools (http://mgltools.scripps.edu/)
- AutodockVina (http://vina.scripps.edu/)
- Discovery Studio (http://accelrys.com/products/collaborative- science/biovia-discovery-studio/)
N ộ i dung nghiên c ứ u
Bước đầu tiên là sàng lọc các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD có khả năng ức chế IL-6 thông qua phương pháp docking phân tử.
Bước 2: Tiến hành nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất đã được lọc, thông qua việc phân tích các thông số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu chứa chất đó.
Phương pháp nghiên cứ u
Quy tắc số 5 của Lipinski chỉ ra rằng dược chất đường uống không vi phạm quá một trong 4 tiêu chí dưới đây:
- Trọng lượng phân tử MW < 500 daltons
- Không nhiều hơn 5 hydro có thể tham gia liên kết hydro (Sốlượng các nhóm –NH và –OH), HBD ≤ 5
- Không nhiều hơn 10 nguyên tửcó độ âm điện lớn có thể tham gia liên kết hydro (bao gồm nguyên tử Oxy và Nitơ), HBA ≤ 10
Hệ số phân bố octanol/nước (MlogP) cần đạt ≤ 4,15 để đảm bảo tính khả thi trong phát triển hợp chất Công cụ tính toán do Daina và cộng sự phát triển cho phép sàng lọc trực tuyến qua trang web http://www.swissadme.ch/ Đã tiến hành sàng lọc 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên trong cơ sở dữ liệu VNPD bằng cách nhập công thức SMILEs để thu thập cấu trúc và thông số, sau đó phân tích theo quy tắc 5 Mục tiêu của quá trình này là tăng tỷ lệ thành công cho các hợp chất trong các giai đoạn phát triển tiếp theo.
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể tia X của IL-6 (1ALU) được tải từ ngân hàng dữ liệu protein (https://www.rcsb.org/structure/1ALU), sau đó tiến hành loại bỏ các nước, ligand SO4 và TLA (tartaric acid) Thêm Hydro, gắn trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt Tất cả các bước này được tiến hành trên phần mềm MGLtools
Chuẩn bị hợp chất: Đưa công thức SMILES các hợp chất tự nhiên vào để vẽ công thức 2D sau đó xây dựng công thức 3D nhờ phần mềm MarvinSketch
Sau cùng, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lực Gasteiger và xây dựng file pdbqt © S chool of Medicine and
Dữ liệu chứa protein và các thành phần dưới dạng file pdbqt Sử dụng phần mềm Autodock để thực hiện docking với Grid box có tâm tại Arg179, kích thước 15×15×15 Ǻ Quá trình docking được lặp lại 8 lần, mỗi chất được tiến hành docking 3 lần (n = 3).
Phần mềm Autodock được sử dụng trong docking phân tử để xác định cấu hình liên kết tối ưu thông qua đánh giá năng lượng tự do liên kết ΔG và số lượng tương tác vật lý Autodock tính toán năng lượng dựa trên đặc tính năng lượng nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn, và các yếu tố tương tác giữa các phân tử, bao gồm năng lượng liên kết Van der Waals, năng lượng liên kết hydro, năng lượng từ desolvat và năng lượng tĩnh điện.
Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của các hợp chất với cấu trúc tinh thể của IL-6 © S chool of Medicine and
KẾ T QU Ả
K ế t qu ả sàng l ọ c b ằ ng quy t ắ c s ố 5 c ủ a Lipinski
Sử dụng trang web http://www.swissadme.ch/ để sàng lọc và loại bỏ các chất vi phạm tiêu chuẩn quy tắc số 5, từ 500 hợp chất ban đầu, còn lại 412 chất để tiến hành phân tích sâu hơn, loại bỏ gần 20%.
Sàng l ọ c docking
Madindoline A được chứng minh có tác dụng ức chế chọn lọc cao IL-6 do vậy chúng tôi sử dụng Mandindoline A làm chất đối chiếu tác dụng
Mandindoline A lấy công thức 3D từ cơ sở dữ liệu Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) Tiến hành dock madindoline A có định
CSDL VNPD 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên
L ự a ch ọ n ho ạ t ch ấ t ~96% h ợ p ch ấ t t ự nhiên
~96% hợp chất tự nhiên © S chool of Medicine and
Sử dụng Autodock Vina, chúng tôi đã mô phỏng liên kết giữa Mandindoline A và protein 1ALU dưới định dạng file pdbqt, cho kết quả năng lượng liên kết ΔG = -7,0 kCal/mol Mandindoline A tạo liên kết hydro với Arg179 (2.01 Å) và Gln175 (2.19 Å), cùng với các tương tác kỵ nước khác Do đó, tiêu chí ΔG≤-7,0 kCal/mol và liên kết hydro với Arg179 được áp dụng cho bước tiếp theo trong nghiên cứu.
Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong trung tâm hoạt động của IL-6
Quá trình thu hẹp bộ dữ liệu từ 412 hợp chất xuống còn 258 hợp chất đạt tiêu chuẩn tương tác với ARG179 đã loại bỏ gần 40% hợp chất Tiếp theo, 258 hợp chất này được dock bằng phần mềm Autodock với Grid box 30×30×30 Ǻ tại vị trí Arg179 Phân tích kết quả docking bằng Discovery Studio cho thấy có 10 hợp chất có ΔG ≤ -7,0 kCal/mol, tạo liên kết hydro với Arg179 và tương tác với các acid amin khác.
Ch ọ n 10 h ợ p ch ấ t t ố t nh ấ t t ừ k ế t qu ả Docking
Dựa trên kết quả của quá trình Docking phân tử, chúng tôi đã chọn ra 10 hợp chất có khả năng tương tác mạnh mẽ với phân tử IL-6, đồng thời có năng lượng tương tác thấp nhất.
Bảng 3.1: Kết quả phân tích dữ liệu docking phân tử
Tương tác Túi liên kết
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Leu33, Ser37, Lys171, Leu178, Arg179, Arg182
Tương tác kỵ nước: Leu33, Leu178
Leu33, Ser37, Gln175, Leu178, Arg179 © S chool of Medicine and
Tương tác kỵ nước: Arg30, Leu33, Lys171 Leu178
Arg30, Leu33, Asp34, Lys171, Leu178, Arg179
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178, Arg182
Liên kết kỵ nước: Arg30, Leu33, Leu178, Arg182
Arg30, Leu33, Gln175, Leu178, Arg179, Arg182 © S chool of Medicine and
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Arg30, Leu33, Leu178, Arg179, Arg182
3α-hydroxy-urs- 12-ene-23,28- dioic acid -7,3
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Liên kết kỵ nước: Lys66, Met67, Phe74, Gln175, Ser176
Lys66, Met67, Phe74, Gln175, Ser176, Arg179
Met67, Phe74, Glu172, Arg179 © S chool of Medicine and
V NU nước: Phe74 apigenin 7-O-β- D-glucosid
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Tương tác kỵ nước: Arg30, Leu33, Lys171, Leu178
Arg30, Leu33, Lys171, Gln175, Leu178, Arg179 © S chool of Medicine and
3.4 Đặc điểm hoá lý của các hợp chất đƣợc chọn
Bảng 3.2 Tính toán các thông số hoá lý trong quy tắc 5 Lipinski của 10 hợp chất đƣợc chọn
Khối lƣợng phân tử MW(dalton)
Hệ số phân bố octanol/nước MLog P
Sốlƣợng nguyên tố có thể nhận liên kết Hydro HBA
Số lƣợng nguyên tố có thể cho liên kết Hydro HBD
3-Epibartogenic acid 418,68 3,24 7 5 © S chool of Medicine and
3α-Hydroxy-urs-12- ene-23,28-dioic acid 486,68 3,86 5 3
Cả 10 hợp chất trên đều thỏa mãn 4 tiêu chí theo Quy tắc số 5 của Lipinski, các thông số thể hiện tính chất dược động học tốt, cho thấy tiềm năng phát triển thành thuốc Theo tính toán bởi công cụ trực tuyến www.swissadme.ch/, các chất này được dự đoán là có sinh khả dụng khoảng 55% và không qua được hàng rào máu não.
Đặc điể m chi ti ế t t ừ ng ch ất theo tương tác vớ i Interleukin-6 và thông
Hợp chất (-)-Hydnocarpin (ID: VNPD_001) © S chool of Medicine and
Hình 3.3: Minh họa 2 chiều tương táccủa (-)-Hydnocarpin trong trung tâm hoạt động của IL-6
Hợp chất (-)-Hydnocarpin có liên kết hydro với Arg179 (khoảng cách
2,23 Ǻ), Gln175 (khoảng cách 2,11 Ǻ) đồng thời liên kết kỵ nước với Leu33, Leu178 Năng lượng liên kết với đích tác dụng ΔG = -7,0 kCal/mol
(-)-Hydnocarpin , một flavonolignan, được xác định là thành phần hoá học chiết xuất từ cây xoan rừng Xoan rừng, tên khoa học Brucea javanica (L.) Merr
(Simaroubaceae), là một loại cây bụi thường xanh phân bố từ Đông Nam Á đến
Bắc Úc Tại Đông Nam Á, xoan rừng đã được sử dụng như một phương thuốc trị sốt rét, trong khi hạt giống của cây này giúp giảm bệnh lỵ và một số bệnh ngoài da Năm 2009, nhóm nhà khoa học Li Pan đã phân lập thành công hợp chất flavonolignan (-)-Hydnocarpin từ dịch chiết lá, cành và hoa của xoan rừng ở tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam Hợp chất này cũng được đánh giá có độc tính đối với dòng tế bào MCF-7, một dòng tế bào ung thư vú ở người.
Hợp chất 24-methylene cycloartane-3β,21-diol (ID:VNPD_202)
Hình 3.4: Minh họa 2 chiều tương tác của 24-methylene cycloartane-
3β,21-diol trong trung tâm hoạt động của IL-6
Hợp chất 24-methylenecycloartane-3β,21-diol thể hiện sự liên kết hydro với Asp34 và Arg179, với khoảng cách lần lượt là 2,58 Ǻ và 2,24 Ǻ Ngoài ra, hợp chất này còn tương tác kỵ nước với các amino acid như Arg30, Leu33, Lys171 và Leu178 Năng lượng liên kết của hợp chất được tính toán là ΔG = -7,6 kCal/mol.
Cây song môi tàu (Miliusa sinensis Finet et Gagnep), thuộc họ Na (Annonaceae), là loại cây bụi cao từ 2 - 4 m, phân bố tại Việt Nam và miền Nam Trung Quốc ở độ cao từ 500-5000m Năm 2006, các nhà khoa học từ dự án hợp tác quốc tế về đa dạng sinh học (ICBG) đã phát hiện nhiều hợp chất mới có khung miliusane với hoạt tính sinh học, bao gồm tác dụng ức chế chọn lọc tế bào ung thư vú từ cây song môi tàu thu hái tại rừng Cúc Phương Ngoài ra, dịch chiết từ cây này còn chứa Liriodenin, một chất đối kháng thụ thể muscarin, có hiệu lực chống loạn nhịp tim và co thắt tim dương.
Nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của V NU đã được thực hiện trên nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm ung thư biểu mô, ung thư gan và ung thư phổi Hai nhà khoa học Trần Thị Thanh Thủy và Nguyễn Thị Hoàng Anh đã báo cáo việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất, trong đó nổi bật là 24-methylenecycloartane-3β,21-diol, từ cây song môi tàu Miliusa sinensis Finet et Gagnep thuộc họ Annonaceae.
Vào tháng 4 năm 2007, mẫu thực vật được thu hái tại Mai Châu, Hòa Bình bao gồm cành và lá Hợp chất này chưa được thử nghiệm hoạt tính sinh học trong nghiên cứu.
Hợp chất 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid (ID:VNPD_186)
Hình 3.5: Minh họa 2 chiều tương tác của 20(R),24(E)-3-oxo-9β- lanosta-7,24-dien-26-oic acid trong trung tâm hoạt động của Il-6
Hợp chất 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid tương tác với Gln175 qua liên kết hydro (khoảng cách 2,11 Ǻ) và Arg179 (khoảng cách 2,23 Ǻ), đồng thời có sự tương tác kỵ nước với Leu33 và Leu178 Năng lượng liên kết của hợp chất này được xác định là ΔG = -7,1 kCal/mol.
Cây na rừng tên khoa học Kadsura coccinea (Lem.)A.C Smith thuộc chi nắm cơm (Kadsura Juss), họ ngũ vị (Schisandraceae Blume) Cây phân bố chủ © S chool of Medicine and
Cây na rừng (Kadsura coccinea) ở vùng nhiệt đới Nam Á và Đông Nam Á được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc để chữa trị nhiều bệnh như phong thấp, viêm loét dạ dày, và đau bụng Rễ cây không chỉ giúp hạ huyết áp mà còn có tác dụng bảo vệ gan, kháng khuẩn và chống oxy hóa Năm 2009, Phạm Văn Kiệm và đồng nghiệp đã phân lập thành công các hợp chất từ cây na rừng, trong đó có hợp chất 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid, đánh dấu lần đầu tiên phát hiện từ loài thuộc chi Kadsura Mẫu rễ được thu hái tại Tràng Định, Việt Nam, chứng minh giá trị dược liệu của cây này.
Lạng Sơn Trong nghiên cứu này, tác giả chưa thử hoạt tính sinh học của chất
Hợp chất 3,6,7-Tri-O-acetyl-α-mangostin (ID:VNPD_254)
Hình 3.6: Minh họa2 chiều tương tác của 3,6,7-Tri-O-acetyl-α- mangostin trong trung tâm hoạt động của Il-6 © S chool of Medicine and
Hợp chất 3,6,7-Tri-Oacetyl-α-mangostin tương tác với các amino acid như Arg30 (khoảng cách 2,29 Ǻ), Gln175 (2,35 Ǻ) và Arg179 (2,3 Ǻ) thông qua liên kết hydro, đồng thời tạo liên kết kỵ nước với Leu33, Leu178 và Arg182 Năng lượng liên kết của hợp chất này được xác định là ΔG = -7,0 kCal/mol.
Cây thành ngạnh trơn có tên khoa học là Cratoxylum cochinchinense
Cây thành ngạnh trơn (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume) thuộc họ Clusiaceae, là loài cây nhiệt đới phổ biến ở Đông Nam Á Trong y học cổ truyền, cây này được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý như ho, tiêu chảy, sốt và lở loét Nghiên cứu của Yulin Ren và các đồng nghiệp vào năm 2011 đã phát hiện và phân lập hợp chất 3,6,7-Tri-Oacetyl-α-mangostin từ cây thành ngạnh trơn, với mẫu cây được thu thập tại khu bảo tồn thiên nhiên Hòn Bà, Diên Khánh, Khánh Hòa, Việt Nam Nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành thử nghiệm tác dụng gây độc của hợp chất này đối với tế bào ung thư đại tràng HT-29.
Hợp chất 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin (ID:VNPD_256)
Hình 3.7: Minh họa 2 chiều tương tác của 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin trong trung tâm hoạt động của IL-6 © S chool of Medicine and
Hợp chất 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin có khả năng tạo liên kết hydro với các amino acid Gln175 (2,4 Ǻ) và Arg179 (2,18 Ǻ), đồng thời tương tác kỵ nước với Arg30, Leu33, Leu178, và Arg182 Năng lượng liên kết của hợp chất này với đích phân tử đạt giá trị ΔG = -7,2 kCal/mol.
Cây thành ngạnh trơn có tên khoa học là Cratoxylum cochinchinense
Cây thành ngạnh trơn (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume) thuộc họ Clusiaceae, là loài cây nhiệt đới phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á Trong y học cổ truyền, cây được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như ho, tiêu chảy, sốt và lở loét Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Yulin Ren đã phân lập thành công hợp chất 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin từ cây này, với mẫu thu thập tại khu bảo tồn thiên nhiên Hòn Bà, Diên Khánh, Khánh Hòa, Việt Nam Nghiên cứu cũng đã thử nghiệm tác dụng gây độc của hợp chất đối với tế bào ung thư đại tràng HT-29.
Hợp chất 3-epibartogenic acid (ID:VNPD_267)
Hình 3.8: Minh họa 2 chiều tương tác của 3-epibartogenic acid trong trung tâm hoạt động của IL-6 © S chool of Medicine and
Hợp chất 3-epibartogenic acid tạo ra các liên kết hydro với các amino acid Arg30 (2,69 Ǻ), Arg179 (1,87 Ǻ) và Arg182 (1,79 Ǻ), cùng với các liên kết kỵ nước với Leu33 và Leu178 Năng lượng liên kết của hợp chất này được xác định là ΔG = -7,4 kCal/mol.
Vừng (Sesamum indicum L.) là một trong những cây trồng quan trọng nhất thế giới, với hạt và dầu được sử dụng rộng rãi như thực phẩm tốt cho sức khỏe Chiết xuất từ lá vừng có tác dụng chống viêm loét dạ dày và kháng khuẩn Nghiên cứu từ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập thành công hợp chất 3-epibartogenic acid từ lá vừng, hợp chất này mạnh mẽ ức chế enzyme α-amylase, enzyme quan trọng trong quá trình hấp thu glucose và tiêu hóa carbohydrate, mở ra hướng điều trị mới cho bệnh đái tháo đường Lá vừng được thu thập tại Mỹ Đức.
Vừng và dầu vừng có nhiều công dụng trong Đông y, bao gồm việc bổ dưỡng, hỗ trợ nhuận tràng và kích thích tiết sữa Ngoài ra, y học hiện đại cũng sử dụng dầu vừng để chế tạo thuốc tiêm.
Hợp chất 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid (ID:VNPD_309)
Hình 3.9: Minh họa 2 chiều tương tác của 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid trong trung tâm hoạt động của IL-6 © S chool of Medicine and
Hợp chất 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid có liên kết hydro với Arg179 (khoảng cách 1,96 Ǻ) đồng thời liên kết kỵ nước với Leu33, Leu178
Năng lượng liên kết ΔG = -7,3 kCal/mol
Ngũ gia bì chân chim, với tên khoa học là Schefflera octophylla (Lour.), thuộc họ Araliaceae và phổ biến ở Đông Nam Á, được sử dụng trong y học cổ truyền Việt Nam như một loại thuốc bổ và tác nhân chống thấp khớp Năm 1992, nhóm nghiên cứu do T V Sung và C Lavaud dẫn đầu đã công bố việc phân lập thành công hợp chất mới 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid từ cây ngũ gia bì chân chim.
Trong báo cáo này, nhóm tác giả chưa thử hoạt tính sinh học với hợp chất này
Hợp chất 6-O-benzoyl-α-mangostin (ID:VNPD_393)
Hình 3.10: Minh họa 2 chiều tương tác của 6-O-benzoyl-α-mangostin trong trung tâm hoạt động của Il-6 © S chool of Medicine and
Hợp chất 6-O-benzoyl-α-mangostin có liên kết hydro với Arg179 (khoảng cách 2,57 Ǻ) đồng thời liên kết kỵ nước với Lys66, Met67, Phe74, Gln175, Ser176 Nănglượng liên kết ΔG = -7,1 kCal/mol
Cây thành ngạnh trơn có tên khoa học là Cratoxylum cochinchinense
BÀN LUẬ N
V ề phương pháp
Nghiên cứu và phát triển thuốc hiện nay được chia thành 4 giai đoạn chính: tìm kiếm hoạt chất tiềm năng, thử nghiệm tiền lâm sàng, thử nghiệm lâm sàng, và cuối cùng là đăng ký và đưa ra thị trường Quá trình này thường kéo dài hơn 10 năm.
Trong quá trình phát triển thuốc mới, từ 10.000 hoạt chất tiềm năng, chỉ còn lại một hoạt chất sau bốn giai đoạn thử nghiệm, với chi phí lên đến 2-3 tỷ USD và nhiều thất bại Để tiết kiệm thời gian và chi phí, các công ty dược phẩm lớn đã áp dụng sàng lọc ảo in silico, sử dụng cơ sở dữ liệu lớn về hợp chất tự nhiên và tổng hợp được cập nhật thường xuyên Việc dự đoán tính chất dược lý và động học trở nên dễ dàng hơn, cho phép phân tích hàng loạt hợp chất trên máy tính Phương pháp docking phân tử giúp xác định khả năng một chất có thể gắn vào trung tâm hoạt động của protein, từ đó phân tích năng lượng liên kết và tương tác để đánh giá hoạt tính ức chế protein Điều này không chỉ giúp dự đoán tác dụng sinh học mà còn thu hẹp cơ sở dữ liệu, tăng khả năng thành công của các hợp chất trong các thử nghiệm sâu hơn.
Cơ chế ức chế IL-6 thông qua liên kết tại vị trí Arg179 chỉ mới được xác nhận trên chuột Quá trình sàng lọc docking sử dụng nhiều phần mềm với các thuật toán khác nhau có thể dẫn đến kết quả không đồng nhất Vì vậy, cần tiếp tục thử nghiệm trên các mô hình thực nghiệm như tế bào hoặc động vật để xác định ứng viên thuốc tiềm năng từ kết quả nghiên cứu này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây chúng tôi rút ra các kết luận sau:
Đã tiến hành sàng lọc các hợp chất tự nhiên từ cơ sở dữ liệu VNPD với khả năng ức chế IL-6, nhằm điều trị viêm khớp dạng thấp thông qua phương pháp docking Kết quả cho thấy có 10 hợp chất, trong đó nổi bật là (-)-Hydnocarpin với mã ID: VNPD_001.
20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic có ID:VNPD_186; 24- methylenecycloartane-3β,21-diol có ID: VNPD_202; 3,6,7-Tri-Oacetyl-α- mangostin có ID: VNPD_254; 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin có ID:
VNPD_256; 3-epibartogenic acid có ID:VNPD_267; 3α-hydroxy-urs-12- ene-23,28-dioic acid có ID:VNPD_309; 6-O-benzoyl-α-mangostin có
ID:VNPD_393; 9-hydroxycanthin-6-O-glucopyranoside có
ID:VNPD_427; apigenin 7-O-β-D-glucosid có ID:VNPD_465
- Đã nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử , đặc điểm dược liệu và tính giống thuốc của 10 hợp chất thiên nhiên đã sàng lọc được
Để tiếp tục phát triển các kết quả của khóa luận về việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế IL-6, chúng tôi xin đề xuất một số kiến nghị nhằm thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực này.
Tiến hành nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý của các hợp chất đã phát hiện, đồng thời thử nghiệm hoạt tính sinh học để xác minh kết quả nghiên cứu.
- Tiến hành nghiên cứu sâu thêm về cơ chếức chế Interleukin-6 ởngười © S chool of Medicine and
1 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà Xuất Bản
2 Nguyễn Thị Ngọc Lan (2015), vai trò của interleukin 6 trong cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm khớp dạng thấp và hiệu quả của thuốc ức chế interleukin 6-tocilizumab trong điều trị bệnh, Luận văn tiến sỹ Việt Nam
3 Nguyễn Thị Thanh Tâm và các cộng sự (2014), " Về thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack.) ", Hóa học 52(1)
4 Nguyễn Xuân Dũng và Lê Thanh (1996), "Compositional Analysis of the
Leaf, Stem and Rhizome Oils of Piper ZoZot C DC from Vietnam",
Journal of Essential Oil Research 8, tr 649-652
5 Nguyễn Xuân Dũng và Lê Thanh (2008), "Các hợp chất flavonoid glycosid phân lập từ cây lá lốt (Piper lolot C.DG.) ở Việt Nam", Tạp chí Dược học 383(3), tr 14-17
6 Phạm Văn Kiệm và các cộng sự (2009), "Các hợp chất dibenzocyclooctadien lignan, cerebrosid và triterpen phân lập từ rễ cây na rừng (Kadsura coccinea (Lem.)A.C Smith )", Tạp chí Dược học 401, tr
7 Bùi Văn Thanh (2013), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sử dụng các loài trong chi Nắm cơm (Kadsura Fuss.) ở Việt Nam, Luận văn
Tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh Thái và Tài nguyên sinh vậtViệt Nam
8 Lê Thanh (2016), "New flavonoid and pentacyclic triterpene from
Sesamum indicum leaves", Nat Prod Res 30(3), tr 311-5
9 Trần Thị Thanh Thuỷ và N.T.H.A (2010), "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây song môi tàu [Miliusa Sinensis Finet et Gagnep.], họ na (Ann0naceae)", JOURNAL OF SCIENCE AND
TECHNOLOGY 5(48), tr 7 © S chool of Medicine and
10 Bleicher K H và các cộng sự (2003), "Hit and lead generation: beyond high-throughput screening", Nat Rev Drug Discov 2(5), tr 369-78
11 Dayer J M và Choy E (2010), "Therapeutic targets in rheumatoid arthritis: the interleukin-6 receptor", Rheumatology (Oxford) 49(1), tr 15-
12 Fontaine V và các cộng sự (1993), "Involvement of the Arg179 in the active site of human IL-6", Eur J Biochem 211(3), tr 749-55
13 Irwi J J và Shoichet B K (2005), "ZINC a free database of commercially available compounds for virtual screening", J Chem Inf Model 45(1), tr 177-82
14 Jacobsson Micael và Smith Adam E (2008), Structure-Based Virtual
Screening New Methods and Applications in Infectious Diseases
15 Jain A N (2006), "Scoring functions for protein-ligand docking", Curr
16 Khanijo T và Jiraungkoorskul W (2016), "Review Ergogenic Effect of
Long Jack, Eurycoma Longifolia", Pharmacogn Rev 10(20), tr 139-142
17 Kim D và các cộng sự (2017), "Synthesis of benzoxazole derivatives as interleukin-6 antagonists", Bioorg Med Chem 25(12), tr 3127-3134
18 Kim G W và các cộng sự (2015), "IL-6 inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis: past, present, and future", Arch Pharm Res 38(5), tr
19 Kim S và các cộng sự (2016), "PubChem Substance and Compound databases", Nucleic Acids Res 44(D1), tr D1202-13
20 Kitchen D B và các cộng sự (2004), "Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications", Nat Rev Drug Discov 3(11), tr 935-49 © S chool of Medicine and
21 Krovat E M., Steindl T và Langer T (2005), "Recent Advances in
22 Lopez-Vallejo F và các cộng sự (2011), "Integrating virtual screening and combinatorial chemistry for accelerated drug discovery", Comb Chem
23 McInnes I B và Schett G (2007), "Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis", Nat Rev Immunol 7(6), tr 429-42
24 Morris G M và các cộng sự (1996), "Distributed automated docking of flexible ligands to proteins: parallel applications of AutoDock 2.4", J Comput Aided Mol Des 10(4), tr 293-304
25 Murakami M và Nishimoto N (2011), "The value of blocking IL-6 outside of rheumatoid arthritis: current perspective", Curr Opin Rheumatol 23(3), tr 273-7
26 Pan L và các cộng sự (2009), "Bioactivity-guided isolation of cytotoxic constituents of Brucea javanica collected in Vietnam", Bioorg Med Chem
27 Rose-John S và các cộng sự (2006), "Interleukin-6 biology is coordinated by membrane-bound and soluble receptors: role in inflammation and cancer", J Leukoc Biol 80(2), tr 227-36
28 Scannell J W và các cộng sự (2012), "Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency", Nat Rev Drug Discov 11(3), tr 191-
29 Sung T V và các cộng sự (1992), "Triterpenoids and their glycosides from the bark of Schefflera octophylla", Phytochemistry 31(1), tr 227-31
30 Trott O và Olson A J (2010), "AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading", J Comput Chem 31(2), tr 455-61
31 Vyas V K và các cộng sự (2012), "Homology modeling a fast tool for drug discovery: current perspectives", Indian J Pharm Sci 74(1), tr 1-17.
