TỔNG QUAN
Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp
Viêm khớp dạng thấp (RA) là bệnh viêm khớp mạn tính phổ biến, đặc trưng bởi viêm đa khớp, gây ra triệu chứng tê cứng, đau và sưng khớp, đồng thời có thể ảnh hưởng đến các cơ quan khác trong cơ thể Tại Việt Nam, hàng năm có khoảng 750 – 800 người mắc mới bệnh này trên một triệu dân từ 15 tuổi trở lên, với tỷ lệ mắc bệnh khoảng 0,5% dân số, trong đó 80% là nữ giới Mặc dù nguyên nhân chính xác của viêm khớp dạng thấp chưa được xác định, bệnh được cho là có tính chất di truyền.
Bệnh viêm khớp dạng thấp là một bệnh tự miễn, trong đó kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể và được nhận diện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên như đại thực bào và tế bào đuôi gai Những tế bào này sau đó trình diện kháng nguyên cho các tế bào lympho T và B Khi tế bào lympho T CD4 (T help) được kích hoạt, chúng sản xuất ra các lymphokin như Interleukin-4, 10, 13, kích thích tế bào lympho B tăng sinh và biệt hóa thành tương bào, từ đó sản xuất ra các globulin miễn dịch, tạo thành các thể tự kháng.
Màng hoạt dịch khớp xuất hiện tình trạng lắng đọng phức hợp miễn dịch kháng nguyên – kháng thể, dẫn đến sự hiện diện của thực bào và các bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, tế bào mastocyt Những tế bào này tiết ra các cytokine như TNF-α, IL-1,2,6, interferon, và VEGF, tạo ra vòng xoắn bệnh lý thúc đẩy viêm Sự tăng sinh mạch do VEGF và sự xâm nhập của các tế bào viêm khác hình thành màng mạch (mảng pannus), xâm lấn vào đầu xương và sụn khớp, giải phóng enzym tiêu hủy tổ chức như stromelysin, elastase, collagenase, gây phá hủy khớp và dính khớp, dẫn đến tàn tật Cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào đều tham gia vào quá trình này, với lympho T đóng vai trò trung tâm Dựa trên cơ chế bệnh sinh này, các nhà khoa học đã phát triển thuốc nhằm kích hoạt hoặc sửa chữa hệ miễn dịch, ức chế các tế bào và cytokine để kiểm soát tình trạng viêm của bệnh.
Tổng quan về Interleukin-6
IL-6 là một glycopeptide nặng 26 kDa, được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể số 7, bao gồm 212 axit amin được sắp xếp thành bốn chuỗi α Chất này được sản xuất bởi nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân, nguyên bào sợi, tế bào nội mô và một số tế bào khối u.
IL-6 là một cytokine quan trọng, được phát hiện với nồng độ cao trong dịch ổ khớp của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA) Chất này đóng vai trò chủ yếu trong việc gây ra nhiều tác động tại chỗ và toàn thân trong bệnh lý này IL-6 kết hợp trực tiếp với phức hợp thụ thể màng IL-6, góp phần vào các cơ chế viêm và tổn thương khớp.
Sự hoạt hóa của tế bào viêm như đại thực bào và bạch cầu trung tính do MIL-6R và glycoprotein-130 dẫn đến các phản ứng viêm, gây hủy hoại sụn khớp và xương IL-6 có khả năng kích hoạt các tế bào không có thụ thể màng IL-6, miễn là chúng chứa thụ thể gp-130 Cơ chế này liên quan đến thụ thể IL-6 dạng hòa tan (SIL-6R) Nồng độ IL-6 và thụ thể IL-6 dạng hòa tan tăng cao có mối liên hệ với mức độ trầm trọng và sự tiến triển của bệnh.
Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6
Hai con đường truyền tín hiệu kích hoạt phản ứng viêm của IL-6: Truyền tín hiệu cổ điển (classical signalling) qua màng tế bào với vai trò của MIL-6R
Truyền tín hiệu chuyển tiếp (trans-signalling) thông qua SIL-6R [27]
Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó
IL-6, cùng với IL-6R, tạo thành phức hợp với protein gp130, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của viêm khớp dạng thấp Sự tương tác này ảnh hưởng đến quá trình viêm và có thể dẫn đến tổn thương mô trong bệnh lý này Việc hiểu rõ vai trò của IL-6 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân viêm khớp dạng thấp.
RA đặc trưng bởi sự gia tăng yếu tố dạng thấp, bao gồm kháng thể IgM Việc ức chế tế bào B được xem là một phương hướng điều trị hiệu quả cho bệnh RA.
IL-6 cũng được xác định là một yếu tố biệt hóa của tế bào B, ảnh hưởng đến quá trình phát triển của nó [2]
Trong bệnh viêm khớp dạng thấp (RA), trong giai đoạn viêm cấp tính, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và tế bào nội mô tiết ra IL-6, dẫn đến sự gia tăng bạch cầu trung tính trong dịch khớp Bạch cầu trung tính đóng vai trò quan trọng trong viêm và phá hủy khớp nhờ khả năng giải phóng enzym và chất trung gian IL-6 tác động trực tiếp lên bạch cầu trung tính thông qua thụ thể IL-6 trên màng tế bào, và việc ức chế IL-6 đã được chứng minh là có thể ngăn chặn sự bám dính của bạch cầu trung tính Khi bệnh tiến triển từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính, sự ảnh hưởng của IL-6 lên bạch cầu trung tính trở nên rõ rệt hơn.
Nồng độ IL-6 cao trong màng hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA) liên quan đến sự gia tăng phản ứng viêm và tình trạng phá hủy khớp Tổn thương khớp trong RA đặc trưng bởi sự bào mòn xương tại vị trí bám của màng hoạt dịch và hẹp khe khớp, được xác định là do hủy cốt bào IL-6 làm tăng số lượng hủy cốt bào bằng cách tác động lên các tế bào gốc tạo máu từ bạch cầu hạt và đại thực bào dòng hạt.
Trong giai đoạn cấp tính, các phản ứng viêm bao gồm sự phóng thích cytokine tiền viêm và sự gia tăng protein pha viêm cấp tính, chủ yếu được sản xuất tại gan, như CRP IL-6 là yếu tố chính kích thích gan sản xuất các protein này Ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA), nồng độ IL-6 trong huyết thanh có mối tương quan với nồng độ CRP, và hiện nay, IL-6 có thể được định lượng dễ dàng thông qua việc đánh giá nồng độ CRP trong dịch sinh học Nồng độ CRP được coi là dấu hiệu sinh học quan trọng để xác định tình trạng viêm và đánh giá mức độ bệnh.
Các triệu chứng viêm khớp dạng thấp, bao gồm triệu chứng toàn thân và tại chỗ trên các khớp xương, có thể được giải thích bởi tác động của IL-6 Vì vậy, việc ức chế IL-6 trở thành một mục tiêu hợp lý trong điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp.
1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6
Khi xuất hiện đột biến mất đoạn ở protein IL-6, tất cả các protein này đều không có hoạt động sinh học Phản ứng miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng IL-6 cho thấy chỉ các đột biến mất đoạn tại các trình tự 177, 178 và 179 không gây ra thay đổi đáng kể trong cấu trúc nếp gấp Điều này cho thấy rằng các đột biến này không làm mất đi cấu trúc không gian 3 chiều của protein IL-6 Mặc dù IL-6 có đột biến mất đoạn tại trình tự 177, 178, 179, nó vẫn giữ được hoạt tính sinh học liên quan đến cấu trúc 3 chiều Tuy nhiên, protein IL-6 với đột biến ở bộ 3 trình tự acid amin 177-179 không thể cạnh tranh với protein IL-6 nguyên vẹn để liên kết với thụ thể hòa tan SIL-6R, gợi ý rằng ít nhất một trong ba acid amin này có thể tham gia vào vị trí liên kết giữa IL-6 và thụ thể.
Nghiên cứu về thụ thể hòa tan SIL-6R cho thấy, việc tạo ra nhiều đột biến ở các vị trí 177, 178 và 179 đã chỉ ra rằng Arg179 đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của tế bào chuột Sự thay thế duy nhất tại vị trí 179 từ Arg thành Lys vẫn duy trì hoạt tính, chứng tỏ rằng điện tích dương tại vị trí này là cần thiết cho sự liên kết của IL-6 với thụ thể của nó Do đó, Arginine ở vị trí 179 có vai trò thiết yếu, và việc nhắm vào vị trí này trong cấu trúc chuỗi polypeptide IL-6 có thể làm suy giảm hoạt động bình thường của IL-6.
Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc
Quá trình nghiên cứu và phát triển thường được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm hiện nay được minh họa như hình dưới đây:
Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc
Xác định hợp chất Hit
Xác định và tối ưu hợp chất
Lựa chọn chất ứng cử làm thuốc
Thử nghiệm lâm sàng pha I,II,III
Lựa chọn mục tiêu trong phát triển thuốc là việc xác định một mục tiêu cụ thể có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh Các mục tiêu phân tử thường bao gồm thụ thể, enzyme hoặc các phân tử tương tự.
Xác định hợp chất Hit là quá trình tìm kiếm các phân tử có tác dụng mong muốn thông qua một hoặc nhiều thử nghiệm ban đầu Những thử nghiệm này đóng vai trò quan trọng trong việc dự đoán các tác dụng dược lý dự kiến Thông thường, việc xác định hợp chất Hit được thực hiện thông qua phương pháp sàng lọc thông lượng cao (High Throughput Screening).
HTS (High-Throughput Screening) là phương pháp sử dụng các thư viện hợp chất lớn từ 105-106 phân tử để kiểm tra các hợp chất tiềm năng Các hợp chất Hit sẽ trở thành cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về hóa dược, đặc biệt trong giai đoạn xác định và tối ưu hóa hợp chất dẫn đường (Lead) Trong quá trình này, thông tin về tính chất dược lực học và dược động học của các hợp chất được thu thập ngày càng nhiều Việc xác thực giả thuyết dược lý ban đầu và đặt ra nghi vấn trong giai đoạn lựa chọn mục tiêu diễn ra song song Cuối cùng, ứng cử viên thuốc duy nhất đáp ứng đầy đủ các tiêu chí sẽ được đưa vào thử nghiệm lâm sàng.
Sàng lọc ảo là phương pháp sử dụng mô hình phân tử để xác định hợp chất Hit, áp dụng cho thiết kế bộ hợp chất trong sàng lọc cao thông lượng (HTS) và dự đoán các bộ hợp chất nhỏ hơn để thực hiện các thử nghiệm với thông lượng thấp hơn.
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (SVBS) là một phương pháp dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất với protein mục tiêu, dựa trên các phương pháp tính toán và hiểu biết về cấu trúc 3D của phân tử đích.
Cách tiếp cận cơ bản của SVBS là dự đoán cấu dạng liên kết của từng phân tử nhỏ trong thư viện dữ liệu thông qua quá trình docking, từ đó ước lượng năng lượng tự do khi liên kết (scoring) Các hợp chất Hit được xác định bằng cách sắp xếp các hợp chất trong thư viện dựa trên điểm số, và thiết lập một điểm ngưỡng Những hợp chất có điểm số vượt qua ngưỡng sẽ được coi là hợp chất Hit và sẽ được đánh giá thêm.
Phương pháp Docking
Docking là phương pháp phổ biến trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, nhờ khả năng dự đoán chính xác sự hình thành liên kết giữa cấu tử và thụ thể trong túi liên kết Kể từ những năm 1980, docking phân tử đã trở thành công cụ thiết yếu trong nghiên cứu và phát triển thuốc Ngoài việc chỉ ra các liên kết quan trọng, docking còn định lượng khả năng liên kết thông qua các hàm tính điểm, giúp phân hạng mức độ mạnh yếu của các cấu tử.
Docking là quá trình tối ưu hóa nhằm xác định vị trí và cấu hình tối ưu cho cơ chất gắn kết với protein Mục tiêu chính của docking là tìm cấu hình có năng lượng tự do thấp nhất cho toàn hệ thống Để đạt được cấu hình tối ưu, cần liên kết cấu hình không gian với các chỉ số đánh giá khả năng gắn kết của cơ chất lên protein, sau đó áp dụng các thuật toán tìm kiếm hiệu quả.
Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là một phương pháp tìm kiếm phổ biến trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina và GOLD GA dựa trên các nguyên lý của tiến hóa và chọn lọc tự nhiên Thuật toán này mã hóa các tham số của cấu trúc ban đầu thành "nhiễm sắc thể", được biểu diễn bằng một véc tơ Từ nhiễm sắc thể ban đầu, một quần thể được tạo ra ngẫu nhiên để bao phủ một miền năng lượng.
Quá trình chọn lọc quần thể dựa trên đánh giá các “nhiễm sắc thể” thích nghi nhất, tức là những “nhiễm sắc thể” có giá trị năng lượng thấp nhất, nhằm tạo ra quần thể tiếp theo Quy trình này giúp giảm năng lượng trung bình của toàn bộ “nhiễm sắc thể” bằng cách chuyển giao các đặc tính cấu trúc thuận lợi giữa các quần thể Sau nhiều chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng sẽ xác định được một “nhiễm sắc thể” phù hợp với mức năng lượng tối thiểu.
Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm để ước lượng năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor, với năng lượng được biểu diễn qua hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL) tính bằng kCal/mol Dự đoán năng lượng liên kết dựa vào việc đánh giá các tương tác hóa lý quan trọng như tương tác liên phân tử, ảnh hưởng solvat và entropy Độ chính xác của dự đoán tăng lên khi số lượng tham số hóa lý được đánh giá nhiều hơn; tuy nhiên, điều này cũng kéo theo thời gian tính toán dài hơn Do đó, các hàm tính điểm hiệu quả cần phải cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ, điều này rất quan trọng khi làm việc với cơ sở dữ liệu lớn.
Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking
Để chuẩn bị cấu tử, chúng ta có thể lấy cấu trúc từ các hệ thống dữ liệu như Pubchem và Zinc Trong trường hợp không có sẵn, có thể sử dụng phần mềm như ChemDraw hoặc Chemsketch để xây dựng cấu trúc của các cấu tử.
Sau khi hoàn thiện cấu trúc 3D, bước tiếp theo là sử dụng phần mềm để chuẩn bị cấu tử cho chương trình mô phỏng docking Các bước chuẩn bị bao gồm gắn hydro, thiết lập trường lực và xây dựng file pdbqt.
Để chuẩn bị protein, cấu trúc 3D thường được tìm thấy trên ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank) Nếu không có sẵn, có thể xây dựng cấu trúc 3D bằng phương pháp mô phỏng tính tương đồng (homology modeling) Sau khi có cấu trúc 3D, cần sử dụng phần mềm để chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking, bao gồm các bước loại bỏ nước và các cấu tử, thêm hydro, gắn trường lực và xây dựng file pdbqt.
Mô phỏng docking yêu cầu xác định vùng tìm kiếm (grid box) trước khi phần mềm tiến hành tìm kiếm vị trí và cấu trúc phù hợp của cấu tử.
Kích thước vùng tìm kiếm không nên quá lớn để tránh lãng phí thời gian tìm kiếm những khu vực không có ý nghĩa Vị trí của vùng tìm kiếm thường được đặt ở trung tâm hoạt động của protein Sau khi xác định vị trí và kích thước, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất Cấu dạng này cùng với các tương tác của nó với protein sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng.
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
Ngân hàng dữ liệu Protein châu Âu, mã 1ALU, với độ phân giải 1.9Å, được công bố lần đầu bởi Somers và cộng sự Thông tin chi tiết có thể được tìm thấy tại trang web RCSB Protein Data Bank.
Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6 phản ánh qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu
Mật độ electron đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hình học của cấu trúc tinh thể tia X, cho phép xác định tọa độ các nguyên tử và từ đó dựng cấu trúc protein Hình ảnh minh họa cho thấy màu sắc phản ánh mối quan hệ giữa mật độ electron và hình học, với các chỉ số chất lượng hình học được phân loại theo số lượng acid amin ngoại lai: vùng xanh (0 acid amin), vàng (1 acid amin), cam (2 acid amin), và đỏ (3 acid amin) Qua đó, vị trí 177-179 trong chuỗi acid amin (vùng hoạt động) thể hiện chất lượng tốt (màu xanh) và được lựa chọn để nghiên cứu khả năng gắn kết giữa cấu tử và protein.
Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU
Cơ sở dữ liệu sàng lọc được xây dựng từ Cơ sở dữ liệu các hợp chất thiên nhiên Việt Nam (VNPD), bao gồm cấu trúc topo 2 chiều của 1602 hợp chất dược liệu Việt Nam cùng với thông tin về nguồn gốc và tác dụng dược lý đã được nghiên cứu Tuy nhiên, do hạn chế về tài nguyên tính toán, nghiên cứu này chỉ sử dụng dữ liệu của 500 hợp chất đầu tiên từ VNPD.
Máy tính sử dụng là ACER Aspire V3 với hệ điều hành Windows 8 Danh sách phần mềm được sử dụng bao gồm các ứng dụng tải hoặc mua từ các nhà phát triển trên trang web.
- MarvinSketch (https://chemaxon.com/products/marvin)
- MGLtools (http://mgltools.scripps.edu/)
- AutodockVina (http://vina.scripps.edu/)
- Discovery Studio (http://accelrys.com/products/collaborative- science/biovia-discovery-studio/)
Nội dung nghiên cứu
Bước 1 Sàng lọc ra các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD có
Bước 2: Tiến hành nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc của những hợp chất tốt nhất đã được lọc, thông qua việc phân tích các thông số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu chứa các chất này.
Phương pháp nghiên cứu
Quy tắc số 5 của Lipinski chỉ ra rằng dược chất đường uống không vi phạm quá một trong 4 tiêu chí dưới đây:
- Trọng lượng phân tử MW < 500 daltons
- Không nhiều hơn 5 hydro có thể tham gia liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH), HBD ≤ 5
- Không nhiều hơn 10 nguyên tử có độ âm điện lớn có thể tham gia liên kết hydro (bao gồm nguyên tử Oxy và Nitơ), HBA ≤ 10
Hệ số phân bố octanol/nước MlogP ≤ 4,15 được sàng lọc bằng công cụ tính toán của Daina và cộng sự, hiện có thể thực hiện trực tuyến tại trang web http://www.swissadme.ch/ 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên trong CSDL VNPD đã được sàng lọc thông qua việc nhập công thức SMILEs để thu được các cấu trúc và thông số, sau đó phân tích theo quy tắc 5 Mục tiêu của quy trình này là nâng cao tỷ lệ thành công cho các hợp chất trong các giai đoạn phát triển tiếp theo.
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể tia X của IL-6 (1ALU) được tải từ ngân hàng dữ liệu protein (https://www.rcsb.org/structure/1ALU), sau đó tiến hành loại bỏ các nước, ligand SO4 và TLA (tartaric acid) Thêm Hydro, gắn trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt Tất cả các bước này được tiến hành trên phần mềm MGLtools
Chuẩn bị hợp chất: Đưa công thức SMILES các hợp chất tự nhiên vào để vẽ công thức 2D sau đó xây dựng công thức 3D nhờ phần mềm MarvinSketch
Sau cùng, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lực Gasteiger và xây dựng file pdbqt
Dữ liệu bao gồm protein và các thành phần dưới dạng file pdbqt Việc dock được thực hiện bằng phần mềm Autodock, với Grid box có tâm tại Arg179 và kích thước 15×15×15 Ǻ Quá trình này được lặp lại 8 lần, mỗi chất sẽ được dock 3 lần (n = 3).
Docking phân tử là quá trình tìm kiếm cấu hình liên kết tối ưu, trong đó phần mềm Autodock đóng vai trò quan trọng Autodock sử dụng các đánh giá năng lượng tự do liên kết ΔG và số lượng tương tác vật lý để xác định cấu hình tốt nhất Phần mềm này tính toán năng lượng dựa trên đặc tính nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn và các yếu tố tương tác giữa các phân tử, bao gồm năng lượng liên kết Van der Waals, năng lượng liên kết hydro, năng lượng từ desolvat và năng lượng tĩnh điện.
Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của các hợp chất với cấu trúc tinh thể của IL-6.
KẾT QUẢ
Kết quả sàng lọc bằng quy tắc số 5 của Lipinski
Sử dụng công cụ trực tuyến tại http://www.swissadme.ch/ để lọc và loại bỏ các hợp chất không đạt tiêu chuẩn quy tắc số 5, từ 500 hợp chất ban đầu, chỉ còn lại 412 hợp chất đủ điều kiện cho phân tích sâu hơn, tương đương với việc loại bỏ gần 20% các chất.
Sàng lọc docking
Madindoline A được chứng minh có tác dụng ức chế chọn lọc cao IL-6 do vậy chúng tôi sử dụng Mandindoline A làm chất đối chiếu tác dụng
Mandindoline A lấy công thức 3D từ cơ sở dữ liệu Pubchem
CSDL VNPD 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên
Lựa chọn hoạt chất ~96% hợp chất tự nhiên
Khoảng 96% hợp chất tự nhiên ở định dạng file pdbqt khi kết hợp với protein 1ALU định dạng pdbqt thông qua Autodock Vina cho ra năng lượng liên kết ΔG = -7,0 kCal/mol Mandindoline A thể hiện sự liên kết hydro với Arg179 (2.01Å) và Gln175 (2.19Å), cùng với các tương tác kỵ nước khác Do đó, chúng tôi đã chọn tiêu chí ΔG≤-7,0 kCal/mol và liên kết hydro với Arg179 cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong trung tâm hoạt động của IL-6
Quá trình thu hẹp bộ dữ liệu từ 412 hợp chất xuống còn 258 hợp chất đạt tiêu chuẩn tương tác với ARG179 đã loại bỏ gần 40% hợp chất không phù hợp Tiếp theo, 258 hợp chất này được đưa vào quá trình docking bằng phần mềm Autodock với Grid box kích thước 30×30×30 Ǻ, tập trung vào vị trí Arg179 Kết quả phân tích docking bằng Discovery Studio cho thấy có 10 hợp chất có năng lượng liên kết ΔG ≤ -7,0 kCal/mol, tạo liên kết hydro với Arg179 và tương tác với các amino acid khác.
Chọn 10 hợp chất tốt nhất từ kết quả Docking
Dựa trên kết quả từ Docking phân tử, chúng tôi đã lựa chọn 10 chất có khả năng tương tác mạnh với phân tử đích IL-6, đồng thời có năng lượng tương tác thấp nhất.
Bảng 3.1: Kết quả phân tích dữ liệu docking phân tử
Tương tác Túi liên kết
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Leu33, Ser37, Lys171, Leu178, Arg179, Arg182
Tương tác kỵ nước: Leu33, Leu178
Leu33, Ser37, Gln175, Leu178, Arg179
Tương tác kỵ nước: Arg30, Leu33, Lys171 Leu178
Arg30, Leu33, Asp34, Lys171, Leu178, Arg179
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178, Arg182
Liên kết kỵ nước: Arg30, Leu33, Leu178, Arg182
Arg30, Leu33, Gln175, Leu178, Arg179, Arg182
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Arg30, Leu33, Leu178, Arg179, Arg182
3α-hydroxy-urs- 12-ene-23,28- dioic acid
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Liên kết kỵ nước: Lys66, Met67, Phe74, Gln175, Ser176
Lys66, Met67, Phe74, Gln175, Ser176, Arg179
MET67(2,23 Ǻ), GLU172(2,18 Ǻ), Arg179 (2,43 Ǻ) Liên kết kỵ
Met67, Phe74, Glu172, Arg179 nước: Phe74 apigenin 7-O-β- D-glucosid
Liên kết kỵ nước: Leu33, Leu178
Tương tác kỵ nước: Arg30, Leu33, Lys171, Leu178
Arg30, Leu33, Lys171, Gln175, Leu178, Arg179
3.4 Đặc điểm hoá lý của các hợp chất đƣợc chọn
Bảng 3.2 Tính toán các thông số hoá lý trong quy tắc 5 Lipinski của 10 hợp chất đƣợc chọn
Khối lƣợng phân tử MW(dalton)
Hệ số phân bố octanol/nước MLog P
Số lƣợng nguyên tố có thể nhận liên kết Hydro HBA
Số lƣợng nguyên tố có thể cho liên kết Hydro HBD
3α-Hydroxy-urs-12- ene-23,28-dioic acid 486,68 3,86 5 3
Cả 10 hợp chất trên đều thỏa mãn 4 tiêu chí theo Quy tắc số 5 của Lipinski, các thông số thể hiện tính chất dược động học tốt, cho thấy tiềm năng phát triển thành thuốc Theo tính toán bởi công cụ trực tuyến www.swissadme.ch/, các chất này được dự đoán là có sinh khả dụng khoảng 55% và không qua được hàng rào máu não
3.5 Đặc điểm chi tiết từng chất theo tương tác với Interleukin-6 và thông tin về cây dƣợc liệu
Hợp chất (-)-Hydnocarpin (ID: VNPD_001)
Hình 3.3: Minh họa 2 chiều tương tác của (-)-Hydnocarpin trong trung tâm hoạt động của IL-6
Hợp chất (-)-Hydnocarpin có khả năng tạo liên kết hydro với các amino acid Arg179 (2,23 Ǻ) và Gln175 (2,11 Ǻ), cùng với liên kết kỵ nước với Leu33 và Leu178 Năng lượng liên kết của hợp chất này với đích tác dụng đạt giá trị ΔG = -7,0 kCal/mol.
(-)-Hydnocarpin , một flavonolignan, được xác định là thành phần hoá học chiết xuất từ cây xoan rừng Xoan rừng, tên khoa học Brucea javanica (L.) Merr
Simaroubaceae là một loại cây bụi thường xanh, phân bố từ Đông Nam Á đến Bắc Úc Tại Đông Nam Á, tất cả các bộ phận của xoan rừng được sử dụng như một phương thuốc điều trị sốt rét, trong khi hạt giống của cây này giúp giảm bệnh lỵ và một số bệnh ngoài da Năm 2009, nhóm nhà khoa học Li Pan đã phân lập hợp chất flavonolignan (-)-Hydnocarpin từ dịch chiết lá, cành và hoa của xoan rừng ở Khánh Hòa, Việt Nam Hợp chất này cũng được đánh giá có độc tính trên dòng tế bào MCF-7, một loại tế bào ung thư vú ở người.
Hợp chất 24-methylene cycloartane-3β,21-diol (ID:VNPD_202)
Hình 3.4: Minh họa 2 chiều tương tác của 24-methylene cycloartane-
3β,21-diol trong trung tâm hoạt động của IL-6
Hợp chất 24-methylenecycloartane-3β,21-diol tương tác với Asp34 và Arg179 qua liên kết hydro với khoảng cách lần lượt là 2,58 Ǻ và 2,24 Ǻ Ngoài ra, hợp chất này còn có sự tương tác kỵ nước với các amino acid như Arg30, Leu33, Lys171 và Leu178 Năng lượng liên kết của hợp chất được tính toán là ΔG = -7,6 kCal/mol.
Cây song môi tàu, tên khoa học Miliusa sinensis Finet et Gagnep, họ Na
Cây bụi Annonaceae, cao từ 2-4 m, phân bố tại Việt Nam và miền Nam Trung Quốc ở độ cao 500-5000 m Năm 2006, các nhà khoa học thuộc dự án ICBG đã phát hiện nhiều chất mới có khung miliusane với hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng ức chế chọn lọc tế bào ung thư vú từ cây song môi tàu (Miliusa sinensis) ở rừng Cúc Phương Dịch chiết từ cây này chứa Liriodenin, cho thấy hoạt tính gây độc tế bào đối với nhiều loại ung thư như ung thư biểu mô, gan và phổi Hai nhà khoa học Trần Thị Thanh Thủy và Nguyễn Thị Hoàng Anh đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất, trong đó có 24-methylenecycloartane-3β,21-diol từ Miliusa sinensis.
Mẫu thực vật được thu hái tại Mai Châu, Hòa Bình vào tháng 4 năm 2007 bao gồm cành và lá, tuy nhiên hợp chất này chưa được kiểm tra hoạt tính sinh học trong nghiên cứu này.
Hợp chất 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid (ID:VNPD_186)
Hình 3.5: Minh họa 2 chiều tương tác của 20(R),24(E)-3-oxo-9β- lanosta-7,24-dien-26-oic acid trong trung tâm hoạt động của Il-6
Hợp chất 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid có khả năng hình thành liên kết hydro với Gln175 (cách 2,11 Ǻ) và Arg179 (cách 2,23 Ǻ), đồng thời tương tác kỵ nước với Leu33 và Leu178 Năng lượng liên kết của hợp chất này được xác định là ΔG = -7,1 kCal/mol.
Cây na rừng, tên khoa học Kadsura coccinea (Lem.) A.C Smith, chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới Nam Á và Đông Nam Á Theo y học cổ truyền Trung Quốc, rễ cây Kadsura được sử dụng để chữa trị các bệnh như phong thấp, viêm loét dạ dày, đau bụng kinh và sau sinh Quả của cây có tác dụng hỗ trợ thận, điều trị viêm họng, viêm phế quản và thần kinh suy nhược Tại Việt Nam, vỏ thân và rễ cây được dùng làm thuốc bổ, kích thích tiêu hóa, giảm đau và hoạt huyết, đặc biệt người Nùng và Dao sử dụng rễ để hạ huyết áp Nghiên cứu đã chứng minh các chế phẩm từ rễ cây có hoạt tính sinh học như bảo vệ gan, kháng khuẩn và chống oxy hóa Năm 2009, Phạm Văn Kiệm và đồng nghiệp đã phân lập thành công hợp chất 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid từ cây na rừng, đánh dấu lần đầu tiên phát hiện hợp chất này trong chi Kadsura, với mẫu rễ được thu hái tại Tràng Định, Lạng Sơn.
Hợp chất 3,6,7-Tri-O-acetyl-α-mangostin (ID:VNPD_254)
Hình 3.6: Minh họa 2 chiều tương tác của 3,6,7-Tri-O-acetyl-α-
Hợp chất 3,6,7-Tri-Oacetyl-α-mangostin tương tác với các amino acid Arg30, Gln175 và Arg179 thông qua liên kết hydro với khoảng cách lần lượt là 2,29 Ǻ, 2,35 Ǻ và 2,3 Ǻ Đồng thời, hợp chất này cũng tạo liên kết kỵ nước với Leu33, Leu178 và Arg182, với năng lượng liên kết ΔG đạt -7,0 kCal/mol.
Cây thành ngạnh trơn có tên khoa học là Cratoxylum cochinchinense
Cây thành ngạnh trơn (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume) thuộc họ Clusiaceae, là một loài cây nhiệt đới phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á Trong y học cổ truyền, cây này được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như ho, tiêu chảy, sốt và lở loét Năm 2011, nhóm nghiên cứu do Yulin Ren dẫn đầu đã công bố việc phân lập hợp chất 3,6,7-Tri-Oacetyl-α-mangostin từ cây thành ngạnh trơn, với mẫu thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Hòn Bà, Diên Khánh, Khánh Hòa, Việt Nam Ngoài ra, báo cáo cũng đề cập đến việc thử nghiệm tác dụng gây độc của hợp chất này đối với tế bào ung thư đại tràng HT-29.
Hợp chất 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin (ID:VNPD_256)
Hình 3.7: Minh họa 2 chiều tương tác của 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin
Hợp chất 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin tạo liên kết hydro với các amino acid Gln175 (2,4 Ǻ) và Arg179 (2,18 Ǻ), đồng thời hình thành liên kết kỵ nước với Arg30, Leu33, Leu178 và Arg182 Năng lượng liên kết của hợp chất này với mục tiêu phân tử được xác định là ΔG = -7,2 kCal/mol.
Cây thành ngạnh trơn có tên khoa học là Cratoxylum cochinchinense
Cây thành ngạnh trơn (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume) thuộc họ Clusiaceae, là một loài cây nhiệt đới phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á Trong y học cổ truyền, cây này được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như ho, tiêu chảy, sốt và lở loét Nghiên cứu của Yulin Ren và các đồng nghiệp vào năm 2011 đã thành công trong việc phân lập hợp chất 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin từ cây thành ngạnh trơn, với mẫu cây được thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Hòn Bà, Diên Khánh, Khánh Hòa, Việt Nam Nhóm nghiên cứu cũng đã thử nghiệm tác dụng gây độc của hợp chất này đối với tế bào ung thư đại tràng HT-29.
Hợp chất 3-epibartogenic acid (ID:VNPD_267)
Hình 3.8: Minh họa 2 chiều tương tác của 3-epibartogenic acid trong
Hợp chất 3-epibartogenic acid tạo liên kết hydro với các amino acid Arg30 (2,69 Ǻ), Arg179 (1,87 Ǻ) và Arg182 (1,79 Ǻ), đồng thời hình thành liên kết kỵ nước với Leu33 và Leu178, với năng lượng liên kết ΔG đạt -7,4 kCal/mol.
Vừng (Sesamum indicum L.) là một trong những cây trồng quan trọng nhất thế giới, với hạt và dầu được sử dụng rộng rãi như thực phẩm tốt cho sức khỏe Chiết xuất từ lá vừng có khả năng chống viêm loét dạ dày và kháng khuẩn Nghiên cứu của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập thành công hợp chất 3-epibartogenic acid từ lá vừng, hợp chất này ức chế mạnh enzyme α-amylase, đóng vai trò quan trọng trong hấp thu glucose và tiêu hóa carbohydrate, mở ra hướng điều trị tiểu đường Lá vừng được thu thập tại Mỹ Đức.
BÀN LUẬN
Về phương pháp
Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc hiện nay bao gồm bốn giai đoạn chính: tìm kiếm hoạt chất tiềm năng, thử nghiệm tiền lâm sàng, thử nghiệm lâm sàng và cuối cùng là đăng ký và đưa sản phẩm ra thị trường Toàn bộ quy trình này thường kéo dài hơn 10 năm.
Trong quá trình phát triển thuốc mới, từ 10.000 hoạt chất tiềm năng, chỉ còn lại 1 chất sau các giai đoạn thử nghiệm, với chi phí lên đến 2-3 tỷ USD và nhiều thất bại Để tiết kiệm thời gian và chi phí, các công ty dược phẩm lớn đã áp dụng sàng lọc ảo in silico, sử dụng cơ sở dữ liệu lớn về hợp chất tự nhiên và tổng hợp được cập nhật thường xuyên Việc dự đoán các tính chất dược lý và động học trở nên dễ dàng hơn, cho phép tiến hành đồng thời với lượng lớn hợp chất, giúp giảm thiểu thời gian và chi phí nghiên cứu Phương pháp docking phân tử cho phép phân tích khả năng tương tác của các chất với protein, từ đó xác định tính hoạt động ức chế, giúp dự đoán tác dụng sinh học và tăng khả năng thành công của các hợp chất.
Cơ chế ức chế IL-6 thông qua liên kết tại vị trí Arg179 đã được chứng minh chỉ trên chuột Ngoài ra, quá trình sàng lọc docking với nhiều phần mềm khác nhau có thể dẫn đến kết quả không đồng nhất do sự khác biệt trong thuật toán Vì vậy, từ kết quả nghiên cứu này, cần tiếp tục thử nghiệm trên các mô hình thực nghiệm như tế bào hoặc động vật để tìm ra ứng viên thuốc tiềm năng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây chúng tôi rút ra các kết luận sau:
Đã tiến hành sàng lọc các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD với khả năng ức chế IL-6 để điều trị viêm khớp dạng thấp bằng phương pháp docking Kết quả cho thấy có 10 hợp chất tiềm năng, trong đó có (-)-Hydnocarpin với mã ID: VNPD_001.
20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic có ID:VNPD_186; 24- methylenecycloartane-3β,21-diol có ID: VNPD_202; 3,6,7-Tri-Oacetyl-α- mangostin có ID: VNPD_254; 3,6-di-O-acetyl-α-mangostin có ID:
VNPD_256; 3-epibartogenic acid có ID:VNPD_267; 3α-hydroxy-urs-12- ene-23,28-dioic acid có ID:VNPD_309; 6-O-benzoyl-α-mangostin có ID:VNPD_393; 9-hydroxycanthin-6-O-glucopyranoside có
ID:VNPD_427; apigenin 7-O-β-D-glucosid có ID:VNPD_465
- Đã nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử , đặc điểm dược liệu và tính giống thuốc của 10 hợp chất thiên nhiên đã sàng lọc được
Để phát triển các kết quả của khóa luận về việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế IL-6, chúng tôi đề xuất tiếp tục nghiên cứu và khám phá thêm các nguồn tài nguyên thiên nhiên, đồng thời áp dụng các phương pháp hiện đại trong phân tích và đánh giá hoạt tính của các hợp chất này.
Tiến hành nghiên cứu thêm về tác dụng dược lý của các hợp chất đã tìm được, đồng thời thử nghiệm hoạt tính sinh học để xác nhận kết quả nghiên cứu.
- Tiến hành nghiên cứu sâu thêm về cơ chế ức chế Interleukin-6 ở người.