Khóa luận xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol a và alisol b 23 acetat trong dược liệu trạch tả (alisma plantago – aquatica) trồng tại việt nam

TỔ NG QUAN

T ổ ng quan v ề cây Tr ạ ch t ả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.)

Trạch tả, tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., thuộc họ Alismataceae và chi Alisma, còn có tên đồng nghĩa là Alisma plantago-aquatica Tại Việt Nam, Trạch tả được biết đến với các tên gọi khác như thủy đề và mã đền nước.

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây thảo có chiều cao từ 40-50 cm, với thân rễ hình cầu hoặc hình con quay, màu trắng và nạc Lá cây có cuống dài, bẹ to mọc ốp vào nhau, tạo thành hình hoa thị Phiến lá có hình trái xoan hoặc hình trứng, mép lá nguyên lượn sóng và gân lá từ 5-7 hình cung.

Cụm hoa mọc trên một cán thẳng dài, có thể đạt đến 1m, hình thành chùy với nhiều vòng hoa xếp tầng nhỏ dần về phía ngọn Mỗi tầng hoa phân nhánh thành những chùy nhỏ, hoa lưỡng tính có màu trắng hoặc hồng, với đài có 3 răng màu lục tồn tại cho đến khi quả hình thành Tràng hoa gồm 3 cánh, có 1 cựa màu vàng nhạt rất mỏng và rụng sớm Hoa có từ 6 đến 9 nhị, dẹt, và bầu nhiều ô xếp thành một vòng, mỗi ô chứa một noãn, trong khi vòi nhụy mảnh dễ rụng.

Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại

Chi Alisma L có khoảng 10 loài, phân bố từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới và ôn đới ẩm, chủ yếu tại Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam Trong số đó, hai loài được sử dụng làm thuốc là Trạch tả (A plantago-aquatica L.) và A canaliculatum Tại Việt Nam, Trạch tả chủ yếu được trồng ở các tỉnh như Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương và Hưng Yên.

Dược liệu Trạch tả được chiết xuất từ thân rễ của cây Trạch tả, thường được thu hoạch vào tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng Sau khi thu hoạch, cần loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngoài, rửa sạch và sau đó phơi hoặc sấy khô để bảo quản.

Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hòa trong 60 ml nước), sao vàng [4]

Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56]

1.1.4 Thành phần hóa học Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa học ở thân rễ

Các terpenoid được coi là thành phần chính trong Trạch tả, với triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane (alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat) là những hợp chất đặc trưng Ngoài ra, Trạch tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine, phytosterol, acid béo và nhựa Tại Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học trong thân rễ Trạch tả còn hạn chế Nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) đã phân lập được bảy chất từ mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bao gồm alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca-9,12-dienoic acid và octadeca-9,12-dienoic acid methyl ester.

Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong rễ Trạch tả Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu trúc

Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol

A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả

[30] Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6) được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31] Alisol O (7) và alisol P

(8) được phân lập năm 2008 [53] Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18]

(1) AA OH OH OH OH H O

(2) alisol A 24 – acetat OH OH OH OH O O

(5) alisol E OH OH OH OH H O

Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định Năm

In 1994, Nakajima and colleagues isolated kaurane-2,12-dione (10) from the rhizomes of Alisma plantago-aquatica Subsequently, Peng and his team identified two new diterpenoids, oriediterpenol (11) and oriediterpenoside (12), from the same plant's rhizomes.

(12) oriediterpenoside Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.3 Các sequiterpenoid

Có khoảng 36 sequiterpenoid đã được xác định, chia thành 4 nhóm: guaiane, germaraerane, eudesmane và oplopanane

Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33]

Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D (16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B

(18), C, D) [45] [46] Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol

(20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32] Năm 2001, orientalol E (21) thuộc nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34]

(14) Alismoxide CH3 OH OH CH3

(17) Orientalol A OH OH OH CH3

(18) Sulfoorientalol B HSO3 OH OH CH3

(19) 10-O-methyl-alismoxit OCH3 OH OH OCH3

(20) eudesma-4(14)-en-1,6-diol (21) orientalol E Hình 1 5 Công thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả

Có khoảng 9 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trạch tả: robustaflavon, amentoflavon, 2,20,4 – trihydroxylchalcone, daidzein, calycosin, 7 – hydroxyl – coumarin, apigene, luteolin, emodin [15,24]

Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn chất polysaccharides [39] Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là alisman PII và alisman SI [37,40]

1.1.5 Một số tác dụng dƣợc lý

Trạch tả, một thảo dược lâu đời trong Y học cổ truyền Trung Hoa, được sử dụng chủ yếu để điều trị tình trạng thiểu niệu Nghiên cứu trên chuột đã chỉ ra rằng dịch chiết EtOH từ trạch tả có hiệu quả trong việc cải thiện tình trạng này.

Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg đã cho thấy khả năng làm tăng lượng nước tiểu, mặc dù mức tăng này thấp hơn so với hydroclothiazid Nghiên cứu trên chuột Sprague-Dawley cho thấy rằng dịch chiết ethanol từ Trạch tả có tác dụng lợi tiểu hiệu quả ở liều thấp (2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg), nhưng khi sử dụng ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg) lại dẫn đến sự giảm đáng kể lượng nước tiểu.

Khảo sát các dịch chiết khác cho thấy dịch chiết n-butanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) có tác dụng làm tăng lượng nước tiểu, trong khi dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800 mg/kg) lại làm giảm lượng nước tiểu Điều này cho thấy tác động sinh học của các dịch chiết Trạch tả trên thận là khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng, vì vậy liều lượng sử dụng cần được chú ý trong các ứng dụng lâm sàng.

Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2017) đã đánh giá tính tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu Kết quả cho thấy tỷ lệ thành phần tối ưu cho hoạt động lợi tiểu là: AB23 : alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate với tỷ lệ 7.2: 0.6: 2.8: 3.0.

Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley đã chứng minh tác dụng hạ lipid máu của alisol A 24-acetat với liều 425 mg/kg Nghiên cứu gần đây cho thấy Trạch tả với liều 2,26 g/kg/ngày có khả năng giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, đồng thời làm tăng nồng độ HDL huyết thanh Điều này cho thấy Trạch tả có tác dụng giảm tổng hợp cholesterol ở gan thay vì chỉ tăng cường quá trình chuyển hóa cholesterol.

Một nghiên cứu khác trên chuột gây đột biến gen apoE và làm tăng sự biểu hiện heparan sulfate proteoglycan ở gan cho thấy Trạch tả và simvastatin

Với liều lượng gấp 10 lần so với liều sử dụng trên người, V NU có tác dụng điều trị hiệu quả đối với chứng xơ vữa động mạch, giúp giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL.

Trạch tả có khả năng làm giảm cholesterol ở chuột, giúp ngăn ngừa tăng lipid máu Tuy nhiên, nghiên cứu hiện tại vẫn còn hạn chế và cần thêm để áp dụng trong điều trị lâm sàng.

Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat

1.2.1.1 C ấ u trúc hóa h ọ c và tính ch ấ t

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA

Công thức phân tử: C 30 H 50 O 5 Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy –4,4,8,10,14 – pentamethyl – 17 – [(2R, 4S, 5R) – 4,5,6 – trihydroxy – 6 –

V NU methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a] phenathren – 3 – one

Tên thông thường: alisol A Tính chất: - Dạng bột, màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 90 - 91 0 C

- Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol

Nghiên cứu sơ bộ đã chỉ ra rằng những thay đổi đơn giản trong cấu trúc gốc AA có thể tạo ra các dẫn xuất tiềm năng chống lại virus viêm gan B (HBV) Trong số 40 dẫn xuất của AA được tổng hợp và khảo sát, 14 chất đã được xác định là có hoạt tính chống virus Đặc biệt, hợp chất 6a cho thấy hoạt tính cao trong việc ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt với IC50 là 0,024 mM và kháng nguyên HBV e với IC50 là 0,028 mM, cho thấy chỉ số an toàn cao (SIHBsAg > 108, SIHBeAg > 93).

Các thử nghiệm trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các hợp chất A1, A23, A24 có hoạt tính cao trong việc ức chế sự tiết kháng nguyên bề mặt HBV, với giá trị IC50 lần lượt là 0,0048, 0,0044 và 0,014 mM Ngoài ra, các hợp chất này cũng cho thấy khả năng kháng kháng nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng là 0,011, 0,012 và 0,018 mM.

> 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200, SIHBeAg > 156 Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F@,9%) [51]

Nghiên cứu của Ma và cộng sự (2016) chỉ ra rằng AA có khả năng kháng khuẩn hiệu quả đối với các chủng Gram dương như Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus, với giá trị MIC nằm trong khoảng 12,5-100mg/mL.

Nghiên cứu của Kubo và cộng sự (1997) cho thấy rằng hàm lượng AA ở mức 0,05mmol/kg và 0,2mmol/kg có tác động tích cực đối với bệnh nhân mắc hiện tượng arthus.

1.2.2 Tổng quan về alisol B 23 – acetat

1.2.2.1 C ấ u trúc hóa h ọ c và tính ch ấ t

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23

Công thức phân tử: C 32 H 50 O 5 Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3- [(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo-

1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl] acetate

Tên thông thường: alisol B 23 - acetat Tính chất: Dạng bột, màu trắng Trọng lượng phân tử: 514,747 g/mol

1.2.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý

Nghiên cứu của Chen và cộng sự chỉ ra rằng ở bệnh nhân thận mãn tính, sự kích hoạt các trục RAS/Wnt/β-catenin gây tổn thương tế bào biểu mô ống thận, tuy nhiên tình trạng này đã được cải thiện khi sử dụng AB23.

Năm 2017, một nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá tác động bảo vệ của AB23 với bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) ở chuột

Nghiên cứu cho thấy NASH được gây ra khi chuột ăn chế độ thiếu methionine và choline trong 4 tuần, sau đó mẫu máu và gan được thu thập Kết quả cho thấy điều trị với AB23 đã giảm đáng kể sự tích lũy triglycerid ở gan, từ đó làm giảm nguy cơ viêm và xơ gan.

Nghiên cứu cho thấy AB23 có tác dụng bảo vệ gan khỏi độc tính và ứ mật do 17α-ethinylestradiol (EE) gây ra AB23 giảm tổng hợp acid mật bằng cách ức chế biểu hiện gen Cyp7a1 và Cyp8b1, đồng thời tăng cường chuyển hóa acid mật thông qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1.

AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17]

 Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng

Năm 2016, Zhang và cộng sự đã thực hiện xét nghiệm MTT kết hợp với phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư buồng trứng sau điều trị với AB23 Kết quả cho thấy AB23 có tác dụng ức chế đáng kể biểu hiện của ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, làm giảm mức độ protein CDK4, CDK6 và cyclin D, từ đó ngăn chặn chu trình tế bào ở pha G1 AB23 cũng ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của tế bào ung thư buồng trứng.

Ngoài ra, AB23 còn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21], ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian P- glycoprotein [41]…

M ộ t s ố nghiên c ứu định tính, định lượ ng AA và AB23 trong Tr ạ ch t ả

1.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng AA và AB23 trong Trạch tả 1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới vềđịnh lượng AA và AB23 trong

TLTK Đối tƣợng phân tích Điều kiện phân tích

[55] AA, alisol A 24- acetate và AB23

- Phương pháp chiết: Siêu âm

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (65:35)

+ Bước sóng phát hiện: 210 nm và 254 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

+ Nhiệt độ cột: 35 O C + Thể tớch tiờm mẫu: 10àL

- Phương pháp chiết: Siêu âm

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (65:35)

+ Bước sóng phát hiện: 208 nm + Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút + Nhiệt độ cột: 25 O C

[22] AB23 - Dung môi chiết: ACN

- Phương pháp chiết: Siêu âm

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (75:25)

+ Bước sóng phát hiện: 215 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu Trạch tả còn rất ít

Nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc đã sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp để phân lập và xác định bảy hợp chất từ mẫu Trạch tả, bao gồm alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester.

AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]

1.3.3 Tiêu chuẩn vềdƣợc liệu Trạch tả trong một sốDƣợc điển

Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đưa chuyên luận dược liệu Trạch tả vào quy định trong Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam…

Theo quy định của Dược điển Trung Quốc (2015), phương pháp HPLC được áp dụng để định lượng AB23 trong thân rễ Trạch tả Quy trình xử lý mẫu bao gồm việc chiết siêu âm 0,5 g mẫu dược liệu với 25 ml ACN trong 30 phút Hệ dung môi pha động sử dụng là ACN:W (73:27, v/v), với detector UV hoạt động ở bước sóng 208nm và cột C18.

Dược điển Trung Quốc quy định, mẫu thử phải có chứa ít nhất 0,050% AB23 tính theo mẫu khô kiệt [9]

Dược điể n H ồ ng Kông cũng sử dụng HPLC để định lượng alisol B monoacetate: 1 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 20 mL MeOH trong

30 phút Detector UV ở bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút Pha động được lựa chọn là ACN:W với chương trình rửa giải:

Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông

Dược điển Hồng Kông cũng quy định, mẫu phải có chứa ít nhất 0,082% alisol B monoacetat [38]

Chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV) hiện chưa quy định chỉ tiêu định lượng hoạt chất chính, chỉ đưa ra các tiêu chí thông thường như độ ẩm, tro toàn phần và tro không tan trong acid Do đó, chuyên luận này không thể đánh giá chính xác chất lượng dược liệu Trạch tả tại Việt Nam cũng như các mẫu nhập khẩu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Nguyên v ậ t li ệ u, thi ế t b ị nghiên c ứ u

2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Trạch tả được thu hái tại Ninh Bình và lưu trữ tại Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng 3/2018 Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành thu thập các mẫu dược liệu Trạch tả tại một sốcơ sở trên thị trường Hà Nội để tiến hành áp dụng phương pháp đã xây dựng

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tảlưu trữ tại Viện Dược liệu

STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu

1 M1 Vũ Thị Bình 30 Lãn Ông

2 M2 Nguyễn Thị Ban 32 Lãn Ông

3 M3 Nguyễn Thị Sáu 54 Lãn Ông

5 M5 Phan Thị Tý 63A Lãn Ông

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Chất chuẩn AA do hãng Biopurify Phytochemicals Ltd cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%

Chất chuẩn AB23 do hãng Sigma – Aldrich cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%

Các dung môi hóa chất dùng cho phân tích HPLC đều đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết của hãng Merck

Các dung môi hóa chất dùng cho xử lý mẫu đều đạt chuẩn tinh khiết phân tích

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Cân phân tích (Sartorius, BP-221S)

Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)

Cân xác định độẩm (Sartorius, MA – 45) Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15- LC)

Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5)

Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu bao gồm các thiết bị chính như bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A và bộ phận ổn nhiệt CTO-20A.

Các dụng cụthông thường ở phòng thí nghiệm.

N ộ i dung nghiên c ứ u

2.2.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng

- Khảo sát hệdung môi pha động

2.2.2 Định lƣợng AA bằng HPLC

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu

+ Dung môi chiết + Tỷ lệ dung môi chiết

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp.

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Tính thích hợp hệ thống

2.2.3 Phân tích mẫu thực Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính AA và AB23; định lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường.

Phương pháp nghiên cứ u

2.3.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng

Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với

Trong quy trình, 30 ml methanol (MeOH) được xử lý trong 30 phút, sau đó lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm Sau khi cô cạn dung môi, mẫu được hòa tan trong 1 ml MeOH, tạo thành dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng.

- Cân khoảng 1 mg chuẩn AA, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH

- Cân khoảng 1 mg chuẩn AB23, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH

- Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254

- Pha động: Để tìm được hệ dung môi phù hợp, cho các vết tách biệt nhau trên bản

Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)

Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)

Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1) + Định tính AB23:

Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)

Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)

Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)

- Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol

2.3.2 Định lƣợng AA bằng HPLC 2.3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử:

Để chuẩn bị dung dịch thử, cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu Trạch tả vào ống ly tâm 50 ml, sau đó thêm khoảng 25 ml EtOH Tiến hành siêu âm trong 30 phút và lọc dung dịch qua màng cellulose acetat 0,45 μm.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 5 mg chuẩn AA và hòa tan trong khoảng 5 ml MeOH, tạo thành dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml Sau đó, tiến hành pha loãng để tạo ra các dung dịch chuẩn trung gian với nồng độ thích hợp.

2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát chương trình pha động cho thấy việc sử dụng dung môi ACN (kênh A) kết hợp với H2O (kênh B) ở các tỷ lệ khác nhau mang lại hiệu quả trong quá trình rửa giải.

Các kết quả khảo sát được đánh giá dựa trên thời gian lưu (tR) của AA, độ phân giải (R S) và hệ số kéo đuôi của pic (A S) Để đảm bảo chất lượng phân tích, yêu cầu R S phải lớn hơn hoặc bằng 1,5, A S nằm trong khoảng 0,8 đến 1,5, và thời gian lưu (tR) của các chất phân tích không được quá dài nhưng phải đảm bảo sự tách biệt rõ ràng giữa chúng.

2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Khảo sát dung môi chiết là một bước quan trọng để xác định hiệu suất chiết cao nhất Chúng tôi đã thử nghiệm các dung môi như EtOH và hỗn hợp MeOH : H2O với nhiều tỷ lệ khác nhau nhằm lựa chọn dung môi tối ưu cho quá trình chiết xuất.

Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết là bước quan trọng để xác định thể tích dung môi tối ưu Bằng cách sử dụng dung môi chiết phù hợp và thử nghiệm với các thể tích khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn được thể tích chiết hiệu quả nhất cho quá trình chiết xuất.

- Khảo sát thời gian chiết: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút, 90 phút

2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích.

Tính chọn lọc là khả năng đánh giá chính xác chất cần phân tích ngay cả khi có sự hiện diện của các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở.

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc được thể hiện qua sắc ký đồ từ mẫu chuẩn và mẫu phân tích thêm chuẩn Để đạt được độ chính xác cao, pic của chất cần phân tích phải hoàn toàn tách biệt với các pic tạp.

Tiến hành chạy sắc ký cho mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng theo chương trình đã chọn Ghi chú các thông số quan trọng như thời gian lưu và diện tích pic để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.

Thời gian lưu của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng cần phải tương đương để đảm bảo độ chính xác Đồng thời, pic AA trong mẫu thử phải được tách biệt hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu để đạt được kết quả phân tích chính xác.

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà hệ thống phân tích vẫn tạo ra tín hiệu có ý nghĩa khi so với tín hiệu mẫu trắng hoặc tín hiệu nền, mặc dù chưa thể định lượng chính xác.

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà có thể xác định bằng phương pháp khảo sát, đảm bảo kết quả đạt độ chính xác mong muốn.

LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà tại đó tín hiệu đo được có sự phụ thuộc tuyến tính với nồng độ của chất phân tích.

Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn với nồng độ thay đổi để khảo sát mối quan hệ giữa tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc này cho đến khi không còn tính tuyến tính Khoảng tuyến tính được xác định bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) đến giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Đường chuẩn là biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích, và được đánh giá qua giá trị R², với 0,99 ≤ R² ≤ 1 Tính thích hợp của hệ thống cũng cần được xem xét.

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tốnhư máy móc, thiết bị

THỰ C NGHI Ệ M K Ế T QU Ả VÀ BÀN LU Ậ N

Định tính AA và AB23 bằng TLC

 Chuẩn bị mẫu: mẫu thử và mẫu đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.3.1

Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên cần chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Sau khi thực hiện, hãy để bản mỏng khô tự nhiên ngoài không khí, sau đó phun dung dịch thuốc thử lên bề mặt Cuối cùng, sấy bản mỏng ở nhiệt độ 105°C trong vòng 5 phút để hoàn tất quá trình.

Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử

 Khảo sát hệdung môi pha động:

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:

Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)

Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)

Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)

Kết quả: Sắc ký đồ định tính AB23 trong Trạch tả được trình bày như hình 3.1

Hình 3.1 Khảo sát định tính AB23

Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366.

Quan sát dưới ánh sáng thường

Kết quả định tính TLC cho thấy chất AB23 có giá trị Rf trong khoảng 0,16 – 0,6 với ba hệ dung môi khảo sát Tuy nhiên, không phát hiện vết AB23 tương ứng trong mẫu thử, chứng tỏ các mẫu Trạch tả không chứa thành phần AB23 Do đó, chúng tôi đã chọn hệ dung môi A để định tính thành phần AB23 trong các mẫu Trạch tả thu thập từ thị trường.

 Khảo sát hệdung môi pha động:

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:

Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)

Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)

Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1)

Kết quả: Sắc ký đồ định tính AA trong Trạch tả được trình bày như hình 3.2

Hình 3.2 Khảo sát định tính AA

Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366.

Trong các hệ dung môi được khảo sát, hệ dung môi B cho giá trị Rf của AA là 0,4, với vết tách biệt rõ ràng khỏi các vết khác Do đó, chúng tôi quyết định chọn hệ dung môi pha động hexan: aceton (1,5:1) (v/v) để tiến hành sắc ký.

Sau khi tiến hành khảo sát và tham khảo tài liệu, chúng tôi đã phát triển phương pháp định tính AB23 và AA bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng với các điều kiện cụ thể như sau:

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)

- Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 1 mg chất chuẩn AB23, AA tương ứng hòa tan trong khoảng 2 ml methanol

Để chuẩn bị dung dịch thử, cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ và tiến hành chiết siêu âm với 30 ml methanol (MeOH) trong 30 phút Sau đó, lọc dung dịch qua màng cellulose acetate 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng.

 Định tính AB23: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) (v/v)

 Định tính AA: hexan: aceton (1,5:1) (v/v)

Để tiến hành thử nghiệm, hãy đưa lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch thử và 5 μl dung dịch chất đối chiếu Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra và để khô ngoài không khí ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol lên bản mỏng và sấy ở 105 oC trong vài phút Cuối cùng, quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 và ánh sáng thường để phân tích kết quả.

Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử, cần xuất hiện vết có màu sắc và giá trị Rf tương đồng với vết của dung dịch chất đối chiếu.

3.1.3 Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng

Chúng tôi đã thực hiện phân tích định tính AA và AB23 trên các mẫu Trạch tả thu thập từ thị trường, áp dụng theo phương pháp đã nêu trong mục 3.1.1 và 3.1.2., với kết quả được trình bày trong hình 3.3 và 3.4.

Hình 3.3 Sắc ký đồđịnh tính AA trên một số mẫu Trạch tả

Hình 3.4 Sắc ký đồđịnh tính AB23 trên một số mẫu Trạch tả

Quan sát dưới đèn UV 366 Quan sát dưới ánh sáng thường

- M1 – M7: Các mẫu thử dược liệu Trạch tả, lần lượt từ M1 – M7

- C: Mẫu chất đối chiếu AB23

- C’: Mẫu chất đối chiếu AA

Trên sắc ký đồ của các mẫu M1 – M7, các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AA được ghi nhận rõ ràng Ngược lại, không có vết nào xuất hiện với giá trị R và màu sắc tương ứng với vết của AB23 Từ đó, có thể đưa ra kết luận tạm thời về sự hiện diện của các hợp chất trong mẫu.

Định lượng AA bằng HPLC

3.2 Định lƣợng AA bằng HPLC

Từ kết quả thu được trong mục 3.1.3 Nhận thấy có thể lựa chọn alisol

A làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả Từ đó, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng alisol A trong dược liệu Trạch tả

Dựa trên các nghiên cứu trước đây [22,54,55] về việc định lượng AA trong Trạch tả, cột C18 thường được sử dụng Tuy nhiên, để phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện tại, chúng tôi đã chọn cột Eclipse XDB-C18 (4,6mm x 250nm, 5µm).

3.2.2 Khảo sát hệdung môi pha động

Một sốđiều kiện sắc ký cốđịnh:

- Cột Elipse XDB – C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 àm)

- Pha động: Acetonitril (ACN) và nước (H 2 O)

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl

Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thửđược chuẩn bịnhư mục 2.3.2.1

Tiến hành khảo sát pha động là hệ dung môi ACN : H2O và thay đổi tỷ lệ giữa 2 thành phần theo 3 chương trình dung môi:

- Chương trình dung môi 1: ACN : H 2 O (80:20)

- Chương trình dung môi 2: ACN : H 2 O (70:30)

- Chương trình dung môi 3: ACN : H 2 O (60:40) Kết quả thu được trong hình 3.5

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động

Với chương trình dung môi 1 và 2 ta thấy AA được rửa giải sớm (t R 5,045 và 6,508) Với chương trình dung môi 2, pic AA rửa giải muộn hơn (tR

Chúng tôi đã tách hoàn toàn pic với số lượng 9,676 khỏi các pic khác, tạo ra pic gọn và cân đối với hệ số kéo đuôi AS= 1,262 Độ phân giải của pic AA so với các pic liền kề đạt R S > 2,5, do đó, chúng tôi lựa chọn chương trình dung môi 3 cho phương pháp định lượng.

3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.2.3.1 Khảo sát dung môi chiết

Chúng tôi đã tiến hành chiết xuất trên cùng một nền mẫu phân tích theo quy trình dự kiến, sử dụng dung môi EtOH và MeOH : H2O với các tỷ lệ khác nhau Mỗi loại dung môi được phân tích lặp lại 3 lần bằng HPLC theo điều kiện đã thiết lập, từ đó tính toán kết quả trung bình Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết

Dung môi (g) Diện tích pic

Khi sử dụng hỗn hợp dung môi chiết MeOH 80% (v/v), hàm lượng AA thu được đạt mức cao nhất Vì vậy, chúng tôi đã chọn dung môi này để chiết xuất AA từ mẫu phân tích.

3.2.3.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết

Thực hiện chiết siêu âm theo quy trình đã nêu trong mục 2.3.2.1, với thể tích dung môi chiết MeOH 80% được thay đổi ở ba mức: 25ml, 50ml và 100ml Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết trong bảng 3.2.

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết

Thể tích dung môi chiết (ml) (g) Diện tích pic

Kết quả khảo sát cho thấy, chiết xuất với 25 ml MeOH 80% mang lại hàm lượng AA cao nhất Do đó, chúng tôi quyết định chọn thể tích dung môi chiết cho AA là 25 ml.

3.2.3.3 Khảo sát thời gian chiết

Trên cùng một nền mẫu, tiến hành chiết siêu âm với 25ml MeOH 80% với thời gian chiết thay đổi: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút và 90 phút

Quy trình tương tự như mục 2.3.2.1 Phân tích lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết (phút) (g) Diện tích pic

Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng AA trong mẫu tăng lên khi thời gian chiết kéo dài Tuy nhiên, sau 40 phút chiết, sự thay đổi hàm lượng AA trở nên không đáng kể.

Do đó chúng tôi lựa chọn quy trình chiết siêu âm 30 phút để chiết AA ra khỏi nền mẫu

3.2.3.4 Quy trình xử lý mẫu đƣợc lựa chọn

Dựa trên kết quả khảo sát về dung môi chiết, tỷ lệ dung môi và thời gian chiết, chúng tôi đã xác định quy trình xử lý mẫu phù hợp cho phương pháp định lượng AA trong thân rễ Trạch tả.

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn

3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 3.2.4.1 Độđặc hiệu

Trong quá trình phân tích, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 3 mẫu, bao gồm mẫu trắng, dung dịch AA chuẩn và dung dịch mẫu thử Kết quả đánh giá được thể hiện qua sắc ký đồ tương ứng, như được minh họa trong hình 3.7.

Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào ống ly tâm 50 ml

Dịch chiết Thêm chính xác 25 ml

Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độđặc hiệu của phương pháp

Trên sắc ký đồ, thời gian lưu của AA trong mẫu thử và mẫu chuẩn tương đương, cho thấy pic AA không trùng với các pic khác, chứng tỏ phương pháp và hệ thống sắc ký đạt độ đặc hiệu cao.

3.2.4.2 Tính thích hợp hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá theo phương pháp đã trình bày trong mục 2.3.2.4 Kết quả được xác định thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn AA có nồng độ 104,2 àg/ml Kết quả này được trình bày chi tiết trong bảng 3.4.

Bảng 3.4 Kết quảđánh giá tính thích hợp hệ thống

Th ời gian lưu (phút) Di ệ n tích pic (mAU.s)

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc lần lượt là 0,028% và 0,415%, đều dưới 2%, chứng tỏ rằng các điều kiện sắc ký và hệ thống HPLC được lựa chọn là phù hợp, đảm bảo tính ổn định cho phép phân tích định lượng AA.

3.2.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)

Mẫu thử được phân tích để xác định nồng độ AA, sau đó được pha loãng cho đến khi tỷ lệ S/N đạt 3 – 4 trên sắc ký đồ tại thời gian lưu của AA Từ đó, xác định được giới hạn phát hiện (LOD) Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần và kết quả trung bình được tính toán.

Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD

Tại nồng độ 0,17 àg/ml, tỷ lệ S/N = 3 – 4

Với kết quả này chúng tôi xác định:

Giới hạn phỏt hiện: LOD = 0,17 àg/ml

Giới hạn định lượng: LOQ = LOD x 3,3 = 0,51 àg/ml

3.2.4.4 Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính

Chuẩn bị dãy dung dịch AA chuẩn với nồng độ từ 4,17 àg/ml đến 416,8 àg/ml và tiến hành chạy sắc ký theo các điều kiện khảo sát tại mục 3.2.2 Kết quả về mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ AA được thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AA

Datafil e Nam e:LOD-0.1667-20ul-002.lcd Sam pl e Nam e:thu Sam pl e ID:01

Hình 3.9 Đường chuẩn của AA

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 12779x – 6729,6 (R² = 1)

Ký hiệu: x: nồng độ alisol A (àg/ml) y: diện tích pic (mAU.s)

Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R

Kết quả đánh giá đường chuẩn với R² = 1 > 0,99, như trình bày trong bảng 3.7, cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao, đảm bảo tính chính xác cho phép phân tích định lượng AA.

Ứ ng d ụng phương pháp

Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng AA trong một số mẫu

Trạch tả trên thịtrường, mỗi mẫu thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình

Hàm lượng % AA trong dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức:

C: nồng độ AA trong dung dịch mẫu thử (àg/mL). m: khối lượng mẫu dược liệu đem phân tích (g). d: độ ẩm của mẫu dược liệu (%).

Bảng 3.8 Kết quảđịnh lượng AA trên một số mẫu Trạch tả

Tên mẫu Độẩm (%) Diện tích píc

(mAU.s) Hàm lƣợng trung bình (kl/kl) %

Với 7 mẫu định lượng cho thấy, Trạch tả được trồng tại Ninh Bình có chứa hàm lượng AA cao nhất (0,374 %) Các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường có chứa hàm lượng AA dao động 0,23 – 0,38 %.

Bàn luận

Trạch tả là dược liệu quý, được sử dụng từ lâu trong Y học cổ truyền Trung Quốc và Việt Nam, có tác dụng điều trị các bệnh như khó tiểu, phù nề, tiểu đường và viêm nhiễm.

Ngày nay, nhu cầu sử dụng sản phẩm thảo dược cho chăm sóc sức khỏe ngày càng tăng, dẫn đến việc Trạch tả được sử dụng rộng rãi Dược liệu này hiện đang được trồng tại nhiều vùng ở Việt Nam, đặc biệt là Ninh Bình, nơi có dự án xây dựng chỉ dẫn địa lý cho cây Trạch tả Tuy nhiên, phần lớn Trạch tả trên thị trường chưa được kiểm soát chất lượng, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và thiệt hại kinh tế Do đó, việc kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả là vô cùng cần thiết.

DĐVN IV đã có chuyên luận về Trạch tả, nhưng vẫn chưa được phát triển chi tiết và chưa thiết lập phương pháp định tính và định lượng cho các hoạt chất chính Tham khảo từ Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung Quốc có thể cung cấp thông tin bổ ích cho việc hoàn thiện chuyên luận này.

Nhiều quốc gia đã sử dụng AB23 làm "marker" trong kiểm nghiệm dược liệu Trạch tả Tuy nhiên, khảo sát cho thấy dược liệu Trạch tả trồng tại Việt Nam hầu như không chứa hoặc chỉ có rất ít hoạt chất này Ngược lại, hoạt chất AA có mặt trong tất cả các mẫu, do đó có thể được sử dụng làm "marker" để kiểm soát chất lượng dược liệu Trạch tả.

3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính

Phương pháp HPLC có thể được sử dụng để định tính và định lượng AA và AB23 trong thân rễ Trạch tả, nhưng trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn phương pháp TLC Lý do là vì TLC có ưu điểm vượt trội hơn HPLC, bao gồm thời gian chuẩn bị mẫu và thời gian phân tích ngắn hơn, cùng với trang thiết bị đơn giản hơn Điều này cho phép chúng tôi thực hiện định tính nhanh chóng các mẫu dược liệu trên thị trường.

Phương pháp định tính mà chúng tôi phát triển sử dụng hệ dung môi đơn giản và thuốc thử nhạy màu, phổ biến trong các phòng phân tích kiểm nghiệm tại Việt Nam Quy trình xử lý mẫu được thực hiện dễ dàng và tiết kiệm thời gian Kết quả sắc ký đồ thu được cho thấy vết rõ ràng.

Dựa trên các điều kiện phân tích dự kiến, phương pháp đã được xây dựng đáp ứng đầy đủ các yêu cầu cần thiết cho một phương pháp định tính.

3.4.3 Quy trình xử lý mẫu định lƣợng

Xử lý mẫu là bước quan trọng trong phân tích định lượng, giúp loại bỏ tạp chất và tách chất từ dược liệu Sau khi tham khảo tài liệu và khảo sát các điều kiện, chúng tôi đã lựa chọn quy trình xử lý mẫu tối ưu, mang lại hiệu suất cao và phù hợp với điều kiện hiện tại.

Phương pháp chiết siêu âm là một kỹ thuật phổ biến trong việc chiết xuất hoạt chất từ dược liệu nhờ vào tính đơn giản và hiệu suất chiết cao.

Nghiên cứu chiết hiện tại đã sử dụng các dung môi như methanol, ethanol, hỗn hợp MeOH:H2O và ACN:H2O Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu ứng dụng rộng rãi và phù hợp với quy mô của nhiều phòng kiểm nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng chiết siêu âm một lần là phương pháp hiệu quả.

25 ml MeOH 80% trong 30 phút là hợp lý về kinh tế, an toàn với môi trường và giảm được lượng dung môi sử dụng

Phương pháp HPLC mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng điều chỉnh điều kiện phân tích linh hoạt, độ chọn lọc và độ nhạy cao, cùng với kết quả chính xác và quy trình thực hiện đơn giản.

AA là hợp chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại, cho phép sử dụng detector UV-VIS để phân tích Với các điều kiện sắc ký đã được thiết lập, pha động chỉ cần acetonitril và nước, cùng với chương trình rửa giải đẳng dòng đơn giản, phương pháp này có thể dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam.

Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm tính chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp Tất cả các tiêu chí thẩm định đều đạt yêu cầu.

V NU cầu của AOAC, khoảng tuyến tính rộng cho phép định lượng AA trong các đối tượng đa dạng

3.4.5 Kết quả phân tích mẫu thân rễ Trạch tả

Theo nghiên cứu ban đầu, các mẫu dược liệu Trạch tả đều chứa AA với hàm lượng từ 0,23% đến 0,38%, nhưng không phát hiện AB23 trong cả 7 mẫu phân tích Đặc biệt, mẫu Trạch tả được trồng và thu hái tại Ninh Bình có hàm lượng AA cao nhất.

Nguyên nhân không phát hiện được AB23 trong các mẫu thân rễ Trạch tả có thể do quy trình xử lý sơ bộ kém hoặc các yếu tố như giống cây, vùng trồng, thời gian thu hái và quá trình sơ chế, bảo quản dược liệu Để có đánh giá khách quan hơn, cần thực hiện các phương pháp định tính và định lượng.