TỔ NG QUAN
Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, có hình đĩa và không có nhân, với đường kính trung bình từ 2 đến 5 µm và độ dày khoảng 0,5 µm Ở người khỏe mạnh, số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi dao động từ 150 đến 400 x 10^9/L Trong quá trình tạo máu, tiểu cầu được hình thành từ mẫu tiểu cầu trong tủy xương, mỗi mẫu có khả năng tạo ra khoảng 3000 tiểu cầu Thời gian sống của tiểu cầu tương đối ngắn, chỉ khoảng 10 ngày, và chúng sẽ bị tiêu hủy bởi đại thực bào tại gan và lách.
Cấu trúc tiểu cầu được chia thành 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng
Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo [51]
Khu ngoại vi của tế bào bao gồm lớp glycocalyx, màng bào tương và vùng dưới màng Glycocalyx được tạo thành từ nhiều loại glycoprotein (GP), hoạt động như các thụ thể bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu.
Bảng 1.1 Đặc điểm của một số GP chính [51]
Glycoprotein Cấu trúc Chất liên kết
GPIIb/IIIa Integrin αIIbβ3 Fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin và thrombospondin GPIa/IIa Integrin α2β1 Collagen
GPIb/IX/V Thụ thể nhiều đoạn acid amin giàu leucine lặp lại vWF
GPVI Thụ thể thuộc siêu họ globulin miễn dịch
Màng bào tương là một cấu trúc lipid kép chủ yếu bao gồm các phospholipid như phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), và phosphatidylserine (PS), cùng với sphingolipid, sphingomyelin và cholesterol Sự phân bố của các phospholipid này không đồng đều, trong đó PC tạo thành lớp ngoài, trong khi PE và PS cấu trúc lớp trong của màng Quá trình phân bố này được điều chỉnh bởi các enzyme phụ thuộc ATP, bao gồm flipase và flopase.
Vùng dưới màng, nằm ngay dưới màng bào tương, là nơi các thụ thể xuyên màng tương tác với protein truyền tin trong tiểu cầu Cấu trúc đặc biệt gọi là hệ khung màng spectrin gắn vào màng bào tương, giúp duy trì hình dạng bình thường của tiểu cầu Hệ thống này bao gồm chuỗi polymer xoắn được tạo ra từ các tiểu đơn vị α và β của spectrin, với các vị trí gắn kết protein liên kết hệ thống màng spectrin với vi sợi, tạo thành một mạng lưới liên tục.
Khu sol-gel chủ yếu bao gồm hệ thống vi ống và vi sợi, cùng với hệ thống màng spectrin, tạo thành khung nâng đỡ cho tiểu cầu Hệ thống vi ống nằm ngay dưới màng spectrin, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của tiểu cầu.
Hệ thống vi ống bao quanh chu vi tiểu cầu, gồm từ 3 đến 24 ống, nằm trên mặt phẳng xích đạo của tiểu cầu Mỗi vi ống được cấu tạo từ các chuỗi polymer của heterodimer tubulin, tạo thành những ống rỗng và cứng với đường kính khoảng 25 nm Chức năng chính của vi ống là duy trì kích thước và hình dạng bình thường của tiểu cầu, đồng thời tham gia vào quá trình co rút khi tiểu cầu bị kích thích.
Các vi sợi là chuỗi polymer được tạo thành từ monomer actin (G-actin), với hai đầu có ái lực khác nhau với ATP Đầu có ái lực cao gắn với protein CapZ và adducin, trong khi đầu có ái lực thấp liên kết với phức hợp Arp2/3 CapZ ức chế sự trùng ngưng, trong khi Arp2/3 hỗ trợ kéo dài và bảo vệ sợi actin khỏi sự khử trùng ngưng Hệ thống vi sợi chủ yếu được hình thành từ filamin và α-actinin, với filamin tương tác với GPIb và β-integrin, còn α-actinin giữ các vi sợi gần nhau Hệ thống này trong tế bào chất giữ các bào quan cách xa nhau và tham gia vào việc tạo chân giả cho tiểu cầu Khi bị kích thích, vi sợi co lại, đẩy các hạt α và hạt đặc vào trung tâm tiểu cầu, nơi chúng giải phóng chất ra ngoài qua các kênh mở Khu sol-gel cũng chứa glycogen và một số túi trơn hoặc được bọc clathrin.
Khu bào quan chứa các hạt đặc hiệu và thành phần tế bào như lysosome, ty thể, và bộ máy Golgi, thực hiện các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu Các bào quan này không chỉ dự trữ enzyme mà còn cung cấp một lượng lớn cơ chất cần thiết cho hoạt động của tiểu cầu.
The specific granule system is categorized into three groups: alpha granules, dense granules, and lysosomal granules Among these, lysosomal granules are the least abundant in platelets, with fewer than three granules per platelet The contents of lysosomal granules include protein-degrading enzymes such as cathepsins, elastase, collagenase, and carboxypeptidase, as well as carbohydrate-degrading enzymes like glucosidase, galactosidase, and mannosidase, and ester bond-cleaving enzymes, including acid phosphatase.
Mỗi tiểu cầu có thể chứa 3 đến 8 hạt đặc với kích thước khoảng 150 nm
Hạt đặc chứa một lượng lớn các nucleotide (ADP, ATP, UTP, GTP); cation (Ca ++ ,
Mg ++ , K + ); các amin (serotonin, histamine) và pyrophosphate Các chất này tham gia vào quá trình cầm máu và quá trình đáp ứng viêm
Hạt α là loại hạt có số lượng nhiều nhất trong các loại hạt, với từ 50 đến 80 hạt/tiểu cầu và kích thước lớn nhất từ 200 đến 500 nm Hạt α cũng nổi bật với sự đa dạng về thành phần, được trình bày chi tiết trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2 Thành phần của hạt α [20]
Protein kết hợp màng αIIbβ3, GPIb/IX/V, GPVI, P-selectin
Chất tham gia quá trình đông máu
Yếu tố V, IX, XIII, antithrombin, protein
S, plasminogen, α2-macroglobulin Protein dính Fibrinogen, vWF, thrombospondin
Hóa chất CXCL1, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CCL2
Yếu tốtăng trưởng Yếu tốtăng trưởng biểu bì, yếu tốtăng trưởng tế bào gan
Chất ức chế Angiostatin, endostatin
Chất điều hòa miễn dịch Complement C4 precursor, IgG
Protein vi sinh Thymosin-β4, thrombocidins1 và 2
Khu màng chứa hệ thống ống dày đặc và kênh mở, trong đó hệ thống ống dày đặc là khối vật chất không định hình, chứa Ca++ và tổng hợp prostaglandin với nhiều enzyme cyclooxygenase tham gia vào quá trình chuyển hóa prostaglandin Các kênh mở giúp tăng diện tích bề mặt tiểu cầu và cho phép các hạt tiểu cầu giải phóng chất cũng như hấp thu các chất ngoại bào, như fibrinogen vào hạt α.
1.1.2 Chức năng tiểu cầu Ở điều kiện sinh lý bình thường, tiểu cầu lưu hành trong máu ở trạng thái nghỉ Khi xuất hiện tổn thương ở thành mạch, tiểu cầu lập tức bị thu hút và trải qua một loạt các sự kiện diễn biến liên tục Nhìn chung, quá trình này gồm các bước quan trọng là bám dính, hoạt hóa, chế tiết và ngưng tập
1.1.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu
Giai đoạn bám dính ban đầu
Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị phá vỡ, dẫn đến việc một số protein dưới nội mô như yếu tố von Willebrand (vWF), collagen, fibronectin, laminin và thrombospodin-1 được bộc lộ và tương tác với tiểu cầu Trong số này, collagen và vWF đóng vai trò quan trọng nhất, với vWF bám vào collagen, tạo ra nhiều vị trí liên kết với phức hợp glycoprotein (GP) Ib/IX/V trên màng tiểu cầu Dưới tác động của dòng máu cao, sự bám dính của tiểu cầu chủ yếu phụ thuộc vào liên kết giữa GPIb và vWF, mặc dù liên kết này tồn tại không lâu nhưng rất quan trọng, giúp tiểu cầu “lăn” gần về bề mặt bám dính Điều này tạo điều kiện để collagen liên kết với GPVI, từ đó kích hoạt GPIa/IIa gắn với collagen.
Hình 1.2 Giai đoạn bám dính [40]
Sự tương tác giữa vWF – GPIb, collagen – GPVI, và collagen – GPIa/IIa kích thích các tín hiệu phức tạp trong tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa phospholipase Cγ (PLCγ) và sản xuất inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) thông qua sự thủy phân phospholipid IP3 sau đó gắn vào thụ thể trên hệ thống ống dày đặc, giúp huy động Ca++ từ kho dự trữ Sự gia tăng nồng độ Ca++ nội bào kích hoạt nhiều biến đổi quan trọng trong tiểu cầu, bao gồm thay đổi hình dạng từ hình đĩa sang hình cầu gai, hoạt hóa GPIIb/IIIa, giải phóng chất từ các hạt, và tổng hợp TXA2, tất cả đều có vai trò quan trọng trong quá trình ngưng tập tiểu cầu.
GPIIb/IIIa được hoạt hóa, liên kết với vùng C1 của vWF đảm bảo tiểu cầu bám dính chặt vào vị trí tổn thương của thành mạch [40]
Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu
Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu [40]
Ngưng tập tiểu cầu (NTTC) là quá trình mà các tiểu cầu liên kết với nhau để hình thành nút tiểu cầu, đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn tiếp theo của quá trình cầm máu ban đầu.
Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP
ADP là một phân tử trọng lượng thấp và là chất gây NTTC đầu tiên được phát hiện Mặc dù là một chất chủ vận yếu, ADP lại có vai trò quan trọng trong chức năng tiểu cầu, vì khi được tiết ra từ hạt đặc, nó có khả năng khuếch đại đáp ứng của tiểu cầu đối với các chất chủ vận khác Trong huyết tương giàu tiểu cầu đã được chống đông bằng citrate, ADP gây NTTC thông qua việc tương tác với các thụ thể purinergic.
Khái niệm về thụ thể purinergic lần đầu được mô tả bởi Burnstock vào năm
Năm 1972, các thụ thể purinergic trên màng tế bào được phân loại dựa trên ái lực của các chất chủ vận Tuy nhiên, hệ thống phân loại đã được điều chỉnh dựa trên thông tin dược lý và hóa sinh Các thụ thể này được chia thành hai nhóm lớn: P1, thụ thể hoạt hóa bởi adenosine, và P2, thụ thể hoạt hóa bởi nucleotide purine và pyrimidine như ATP, ADP, UTP và UDP.
Nhóm P1 bao gồm các thụ thể bắt cặp protein G, với bốn loại thụ thể A1, A2A, A2B và A3 Thụ thể A1 và A3 tương tác với protein Gi/o, dẫn đến ức chế adenylyl cyclase (AC), trong khi thụ thể A2A và A2B kết hợp với protein Gs để kích hoạt AC, làm tăng tổng hợp cAMP Đặc biệt, thụ thể A2B cũng có khả năng bắt cặp với protein Gq, chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt phospholipase C và huy động ion Ca++.
Nhóm thụ thể P2 được chia thành hai phân nhóm chính: P2X, các kênh ion hoạt hóa bởi phối tử, và P2Y, các thụ thể bắt cặp với protein G Các thụ thể P2Y chủ yếu hoạt động thông qua cơ chế kích hoạt phospholipase C (PLC) và/hoặc điều chỉnh hoạt động của adenylate cyclase (AC) Trong khi đó, thụ thể P2X là các kênh ion điều chỉnh sự vận chuyển Na+, K+ và Ca++, dẫn đến sự khử cực tế bào và kích hoạt các enzyme nội bào.
Trên màng tiểu cầu có bốn thụ thể purinergic: P2X1, P2Y1, P2Y12 và A2A Trong đó, P2X1 được kích hoạt bởi ATP, còn P2Y1 và P2Y12 là thụ thể của ADP P2Y1, thụ thể đầu tiên được phát hiện, có khoảng 150 thụ thể trên mỗi tiểu cầu và bắt cặp với protein Gq, dẫn đến tăng nồng độ Ca++ nội bào khi được kích hoạt bởi ADP Điều này giúp điều chỉnh quá trình thay đổi hình dạng và khởi động ngưng tập tiểu cầu P2Y12 đóng vai trò trung tâm trong ngưng tập tiểu cầu do ADP và là mục tiêu của nhiều thuốc kháng tiểu cầu, bắt cặp với protein Gi để khuếch đại và ổn định ngưng tập thông qua ức chế AC và giải phóng chất từ hạt Sự phối hợp giữa P2Y1 và P2Y12 là cần thiết cho quá trình ngưng tập tiểu cầu do ADP diễn ra hiệu quả.
Chất ức chế thụ thể purinergic
Trong nghiên cứu về thụ thể purinergic, nhiều chất ức chế và đối vận đã được phát hiện và tổng hợp, đặc biệt là nhóm thụ thể adenosine P1, mà caffeine ức chế không chọn lọc Các dẫn xuất của xanthine đã được tối ưu để ức chế đặc hiệu các thụ thể P1 Đối với nhóm thụ thể P2X, hầu hết các chất đối vận gắn vào vị trí dị lập thể, không cạnh tranh với ATP, và đang được đánh giá lâm sàng Các chất ức chế thụ thể P2Y có cấu trúc đa dạng, với một số cạnh tranh vị trí gắn của chất chủ vận, trong khi một số khác gắn vào vị trí dị lập thể Đặc biệt, thụ thể P2Y12 là mục tiêu của nhiều loại thuốc kháng tiểu cầu.
Một trong những chất ức chế nhóm thụ thể P2Y được sử dụng nhiều trong nghiên cứu là pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid (PPADS)
PPADS, ban đầu được biết đến như một chất ức chế chọn lọc thụ thể P2X1, đã được chứng minh có tác dụng không đặc hiệu đối với nhóm thụ thể P2 Nồng độ ức chế tối đa 50% (IC50) của PPADS đối với thụ thể P2Y12 đạt 100 µM, trong khi ái lực của nó với thụ thể P2Y1 được xác định là KB = 4 – 12 µM.
1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP
Born là người đầu tiên chỉra ADP gây ngưng tập tiểu cầu in vitro vào năm
Quá trình ngưng tập tiểu cầu do ADP gây ra diễn ra qua hai pha: pha ngưng tập nguyên phát có thể hồi phục và pha ngưng tập thứ phát không hồi phục, liên quan đến việc giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu.
1.2.2.1 Pha ngưng tập nguyên phát
P2Y1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình ngưng tập tiểu cầu bằng cách tăng nồng độ Ca++ nội bào, dẫn đến sự thay đổi hình dạng của tiểu cầu Sự thay đổi này có thể giúp giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các tiểu cầu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ngưng tập diễn ra hiệu quả hơn.
Quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu diễn ra qua hai bước chính Đầu tiên, tiểu cầu chuyển từ hình đĩa sang hình cầu nhờ sự phân mảnh của các sợi actin, dẫn đến sự phá hủy hệ khung màng spectrin Tiếp theo, màng tiểu cầu lồi lên và tạo ra các chân giả cùng phần mở rộng (lamellipodia) nhờ vào sự tổng hợp các sợi actin mới Mỗi giai đoạn trong quá trình này đều có sự tham gia của nhiều protein gắn với actin.
Hình 1.4 Hiện tượng thay đổi hình dạng [47]
ADP gắn vào thụ thể P2Y1, kích hoạt phospholipase Cβ (PLCβ), dẫn đến tổng hợp phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) và inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) IP3 sau đó gắn vào thụ thể của nó trên hệ thống ống dày đặc, huy động Ca++ từ đây Sự gia tăng nồng độ Ca++ nội bào kích hoạt gelsolin, cho phép protein này cắt và gắn vào đầu các sợi actin vừa cắt Đồng thời, cofilin cũng được kích hoạt để giải phóng các G-actin đơn lẻ khỏi chuỗi polymer.
Những G-actin gắn kết với β-thymosin hoặc profilin, trong khi sự xuất hiện của PIP2 làm cắt đứt liên kết giữa hệ khung màng spectrin và màng bào tương Hệ thống vi ống bị mất cân bằng, dẫn đến việc các vi ống xoắn lại và chuyển động rộng, khiến tiểu cầu phồng lên thành hình cầu Khi nồng độ Ca++ giảm, các quá trình tiếp theo sẽ diễn ra.
Protein gelsolin, CapZ và cofilin kết hợp với PIP2, cùng với sự hoạt động của Arp2/3 và Formin, đã thúc đẩy quá trình trùng ngưng kéo dài các sợi actin Sự tổng hợp này tạo ra lực đẩy cần thiết để hình thành chân giả và phần mở rộng của tiểu cầu Trong quá trình này, các vi ống co lại vào trung tâm tiểu cầu, bị phân mảng và phân bố rải rác Cuối cùng, các protein gắn trở lại đầu các sợi actin, hình thành hình dạng cuối cùng của tiểu cầu sau khi được kích hoạt, đó là hình cầu gai với những chân giả dài vài micromet.
Trong quá trình thay đổi hình dạng, nồng độ Ca++ cao kích hoạt phospholipase A2, khởi đầu chuỗi phản ứng tạo ra thromboxane A2 (TXA2), một chất kích thích giúp khuếch đại sự tập hợp tiểu cầu do ADP Sự phối hợp giữa các thụ thể P2Y1 và P2Y12 là cần thiết để giải phóng TXA2.
Canxi (Ca++) kích hoạt yếu tố trao đổi guanine CalDAG-GEFI, giúp chuyển đổi Rap1-GDP thành Rap1-GTP Ngược lại, quá trình này bị ức chế bởi RASA3 do phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) được kích hoạt thông qua tương tác giữa P2Y12 và ADP Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của sự phối hợp giữa thụ thể P2Y1 và P2Y12 trong việc ổn định sự ngưng tập của tiểu cầu.
Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa [9]
Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu
Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu [37]
Thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu là những thuốc ức chế hoạt hóa tiểu cầu
Tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát và ngăn ngừa các bệnh mạch vành cũng như bệnh mạch máu não liên quan đến huyết khối Hoạt động của tiểu cầu được điều chỉnh bởi ba nhóm chất: nhóm đầu tiên gồm các chất tổng hợp bên ngoài tiểu cầu như collagen và thrombin, nhóm thứ hai bao gồm các chất tổng hợp bên trong tiểu cầu như ADP, serotonin, và prostaglandin D2, và nhóm thứ ba là các chất hoạt động bên trong tiểu cầu như cAMP và cGMP.
Dựa vào cách phân loại trên, các đích tác dụng của thuốc kháng tiểu cầu được xác định và làm cơ sở để phát triển thuốc mới [26]
1.3.1 Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1)
Aspirin, được tổng hợp vào cuối thế kỷ 19, ban đầu được sử dụng để giảm đau, hạ sốt và chống viêm Đến những năm 1970, tác dụng kháng ngưng tập tiểu cầu (NTTC) của aspirin được phát hiện và cơ chế của nó được làm rõ Hiện nay, aspirin vẫn là thuốc hàng đầu trong điều trị hội chứng mạch vành cấp, giúp giảm 23% nguy cơ tử vong sau 5 tuần sử dụng.
Aspirin ức chế không hồi phục enzyme COX-1 thông qua quá trình acetyl hóa, từ đó ngăn cản sự tổng hợp TXA2, một chất gây ngưng tập tiểu cầu mạnh mẽ Sự ức chế này kéo dài suốt đời sống của tiểu cầu và liều lượng từ 75 – 100 mg/ngày đủ để ngăn chặn hoàn toàn việc tổng hợp TXA2 Ngoài ra, aspirin cũng ức chế tổng hợp prostaglandin I2 (PGI2), một chất có tác dụng chống đông, nhưng mức độ ức chế này yếu hơn và không kéo dài như đối với COX-1.
Các thuốc chống viêm không steroid (NSAID) như Mobic và Apo-piroxicam có khả năng chống viêm tương tự như aspirin, nhưng tác dụng của chúng không kéo dài do không acetyl hóa được COX-1.
1.3.2 Nhóm ức chế thụ thể P2Y 12
Nhóm thuốc Thienopyridin, bao gồm ticlodipin, clopidogrel và prasugrel, là các tiền thuốc (prodrug) được sử dụng qua đường uống Sau khi được hấp thu, các thuốc này sẽ chuyển hóa thành các chất có hoạt tính và ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của ADP.
Nhóm dẫn chất nucleotide bao gồm ticagrelor và cangrelor, trong đó ticagrelor là thuốc uống, gắn vào vị trí dị lập thể của P2Y12, ức chế chọn lọc có hồi phục P2Y12 mà không cạnh tranh với ADP Sản phẩm chuyển hóa của ticagrelor cũng có hoạt tính tương đương Ngược lại, cangrelor là thuốc tiêm tĩnh mạch với thời gian bán hủy ngắn (3 – 6 phút) và thời gian bắt đầu tác dụng nhanh (2 phút), duy trì tác dụng trong 1 – 2 giờ Nhờ vào những đặc tính này, cangrelor thường được sử dụng trong các tình huống khẩn cấp, cho bệnh nhân chờ phẫu thuật hoặc không thể dùng thuốc đường uống.
1.3.3 Nhóm ức chế thụ thể của thrombin
Thrombin là một serine protease, đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt tiểu cầu thông qua hai thụ thể bắt cặp protein G, PAR1 và PAR4, với PAR1 có ái lực mạnh nhất đối với thrombin Hiện tại, vorapaxar là thuốc duy nhất trong nhóm này đang được sử dụng, có tác dụng ức chế chọn lọc và hồi phục PAR1, từ đó làm giảm sự kích hoạt tiểu cầu do thrombin gây ra.
19 thrombin nhưng không ảnh hưởng đến cầm máu ban đầu Do lo ngại vềđộ an toàn, việc sử dụng vorapaxar trên lâm sàng còn hạn chế [21, 32]
1.3.4 Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa
Nhóm thuốc ức chế phức hợp GPIIb/IIIa là những phân tử giả lập phối tử của GPIIb/IIIa, giúp ngăn chặn sự gắn kết của fibrinogen với tiểu cầu hoạt hóa, từ đó ức chế quá trình ngưng tập tiểu cầu Các thuốc này được chỉ định trong điều trị hội chứng mạch vành cấp tính, bao gồm abciximab (một kháng thể đơn dòng), eptifibatid (heptapeptid vòng từ nọc độc rắn chuông với chuỗi Arg-Gly-Asp tương tự fibrinogen), và tirofiban (phân tử nhỏ cũng chứa chuỗi Arg-Gly-Asp) Do thời gian tác dụng ngắn, các thuốc này cần được tiêm truyền liên tục.
Dipyridamol là một thuốc ức chế phosphodiesterase, giúp tăng nồng độ cAMP, từ đó ức chế tổng hợp TXA2 và tăng nồng độ adenosine một cách gián tiếp Thuốc này cũng có tác dụng giãn mạch vành Tuy nhiên, dipyridamol thường không có hiệu quả khi sử dụng đơn độc, vì vậy nó thường được kết hợp với aspirin hoặc warfarin để đạt được hiệu quả điều trị tốt hơn.
Cilostazol là một thuốc ức chế phosphodiesterase mới, có tác dụng giãn mạch và ức chế NTTC Cilostazol được sử dụng để điều trị đau cách hồi ở chân
T ổ ng quan v ề cây Dong ri ềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr
1.4.1 Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng
Họ Dong riềng, còn được gọi là Ngải hoa, thuộc họ thực vật một lá mầm Cannaceae Trong họ này, chi Canna là chi duy nhất, bao gồm khoảng 10 đến 20 loài trên toàn cầu.
Hiện nay, ở Việt Nam, các nhà khoa học đã phát hiện 6 loài thực vật thuộc họ
Cannaceae includes several species such as Canna edulis Ker., C generalis Bail., C glauca L., C indica L., C sylvestris Rosc, and the recently identified C warszewiczii A Dietr Notably, C warszewiczii is a shade-tolerant plant that typically grows in understory environments.
Cây tán cây là loài cây ưa ẩm, cao khoảng 1.5 mét với lá nhỏ, thô và gân chính to, gân phụ song song Hoa của cây nở thành cụm ở ngọn, có màu đỏ thẫm nổi bật Thân cây mảnh nhưng chắc chắn, mang màu tím đỏ đặc trưng, trong khi thân rễ phát triển thành củ lớn Cây phát triển mạnh mẽ và luôn xanh tốt quanh năm.
C warszewiczii phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Trên thế giới, loài này có thể được tìm thấy ở Trung Quốc (Quảng Châu) và Nam Mỹ Ở
C warszewiczii, một loài cây phân bố tự nhiên ở các vùng miền núi như Mộc Châu (Sơn La), Võ Nhai (Thái Nguyên) và Bắc Sơn (Lạng Sơn), đã được sử dụng trong y học cổ truyền Việt Nam để điều trị các bệnh tim mạch như bệnh động mạch vành và thiếu máu cơ tim Người Dao ở bản Piềng Sàng (Sơn La) còn trồng cây này để chữa đau dạ dày, đau nhức xương và tức ngực Mặc dù thiếu bằng chứng khoa học, một số thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch như Cardocorz của Công ty Dược phẩm NanoFrance và An Tim Tuệ Linh của Công ty Dược phẩm Tuệ Linh đã được đưa ra thị trường.
1.4.2 Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A Dietr
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự năm 2018 đã chỉ ra rằng phân đoạn dịch chiết ethyl acetate (EA) từ thân rễ và phần trên mặt đất của C warszewiczii có khả năng kéo dài thời gian đông máu, thể hiện qua hai chỉ số PT và APTT, với mức tăng từ 1,5 đến 2,5 lần so với giá trị bình thường.
Nghiên cứu về tác dụng chống đông máu của C warszewiczii cho thấy dịch chiết EA từ cả hai phần của cây có hiệu quả ở nồng độ 8 mg/mL Ở nồng độ 16 mg/mL, dịch chiết từ phần trên mặt đất cho thấy chỉ số PT và APTT tăng cao, chỉ ra nguy cơ chảy máu cao Kết quả này khẳng định rằng C warszewiczii có tác dụng chống đông máu, ảnh hưởng đến cả hai con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh.
Nghiên cứu của Đỗ Nhật Hạ năm 2018 cho thấy một loạt phân đoạn dịch chiết của C warszewiczii bao gồm EA, dichloromethane (DCM), n-hexan (nH)
Phần thân và phần trên mặt đất của cây cho thấy tiềm năng chống ngưng tập tiểu cầu (NTTC) khi được thử nghiệm với ba chất kích thích khác nhau: ADP, collagen và ristocetin Dữ liệu cho thấy rằng phân đoạn dịch chiết EA của phần trên mặt đất và phân đoạn DCM của phần thân rễ ở nồng độ 1,5 mg/mL có hiệu quả mạnh nhất trong việc ức chế NTTC do ADP và collagen gây ra Đồng thời, phân đoạn nH của phần thân rễ cũng thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ đối với sự ngưng tập do ristocetin.
Năm 2020, nghiên cứu của Lê Hồng Luyến và cộng sự đã chỉ ra rằng các phân đoạn dịch chiết từ thân rễ và phần trên mặt đất của C warszewiczii A Dietr có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu và chống oxy hóa theo nồng độ mẫu thử Ngoài ra, nhiều hợp chất sinh học như flavonoid, polyphenol, glycosid, glycosid tim, coumarin, steroid, emodol, tannin và cholesterol cũng đã được phát hiện trong các phân đoạn này.
Từ các nghiên cứu tiền đề trên về tác dụng chống NTTC của C warszewiczii
A Dietr, chúng tôi thực hiện đề tài này với mong muốn tìm hiểu sâu hơn về cơ chế NTTC của các phân đoạn dịch chiết này thông qua thụ thể của chất kích tập tiểu cầu ADP
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượng nghiên cứu
Cây Dong riềng đỏ, có tên khoa học là C warszewiczii (A Dietr) Nb Tanaka, được thu hái tại huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 12/2019 Việc giám định này được thực hiện bởi các chuyên gia thực vật học của Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
Hình 2.1 Mẫu cây Dong riềng đỏ C warszewiczii A Dietr
(Hình trên trái: phần trên mặt đất, hình bên phải: phần thân rễ)
Sau khi thu hái, cây được rửa sạch và tách riêng phần thân rễ với phần trên mặt đất Cả hai phần này được thái nhỏ, phơi khô trong nhà kính cho đến khi độ ẩm dưới 10%, sau đó xay nhỏ và bảo quản trong túi nilon Tiến hành ngâm hai phần dược liệu đã xay với ethanol 96% theo tỉ lệ 1/5 và lọc qua giấy lọc, lặp lại quy trình này ba lần Dung dịch sau khi lọc được cô quay dưới áp suất giảm cho đến khi thu được cắn, sau đó hòa tan cắn bằng nước nóng Các thành phần có độ phân cực khác nhau được tách ra bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng lần lượt với n-hexan, dichloromethane và ethyl acetate Cuối cùng, dung môi được thu hồi bằng cô quay dưới áp suất giảm, thu được cắn các phân đoạn dịch chiết.
Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết các phân đoạn dịch chiết C warszewiczii A Dietr 2.1.2 Thu thập mẫu máu
Tiêu chuẩn lựa chọn cho người tình nguyện bao gồm: sức khỏe tốt, độ tuổi từ 20 đến 25, không hút thuốc lá, không có tiền sử bệnh lý liên quan đến máu, và hiện tại không sử dụng các loại thuốc ảnh hưởng đến quá trình đông máu hoặc tiêu fibrin.
Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm các trường hợp như có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, và người mới cho máu với lượng lớn hơn.
450 mL trong vòng 20 ngày trước
2.1.3 Dụng cụ nghiên cứu Ống chống đông citrate, xy lanh 20 mL, kim lấy máu 20 gauge, đầu côn, micropipette, ống eppendorf, ống falcon, găng tay, bút viết kính, sổ ghi chép, cuvet thủy tinh, bi khuấy, máy siêu âm, máy ly tâm, máy đo ngưng tập tiểu cầu Chrono- Log-490 của Mỹ, hóa chất dimethyl sulfoxide (DMSO) của Sigma-Aldrich (Mỹ),
Phần trên mặt đất (CW.A)
ADP của hãng Chrono-Log (Mỹ), PPADS tetrasodium của Tocris Bioscience (Anh), ethanol 96%, ethyl acetate (EA), dichloromethane (DCM), n-hexan (nH) dung dịch NaCl 0,9%.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất
Dịch chiết phân đoạn ethyl acetate (EA) và dichloromethane (DCM) từ phần trên mặt đất (Aerial – A) được hòa tan trong dung môi DMSO 5%, tạo ra hai phân đoạn với nồng độ 40 mg/mL và 120 mg/mL, được ký hiệu lần lượt là CW.A.EA 40 mg/mL và CW.A.DCM 120 mg/mL.
PPADS tetrasodium được hòa tan trong nước muối sinh lý NaCl 0,9% để thu được dung dịch nồng độ 10 mmol/L, ký hiệu là PPADS 10 mM
2.2.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Tất cả các nghiên cứu bắt đầu vào buổi sáng với tình nguyện viên nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu Máu tĩnh mạch được lấy bằng kim 20 gauge, với 20 mL máu tĩnh mạch toàn phần được chống đông bằng natri citrate 3,2% theo tỷ lệ 9:1 Sau khi lắc đều để đảm bảo chống đông hoàn toàn, mẫu máu được ly tâm ở tốc độ 500 vòng/phút trong 10 phút Phần huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) màu vàng đục được hút ra và cho vào ống thủy tinh ký hiệu PRP Phần còn lại được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó hút phần huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) vàng trong nổi ở trên và cho vào ống thủy tinh ký hiệu PPP Mẫu huyết tương cần được bảo quản ở nhiệt độ phòng và chỉ sử dụng trong vòng 4 giờ kể từ khi thu được.
2.2.3 Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu
Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry – LTA) với chất kích thích ADP trên máy Chrono-Log-490, được phát triển độc lập bởi Born và O’Brien từ năm 1962, đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong việc đánh giá chức năng của tiểu cầu Mặc dù LTA mang lại nhiều lợi ích trong việc phân tích chức năng tiểu cầu, nhưng phương pháp này cũng gặp phải nhược điểm là tốn thời gian trong quá trình thực hiện.
Phương pháp LTA dựa trên nguyên lý rằng mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) tỷ lệ với nồng độ tiểu cầu trong huyết tương Thiết bị cần thiết cho phương pháp này là quang phổ kế, cùng với cuvet chứa PRP và cuvet chứa huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) Mỗi cuvet được đặt trong giếng riêng và nhiệt độ được duy trì ở 37°C Một chùm tia sáng với bước sóng xác định sẽ chiếu qua cuvet tới tế bào quang điện, và tín hiệu thu được sẽ được chuyển thành đồ thị trên máy tính Độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet PRP trước khi thêm chất gây ngưng tập là 0%, trong khi qua cuvet PPP là 100%, và đường nền được hiệu chỉnh về 0% Quá trình ngưng tập tiểu cầu do ADP gây ra được minh họa trong Hình 2.3.
Hình 2.3 Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP 5 M
Khi thêm chất kích thích ADP với nồng độ 5 μM, tiểu cầu bắt đầu thay đổi hình dạng từ hình đĩa sang hình cầu Sự thay đổi này làm giảm lượng ánh sáng truyền qua, tạo ra một đồ thị đi lên nhẹ Sau đó, tiểu cầu co lại thành hình cầu nhỏ hơn.
Khi các thụ thể GPIIb/IIIa được kích hoạt và xuất hiện trên bề mặt, quá trình ngưng tập nguyên phát bắt đầu diễn ra Sự gia tăng ánh sáng truyền qua cho thấy đồ thị giảm xuống và sau đó uốn cong nhẹ, báo hiệu rằng phản ứng giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu đã xảy ra.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, một lượng lớn các chất như ADP, ATP và Ca++ được giải phóng, góp phần vào việc kích hoạt các tiểu cầu khác và duy trì sự ổn định của các liên kết trong quá trình ngưng tập Đồ thị kết quả cho thấy sự giảm dần nhưng chậm lại, chỉ ra rằng sự ngưng tập đã ổn định cho đến khi kết thúc thí nghiệm ở thời điểm 6 phút Chúng tôi đã sử dụng 5 L ADP 10 trong thí nghiệm này.
Nồng độ cuối cùng (M) cho thấy sự uốn cong nhẹ, tuy nhiên phản ứng giải phóng không xuất hiện trên đồ thị ngưng tập, dẫn đến việc khó xác định thời điểm bắt đầu của pha ngưng tập thứ phá.
Tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono-Log-490:
Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu
Cuvet Thành phần Bi khuấy
Ký hiệu (nồng độ cuối cùng)
3 495 L PRP + 5 L PPADS 10 mmol/L Có PPADS 100 M
5 450 L PRP + 50 L CW.A.EA 40 mg/mL Có EA 4 mg/mL
6 445 L PRP + 50 L CW.A.EA 40 mg/mL + 5 L PPADS 10 mmol/L Có EA 4 mg/mL +
7 450 L PRP + 50 L CW.A.DCM 120 mg/mL Có DCM 12 mg/mL
8 445 L PRP + 50 L CW.A.DCM 120 mg/mL + 5 L PPADS 10 mmol/L Có DCM 12 mg/mL +
- Đối với các ống có dịch chiết dược liệu: Ủ 5 phút ở 37 0 C trước khi đo.
- Đối với các ống có PPADS: Ủ 30 phút ở 37 0 C trước khi đo.
- Đối với các ống có dịch chiết dược liệu và PPADS: Ủ hỗn hợp PRP và PPADS
30 phút ở 37 0 C Thêm dịch chiết dược liệu, ủ 5 phút ở 37 0 C trước khi đo.
Độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet chứa PRP trước khi thêm chất gây ngưng tập là 0%, trong khi độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet chứa PPP đạt 100% Cần hiệu chỉnh đường nền về vạch 0 để đảm bảo độ chính xác trong quá trình đo lường.
2.2.4 Phân tích và xử lý số liệu
Phần mềm AggroLink tính toán các thông số quan trọng trong quá trình, bao gồm Slope, Amplitude và AUC (Diện tích dưới đường cong tập hợp) Slope thể hiện tốc độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC), với chỉ số càng cao đồng nghĩa với việc tiểu cầu ngưng tập nhanh hơn.
Phần trăm NTTC tối đa được xác định thông qua thông số Amplitude Để giảm thiểu sai số giữa các lần lấy mẫu vào những ngày khác nhau, phần trăm NTTC tối đa (Maximal Platelet Aggregation – MPA) của nhóm chứng âm được coi là 100% MPA của các nhóm khác được tính theo công thức cụ thể.
Thông số quan trọng nhất trong nghiên cứu là AUC, đại diện cho diện tích dưới đường cong ngưng tập, phản ánh mức độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) Một chỉ số khác cũng được phân tích là mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation - DEA) Để tính toán DEA, cần xác định phần trăm NTTC tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (Final Platelet Aggregation - FPA) một cách tương đối dựa vào đồ thị ngưng tập, do phần mềm không ghi nhận FPA Công thức tính DEA sẽ được áp dụng để đưa ra kết quả chính xác.
Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn), được phân tích bằng phần mềm Minitab 19.2 và SPSS 20.0 Số liệu của
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm định phân phối chuẩn và đồng nhất phương sai cho 28 nhóm Để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm, chúng tôi áp dụng kiểm định ANOVA một yếu tố kèm theo hậu kiểm Tukey Nếu dữ liệu không đáp ứng các giả định của phân tích phương sai, chúng tôi sẽ sử dụng kiểm định Kruskal-Wallis với hậu kiểm Dunn mà không áp dụng hiệu chỉnh Bonferroni Mức ý nghĩa thống kê được xác định khi P < 0,05.
Nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức cấp cơ sở của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội chấp nhận và thông qua Đề tài này nằm trong khuôn khổ nghiên cứu khoa học cấp Bộ của Bộ Khoa học và Công nghệ, do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ tài trợ.
Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số loài Dong riềng (Canna) nhằm phát triển các cây dược liệu quan trọng trong điều trị bệnh tim mạch, thuộc đề tài mã số 106.02-2018.334.
K Ế T QU Ả VÀ BÀN LU Ậ N
K ế t qu ả
Chúng tôi đã thực hiện đo động ngưng tập tiểu cầu in vitro cho 8 nhóm thí nghiệm bằng máy Chrono-Log-490 Kết quả của quá trình ngưng tập tiểu cầu được thể hiện qua các thông số quan trọng như tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope), phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA), mức động ngưng tập tiểu cầu (AUC) và mức độ phân rã ngưng tập (DEA).
3.1.1 Tốc độngưng tập tiểu cầu (Slope)
Bảng 3.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope)
Tốc độ NTTC của chứng âm và DMSO 0,5% là tương đương nhau Tuy nhiên, các nhóm sử dụng dịch chiết dược liệu và/hoặc PPADS cho thấy sự giảm tốc độ NTTC khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%.
Trong nghiên cứu, hai nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M cho thấy tốc độ NTTC thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với các nhóm chứng âm, bao gồm DMSO 0,5%, PPADS 100 M, EA 4 mg/mL và DCM 12 mg/mL (P < 0,05).
3.1.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA)
Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA)
Nhận xét: Phần trăm NTTC tối đa của nhómDMSO 0,5% tương đương với chứng âm Sự có mặt của dịch chiết dược liệu và/hoặc PPADS đều làm giảm MPA.
Hình 3.2 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình MPA của các nhóm
Các nhóm thử nghiệm có chứa PPADS và/hoặc dịch chiết dược liệu đã giảm rõ rệt phần trăm NTTC tối đa so với nhóm chứng âm và DMSO 0,5% (P < 0,05) Đặc biệt, hai nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 μM và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 μM cho thấy khả năng ức chế ngưng tập mạnh hơn so với nhóm chỉ sử dụng PPADS 100 μM.
M (P < 0,05) Đặc biệt, nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M ức chế ngưng tập mạnh hơn hai nhómchỉ có dược liệumột cách có ý nghĩa thống kê
3.1.3 Mức độngưng tập tiểu cầu (AUC)
Bảng 3.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC)
Kết quả cho thấy nhóm chứng âm và DMSO 0,5% có mức độ NTTC tương đương nhau Tất cả các nhóm có chứa dịch chiết dược liệu và/hoặc PPADS đều giảm mức độ NTTC khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%.
Bảng 3.4 Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm
Nhận xét: Các nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M, DCM 12 mg/mL và
DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M đều làm giảm mức độ NTTC một cách rõ rệt khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5% Đặc biệt, AUC của nhóm DCM
12 mg/mL + PPADS 100 M thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với AUC của nhóm PPADS 100 M và EA 4 mg/mL
3.1.4 Mức độphân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA)
Bảng 3.5 Mức độ phân rã ngưng tập (DEA)
Nhận xét cho thấy rằng hai nhóm chứng âm và DMSO 0,5% không xảy ra hiện tượng phân rã ngưng tập, trong khi hai nhóm chứa phân đoạn DCM có mức độ phân rã mạnh nhất Kết quả phân tích PKruskal-Wallis với giá trị p > 0,05 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ phân rã ngưng tập (DEA) giữa các nhóm.
3.1.5 Đồ thịngưng tập tiểu cầu
Hình 3.3 Đồ thịngưng tập tiểu cầu của các nhóm
(A: Chứng âm, B: DMSO 0,5%, C: PPADS 100 M, D: DMSO 0,5% + PPADS
100 M, E: EA 4 mg/mL, F: EA 4 mg/mL + PPADS 100 M,
G: DCM 12 mg/mL, H: DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M)
Hai nhóm chứng âm và DMSO 0,5% đã thể hiện đồ thị đặc trưng cho quá trình NTTC in vitro được kích thích bởi ADP Đồ thị của các nhóm này cho thấy những thay đổi rõ rệt trong phản ứng sinh học.
PPADS và phân đoạn dịch chiết chỉ xuất hiện pha ngưng tập nguyên phát mà không có pha ngưng tập thứ phát Sự kết hợp giữa dịch chiết dược liệu và PPADS cho thấy tác dụng ức chế ngưng tập mạnh mẽ hơn so với từng nhóm chỉ có một trong hai Có sự ghi nhận về xu hướng phân rã ngưng tập sau khi đạt cực đại, với phần trăm NTTC điểm cuối (FPA) thấp hơn phần trăm NTTC tối đa (MPA) Tuy nhiên, tốc độ và mức độ phân rã khác nhau giữa các nhóm, trong đó hai nhóm có phân đoạn DCM cho thấy quá trình phân rã ngưng tập diễn ra rất nhanh và hoàn toàn.
Bàn lu ậ n
Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu bằng độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry - LTA) đã được giới thiệu hơn 50 năm trước và hiện vẫn là tiêu chuẩn vàng trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu cũng như hiệu quả của các thuốc kháng tiểu cầu.
ADP là một chất kích thích quan trọng trong quá trình ngưng tập tiểu cầu, hoạt động thông qua việc tương tác với hai thụ thể P2Y1 và P2Y12 Sự kết hợp của hai thụ thể này là cần thiết để tối ưu hóa quá trình ngưng tập do ADP gây ra Nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng 5 L ADP 10 để phân tích tác động của nó.
Sự uốn cong nhẹ trong quá trình này cho thấy phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu, đánh dấu sự khởi đầu của pha ngưng tập thứ phát mà chưa được quan sát thấy.
PPADS là một chất ức chế không đặc hiệu các thụ thể purinergic trên màng tiểu cầu, bao gồm thụ thể P2X1 được kích hoạt bởi ATP và thụ thể P2Y1 cùng P2Y12 được kích hoạt bởi ADP Trong thí nghiệm đo NTTC, nồng độ cuối cùng của PPADS được xác định.
100 M Đây cũng là nồng độ ức chế tối đa 50% (IC50) của PPADS với thụ thể P2Y12 Ái lực của PPADS với P2Y1 là KB = 4 – 12 M [30]
3.2.2 Kết quả nghiên cứu Đồ thị ngưng tập miêu tả một cách trực quan nhất diễn biến của quá trình NTTC Kết hợp với bốn thông số: tốc độ NTTC (Slope), phần trăm NTTC tối đa
Mức độ phân rã ngưng tập (DEA), mức độ NTTC (AUC) và quá trình NTTC với chất kích thích ADP đã được đánh giá và phân tích một cách đầy đủ hơn.
Sau khi thêm chất kích thích ADP, tất cả các nhóm đều ghi nhận sự thay đổi hình dạng của tiểu cầu, được thể hiện qua đồ thị có xu hướng đi lên nhẹ, hình thành đỉnh nhọn và sau đó giảm xuống, báo hiệu sự khởi đầu của pha ngưng tập nguyên phát.
Thụ thể P2Y1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình thay đổi hình dạng và pha ngưng tập nguyên phát của tiểu cầu Khi ADP gắn vào P2Y1, nó kích hoạt một chuỗi phản ứng dẫn đến sự tương tác giữa IP3 và thụ thể của nó, làm tăng nồng độ Ca++ nội bào Sự gia tăng này kích thích các protein tham gia vào việc cắt và ghép các vi sợi actin, dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc khung xương tế bào Tiểu cầu chuyển từ hình đĩa sang hình cầu, sau đó co lại và hình thành các chân giả cùng phần mở rộng (lamellipodia) Các nghiên cứu cho thấy rằng các phân đoạn EA 4 mg/mL, DCM 12 mg/mL và PPADS 100 µM không ảnh hưởng đến giai đoạn thay đổi hình dạng của tiểu cầu.
Sự gia tăng nồng độ Ca ++ nội bào kích hoạt thụ thể GPIIb/IIIa, dẫn đến hình thành ngưng tập tiểu cầu CalDAG-GEFI xúc tác chuyển đổi RAP1-GDP thành RAP1-GTP, giúp thụ thể GPIIb/IIIa chuyển từ trạng thái ái lực thấp sang cao, liên kết với fibrinogen trong huyết tương Khi tiểu cầu liên kết qua cầu fibrinogen, ngưng tập nguyên phát diễn ra mạnh mẽ, làm tăng độ dẫn truyền ánh sáng và khiến đồ thị ngưng tập có xu hướng đi xuống Tốc độ ngưng tập nguyên phát được đánh giá qua giá trị Slope, được tính bằng cách vẽ đường tiếp tuyến với đồ thị ngay sau khi tiểu cầu thay đổi hình dạng Tiểu cầu ngưng tập nhanh và nhiều sẽ tạo ra đồ thị dốc hơn, với giá trị Slope lớn hơn Các nhóm chứa phân đoạn dịch chiết và/hoặc PPADS được chỉ ra là làm giảm tốc độ ngưng tập.
Khi so sánh NTTC với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%, hai nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M cho thấy tốc độ ngưng tập thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với nhóm PPADS 100.
Kết quả cho thấy tác dụng hiệp đồng của PPADS kết hợp với hai phân đoạn dịch chiết EA 4 mg/mL và DCM 12 mg/mL trong việc ức chế tiểu cầu ngưng tập, đồng thời làm giảm tốc độ NTTC.
Quá trình ngưng tập của tiểu cầu diễn ra theo hai xu hướng, trong đó xu hướng ngưng tập ổn định được đặc trưng bởi sự giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu, dẫn đến việc khuếch đại và củng cố ngưng tập, hình thành pha ngưng tập thứ phát Thụ thể P2Y12 đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn này, khi ADP tương tác với P2Y12, kích hoạt phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) thông qua tiểu đơn vị βγ PI 3-K có hai tác động chính: đầu tiên, nó ức chế RASA3, một chất xúc tác giúp biến đổi RAP1-GTP trở lại RAP1-GDP, từ đó duy trì trạng thái hoạt hóa của GPIIb/IIIa và làm bền vững liên kết giữa các tiểu cầu, củng cố quá trình ngưng tập.
PI 3-K ảnh hưởng đến quá trình giải phóng chất từ hạt tiểu cầu qua cơ chế chưa được làm rõ, với hạt đặc tiết ADP, ATP, Ca++, serotonin và histamine, giúp tăng cường sự ngưng tập tiểu cầu ATP kích hoạt kênh ion P2X1, làm gia tăng nồng độ Ca++ nội bào, trong khi ADP kích hoạt các tiểu cầu khác tham gia vào quá trình này Hạt α cũng tiết ra các protein dính như fibrinogen và vWF, củng cố liên kết giữa các tiểu cầu Hơn nữa, P2Y12 ổn định ngưng tập thông qua ức chế adenylyl cyclase (AC) Quá trình ngưng tập ổn định được thể hiện qua đồ thị ngưng tập của chứng âm và DMSO 0,5%, cho thấy phản ứng giải phóng và pha ngưng tập thứ phát, với phần trăm NTTC tối đa (MPA) tương ứng với phần trăm NTTC điểm cuối (FPA).
Các nhóm còn lại trong đồ thị (Hình 3.3 C – H) thể hiện xu hướng phân rã ngưng tập, với đồ thị uốn cong ngược trở lại và đi lên khi đạt đến điểm thấp nhất Điều này dẫn đến việc FPA nhỏ hơn MPA, và MPA của các nhóm này đều thấp hơn MPA.
38 của chứng âm và DMSO 0,5% Đặc biệt, nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100
M có phần trăm NTTC tối đa thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm PPADS 100 M, EA 4 mg/mL và DCM 12 mg/mL
Tiểu cầu ngưng tập chủ yếu thông qua liên kết giữa thụ thể GPIIb/IIIa và fibrinogen, và hiện tượng phân rã ngưng tập xảy ra khi liên kết này bị phá vỡ Sự phân rã này khác nhau giữa các nhóm có chứa phân đoạn dịch chiết và/hoặc PPADS Đặc biệt, ở nhóm PPADS 100 M hoặc DMSO 0,5% + PPADS 100 M, các thụ thể P2Y1 và P2Y12 bị ức chế, dẫn đến tín hiệu đáp ứng ngưng tập của ADP không đủ mạnh để kích thích phản ứng giải phóng khi nồng độ PPADS lớn hơn khoảng 10 lần so với nồng độ ADP Điều này được củng cố bởi việc ngưng tập do ADP nồng độ thấp (< 2,5 M) thường không có pha ngưng tập thứ phát Thêm vào đó, thụ thể GPIIb/IIIa không duy trì ở trạng thái hoạt hóa, khiến liên kết giữa các tiểu cầu trở nên lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ trong dòng chất lỏng do viên bi khuấy tạo ra Đồ thị ngưng tập của hai nhóm này cho thấy sự tăng dần và chưa hoàn toàn phân rã ở điểm cuối.
Xu hướng phân rã này cũng được quan sát thấy ởđồ thị ngưng tập của nhóm EA