Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của luận án là đánh giá khả năng khai thác lipase từ các nguồn thực vật sẵn có tại Việt Nam và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, nhằm tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ những nguồn thực vật phổ biến ở quốc gia này.
Mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
1 - Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật:
+ Hạt có dầu + Phụ phẩm nông nghiệp + Mủ các loại quả
2 - Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật;
3 - Xác định các đặc tính hoá sinh của lipase thô và lipase tinh sạch;
4 - Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc những mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định các nội
- Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase;
- Nghiên cứu các yếu tốảnh hưởng đến hoạt độlipase thu được;
- Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô có hoạt độ cao từ nguyên liệu đã lựa chọn;
- Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hoá sinh của lipase thô;
- Nghiên cứu tinh sạch lipase thô và xác định đặc tính hoá sinh của lipase tinh sạch;
- Nghiên cứu ứng dụng lipase thô trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tƣ liệu, sách báo, các công trình đã nghiên cứu về enzyme lipase.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phương pháp xác định thành phần nguyên liệu thực vật gồm: phương pháp xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro tổng, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng chất béo
- Các phương pháp thu nhận lipase từ đậu phộng nảy mầm, đậu nành nảy mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ, mủ vả và mủ sung
- Các phương pháp xác định hoạt độ lipase: phương pháp chuẩn độ, phương pháp đo quang, phương pháp đĩa thạch
- Các phương pháp tinh sạch lipase: xác định điểm đẳng điện, phương pháp tủa bằng amoni sunfat, phương pháp sắc ký trao đổi ion, phương pháp điện di.
- Các phương pháp hóa lý xác định chỉ tiêu chất lượng dầu cá hồi: chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester
- Các phương pháp toán học: phương pháp quy hoạch thực nghiệm, phương pháp tối ƣu hoá.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Từ những nội dung nghiên cứu đƣợc định ra trong luận án sẽtoát lên ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn nhƣ sau:
Nghiên cứu đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn nguyên liệu thực vật, đồng thời phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm Qua đó, xác định nguồn nguyên liệu thực vật tiềm năng cho việc khai thác enzyme lipase.
- Đề xuất đƣợc quy trình thu lipase thô từ nguồn thực vật có hiệu quả cao
- Xác định đƣợc tính đặc hiệu đối với cơ chất lipid của lipase thô thu nhận đƣợc từ nguồn thực vật
- Đề xuất phương pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối lƣợng phân tử của lipase
- Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất lipase thô
Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ trong việc thủy phân dầu cá hồi giúp thu được acid béo, từ đó tạo tiền đề cho quá trình làm giàu DHA và EPA, phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm.
Bố cục của luận án
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
T Ổ NG QUAN
Tổng quan về lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) là một loại enzyme thuộc lớp hydrolase, có khả năng hoạt động hiệu quả tại bề mặt liên pha dầu – nước Tiềm năng xúc tác của lipase đã được phát hiện từ năm 1930 qua nghiên cứu của JBS Haldane và các cộng sự.
Lipase là enzyme có khả năng xúc tác nhiều phản ứng khác nhau, bao gồm thủy phân, chuyển ester và tổng hợp ester Phản ứng thủy phân triglyceride để tạo ra glycerol và acid béo là một trong những đặc trưng nổi bật của lipase Bên cạnh đó, trong điều kiện ít nước, lipase còn có thể xúc tác cho các phản ứng tổng hợp ester và chuyển ester.
Phản ứng tổng hợp thioester
Phản ứng thế gốc acid
Phản ứng thế gốc amin
Phản ứng thế gốc ancol
Phản ứng chuyển vị ester
Lipase là enzyme được tìm thấy phổ biến trong vi sinh vật, động vật và thực vật Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng lipase vi sinh vật có thể được thu nhận từ các loài như Pseudomonas và Bacillus sp LBN 4.
Lipase là một enzyme quan trọng trong quá trình tiêu hóa lipid, được thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của các loài động vật như trâu, bò, cừu, lợn và một số loại cá Nghiên cứu đã chỉ ra rằng lipase cũng có thể được chiết xuất từ nội tạng của cá lóc và cá tra Ngoài ra, lipase cũng được tìm thấy trong cơ, huyết tương, ống tiêu hóa và các tuyến nước bọt của côn trùng Đặc biệt, lipase chịu nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus đã được chiết tách thành công bởi Diaza và cộng sự vào năm 2006.
Thực vật là nguồn cung cấp lipase quan trọng nhờ vào những ưu điểm như giá thành thấp, tính đặc hiệu cao, dễ dàng chấp nhận và khả năng ứng dụng đa dạng.
Lipase từ thực vật rất đa dạng và phong phú, có thể thu nhận từ các nguồn thực vật tự nhiên mà không cần quy trình nuôi cấy nghiêm ngặt như lipase từ vi sinh vật Lipase chủ yếu tồn tại ở dạng dự trữ trong các mô hạt đang phát triển, đặc biệt là nơi chứa triacylglycerol Hoạt động lipase tăng lên trong quá trình nảy mầm, giúp chuyển hóa triacylglycerol thành glycerol và acid béo qua phản ứng thủy phân, cung cấp carbon và năng lượng cho sự phát triển của cây non Nghiên cứu đã chỉ ra lipase có nguồn gốc từ nhiều loại hạt như phôi dừa, hạt hoa hướng dương, hạt lupin vàng, hạt nguyệt quế và hạt hạnh nhân Ngoài ra, lipase cũng được tìm thấy trong một số loại ngũ cốc như đậu nành, yến mạch và cám gạo, cũng như trong mủ của một số loại quả như mủ đu đủ, mủ sung và mủ xương rồng.
1.1.2 C ấ u trúc và cơ chế xúc tác c ủ a lipase
Ngày nay, hàng trăm loại lipase đã đƣợc xác định cấu trúc không gian 3 chiều trong cơ sở dữ liệu protein
Lipase có nguồn gốc từ nhiều nguồn khác nhau, thường có kích thước phân tử khác nhau và ít có sự tương đồng về trình tự Nghiên cứu về các lipase đã được kết tinh cho thấy phần lớn chúng là protein có cấu trúc α/β, với một trung tâm là các cấu trúc gấp nếp β được bao quanh bởi nhiều dải xoắn α.
Mô hình enzyme lipase từ Arabidopsis thaliana, theo nghiên cứu của Theo Abdelmonaem và cộng sự (2011), có cấu trúc monomer dạng α/β với 8 chuỗi gấp β và 22 chuỗi xoắn α Lipase này tương tự như lipase từ động vật và vi khuẩn, nhưng khác nhau về số lượng chuỗi xoắn α và chuỗi gấp β Hình 1.1 minh họa cấu trúc 3D của lipase Arabidopsis thaliana.
The active site of lipase is formed by a catalytic triad consisting of the amino acids serine, histidine, and aspartic acid/glutamic acid While the chemical nature of the active sites in both lipase and protease is similar, their structures differ significantly.
Hình 1.1 Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76]
Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester được xúc tác bởi esterase bao gồm các bước sau: (a) hình thành tứ diện trung gian; (b) tạo acyl-enzyme trung gian và sự tấn công nucleophilic bằng nước; (c) hình thành tứ diện trung gian tiếp theo; và (d) cuối cùng là enzyme trở về trạng thái tự do.
Cơ chế xúc tác của lipase được cho là tương tự với xúc tác của serine protease do sự giống nhau của bộ ba xúc tác được tìm thấy trong lipase so với những gì được quan sát trong serine protease.
Cơ chế phản ứng xúc tác thủy phân của lipase bắt đầu khi nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme tấn công vào carbon của liên kết ester trong cơ chất Quá trình này tạo thành phức acyl-enzyme và giải phóng ancol từ lipid Cuối cùng, phức acyl-enzyme bị thủy phân, dẫn đến việc lipase tự do được giải phóng trở lại.
Mỗi loại lipase có khả năng xúc tác chuyển hóa một loại cơ chất hoặc một kiểu phản ứng hóa học cụ thể, thể hiện tính đặc hiệu của lipase.
Theo Villeneuve (2003) và cộng sự, tính đặc hiệu của lipase có thể chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
Lipase có đặc hiệu cơ chất chủ yếu là glycerol ester, có khả năng xúc tác thủy phân triacylglycerol (TAG), di- và monoacylglycerol, cũng như phospholipid Đặc điểm này cho thấy lipase có thể tác động lên các cơ chất glycerol ester với chuỗi acid béo dài hoặc ngắn khác nhau Để xác định tính đặc hiệu cơ chất, enzyme được ủ với các cơ chất và đo hoạt độ enzyme, trong đó sử dụng các ester của p-nitrophenyl với chiều dài chuỗi carbon khác nhau Một số nghiên cứu cũng đã sử dụng triglyceride với các chuỗi acid béo bão hòa và chưa bão hòa để đánh giá tính đặc hiệu của lipase Nghiên cứu của S Abdekafi và cộng sự chỉ ra rằng enzyme chiết tách từ mủ đu đủ có tính đặc hiệu cao nhất trên tributyrin.
(168 ± 9,8 U/mg) so với cơ chất trioctanoin (14 ± 3,0 U/mg) và dầu oliu (8 ± 1,3 U/mg) [17]
Lipase có tính đặc hiệu vị trí, chỉ thủy phân triacylglycerol tại các liên kết C1 và C3 của glycerol, tạo ra acid béo, 2-monoacylglycerol và 1,2 hoặc 2,3-diacylglycerol Hai sản phẩm này không bền và dễ chuyển nhóm acyl, dẫn đến sự hình thành 1,3-diacylglycerol và 1- hoặc 3-monoacylglycerol Ngược lại, lipase không có tính đặc hiệu vị trí sẽ xúc tác thủy phân triacylglycerol thành các acid béo và glycerol một cách ngẫu nhiên, tạo ra mono- và diacylglycerol như các sản phẩm trung gian.
Hình 1.3 Phản ứng xúc tác bởi lipase không đặc hiệu và đặc hiệu vị trí sn 1, sn 3 [25]
- Đặc hiệu quang học: lipase thể hiện khả năng phân biệt các dạng đồng phân trong hỗn hợp đồng phân quang học [25]
1.1.4 Các h ệ ph ả n ứ ng cho lipase xúc tác
Lipase thực vật
1.2.1 Kh ả năng xúc tác củ a lipase th ự c v ậ t
Lipase thực vật, có mặt trong hầu hết các hạt có dầu, có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân và tổng hợp nhiều loại cơ chất khác nhau So với lipase từ động vật và vi sinh vật, lipase thực vật nổi bật với tính đặc hiệu cao, chi phí thấp và được thu nhận từ các nguồn thực vật tự nhiên mà không cần công nghệ biến đổi gen.
Lipase thực vật có thể được chiết xuất từ các nguồn tự nhiên như hạt, mủ quả và phụ phẩm nông nghiệp, mang lại ứng dụng an toàn trong thực phẩm cho con người Việc khai thác enzyme lipase từ thực vật không chỉ an toàn mà còn có tiềm năng kinh tế lớn cho ngành công nghệ enzyme.
Lipase thực vật bao gồm nhiều loại lipid acylhydrolase không đặc hiệu, như phospholipase A1, A2, B, C, D, cũng như monoacylglycerol và triacylglycerol lipase Triacylglycerol acylhydrolase (TAG) lipase chủ yếu được tìm thấy trong các loại hạt giàu năng lượng, đặc biệt là hạt chứa nhiều chất béo Enzyme này có khả năng hoạt động ổn định trong khoảng pH từ 4 đến 9 và nhiệt độ từ 25°C đến 60°C, với khối lượng phân tử khoảng 19 kDa.
Lipase chiết xuất từ các nguồn thực vật khác nhau có khối lượng phân tử khoảng 270 kDa và đặc tính đa dạng Đến nay, chỉ có 29 loại lipase thực vật được xác định với khối lượng phân tử và trình tự acid amin trong chuỗi protein Sự hạn chế trong nghiên cứu về lipase thực vật cho thấy chúng vẫn chưa được khảo sát nhiều, chủ yếu chỉ ứng dụng trong một số lĩnh vực cụ thể.
1.2.2.1 Lipase từ hạt có dầu
Lipase từ hạt không chỉ sở hữu những đặc điểm chung của nhóm lipase mà còn có những đặc điểm riêng biệt Nhiều nghiên cứu quốc tế đã chỉ ra các tính chất đặc trưng của lipase thu nhận từ các loại hạt có dầu, được trình bày rõ ràng trong Bảng 1.1.
Theo Bảng 1.1, lipase thực vật chủ yếu tập trung ở các hạt dầu, giàu triacylglycerol Lipase từ các loại đậu hoạt động hiệu quả ở pH gần trung tính, với nhiệt độ tối ưu khoảng 30°C, và có tính đặc hiệu với acid béo chuỗi ngắn và trung bình Đặc biệt, lipase từ hạt đậu Africa cho thấy hiệu suất tốt khi xử lý dầu dừa Hầu hết lipase từ các loại đậu đều tăng cường hoạt tính xúc tác trong phản ứng thủy phân dầu oliu khi có sự hiện diện của ion Ca²⁺ Đối với hạt hạnh nhân và hạt nguyệt quế, lipase hoạt động hiệu quả hơn ở pH kiềm và ở nhiệt độ cao từ 50°C đến 65°C.
Bảng 1.1 Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72]
Ngu ồ n pH opt T o opt Ch ấ t ho ạ t hóa Ch ấ t ứ c ch ế Cơ chấ t Đặ c hi ệ u v ị trí Ứ ng d ụ ng
7,0 30 o C Ca 2+ EDTA Dầu dừa Thủy phân
(Phaseolus vulgaris) 7,0 35 o C Tween 20 Ca 2+ D ầ u oliu, triacetine, d ầ u h ạt đậ u French Thủy phân
(Phaseolus vulgaris) 4,5 30 o C Ca 2+ p- Chloromercuribenzoic p - nitrophenyl butyrate sn – 1, sn – 2 Ester hóa
(Brassica napus L.) 7,0 37 o C Bi 3+ , Ca 2+ Fe 3+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ ,
Cu 2+ , Dầu oliu Ester hóa
(Jatropa curcas L.) 7,5 37 o C Ca 2+ , Mg 2+ Fe 2+ Dầu oliu Thủy phân
(Lupinus luteus L.) 5,0 45 o C Ca 2+ , Mg 2+ , K + D ầ u lupin sn – 1, sn – 2 Th ủ y phân
8,0 40 o C Ca 2+ , Mg 2+ Hg 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ , Al 3+ p-nitrophenyl acetate Thủy phân
(Amygdalus comunis L.) 8,5 65 o C Ca 2+ , Mn 2+ Co 2+
Ba 2+ Fe 2+ Mg 2+ Cu 2+ Ni 2+ Dầu đậu nành Thủy phân
(Laurus nobilis L.) 8,0 50 o C Ca 2+ , Mg 2+ , Co 2+ ,
Cu 2+ , Fe 2+ D ầ u nguy ệ t qu ế Th ủ y phân
Th ủ y phânEster hóaChuyển ester
Ngu ồ n pH opt T o opt Ch ấ t ho ạ t hóa Ch ấ t ứ c ch ế Cơ chấ t Đặ c hi ệ u v ị trí Ứ ng d ụ ng
(Triticum aestivum L.) 8,0 37 o C Triolein Thủy phân.
Zn 2+ p-nitrophenyl palmitate Th ủ y phân
(Cocos nucifera linn) 8,5 30 – 40 o C Dầu oliu sn – 1, sn – 3 Thủy phân
Nghiên cứu của Cambon và cộng sự vào năm 2006 đã chỉ ra rằng hoạt tính thủy phân của lipase từ mủ babaco (Vasconcellea x Heilbornii cv.) và Plumeria trên cơ chất dầu hướng dương có nhiệt độ tối ưu từ 50 °C đến 55 °C Đối với lipase từ mủ babaco, giá trị pH tối ưu là 7, trong khi lipase từ Plumeria có hai giá trị pH tối ưu là 4 và 7.
Nghiên cứu của S Abdefafi và cộng sự đã chỉ ra rằng hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ khi thủy phân tributyrin, dầu oliu và trioctanoin đạt giá trị 2000 ±.
Hoạt tính enzyme từ mủ đu đủ được xác định với giá trị 185 U/g, 256 ± 8 U/g và 983 ± 29 U/g ở nhiệt độ tối ưu 37 °C và pH 9, cho thấy enzyme này chủ yếu là esterase hơn là lipase khi sử dụng cơ chất tributyrin Lipase thể hiện hoạt tính trên cơ chất có chuỗi acid béo mạch dài trên 10 carbon như dầu oliu Đặc điểm nổi bật của CPL là khả năng hoạt động hiệu quả trong phạm vi pH và nhiệt độ rộng, với khả năng chịu nhiệt tốt nhờ vào việc enzyme này được cố định trong mủ CPL hoạt động tối ưu ở pH 9 và nhiệt độ 37 °C trên cơ chất dầu oliu, trong khi hoạt tính của CPL đạt cực đại ở pH 8 và 9 với cơ chất tributyrin và trioctanoin Giá trị pH tối ưu cho hoạt động của CPL tương tự như các lipase thực vật khác như lipase từ quả cọ và babaco.
Mặc dù mủ đu đủ chứa lipase với hoạt tính mạnh, việc tinh sạch enzyme này vẫn chưa thành công do khó khăn trong việc hòa tan enzyme Phân tích bằng điện di và khối phổ đã xác định được 28 loại protein trong phân đoạn không tan của mủ đu đủ CPL bị mất hoạt tính trong môi trường có Triton X100, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) và Tetradecyl Trimethylammonium Bromide (TTAB), nhưng vẫn duy trì hoạt tính cao khi có Sodium Taurodeoxycholate (NaTCD) và chất tẩy rửa ion lưỡng cực Chaps Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng CPL có khả năng chống lại nhiều loại protease, ngoại trừ trypsin, cho thấy tiềm năng ứng dụng của CPL trong nhiều lĩnh vực.
Lipase từ mủ sung và mủ xương rồng đã được nghiên cứu và xác định đặc tính bởi Houda Lazreg và cộng sự Lipase mủ sung có nhiệt độ tối ưu là 45°C và pH tối ưu là 5,5 khi sử dụng cơ chất dầu oliu Trong khi đó, lipase mủ xương rồng hoạt động hiệu quả nhất ở điều kiện khác, tuy nhiên thông tin cụ thể chưa được đề cập.
40 o C, pH 8 trên cơ chất tributyrin và dầu oliu và có khối lƣợng phân tử 40kDa
1.2.3 Phương pháp chiế t tách lipase t ừ th ự c v ậ t
Lipase thực vật thường được sử dụng dưới dạng chiết xuất thô, chiết xuất tinh sạch một phần, hoặc ở dạng lipase tinh khiết được thu nhận qua các phương pháp chiết tách.
Các phương pháp chiết tách lipase từ thực vật bao gồm nhiều bước khác nhau, tùy thuộc vào bộ phận thực vật và mức độ tinh sạch mong muốn Quá trình chiết xuất thường bắt đầu với việc chuẩn bị thực vật thô và sau đó là tinh sạch lipase.
1.2.3.1 Chuẩn bị thực vật chiết thô
Quá trình chuẩn bị thực vật chiết thô thường bao gồm 2 bước là nghiền sinh khối và tách loại lipid sinh khối nghiền
Quá trình chiết enzyme thực vật bắt đầu bằng việc nghiền các phần khác nhau của nguyên liệu, giúp phá vỡ sinh khối thành các hạt nhỏ Việc này làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi trường bên ngoài, từ đó nâng cao khả năng enzyme tiếp xúc với dung môi chiết.
Tách lipid khỏi thực vật bằng dung môi hữu cơ là bước quan trọng trong quá trình chiết xuất enzyme lipase Lipid, chủ yếu là acid béo và triacylglycerol, có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiết và hoạt động của lipase Việc loại bỏ lipid không chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết lipase trong pha nước mà còn nâng cao năng suất và hoạt độ của enzyme này Nghiên cứu của Kapranchikov và cộng sự cho thấy rằng việc loại bỏ lipid trước khi chiết enzyme có thể cải thiện hoạt động của lipase từ mầm lúa mì lên đến 1,8 lần Tương tự, Kazim Kose đã sử dụng acetone để loại lipid trong cám gạo trước khi tiến hành chiết lipase.
Dầ u cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá
Dầu cá, theo IFFO (Tổ chức cá và dầu cá quốc tế), là một chất lỏng màu vàng hoặc nâu được chiết xuất từ thịt cá và thường được tinh chế Sản phẩm này được sản xuất từ các phụ phẩm của cá sau quá trình chế biến, bao gồm thịt vụn, xương, lườn và đầu của các loài cá giàu chất béo như cá hồi, cá trích, cá mòi và cá ngừ Những phụ phẩm này cũng được sử dụng để chế biến dầu cá và bột cá, chiếm khoảng 10-15% thị phần toàn cầu.
Dầu cá như cá ngừ, cá hồi, cá trích và cá mòi là nguồn cung cấp acid béo không bão hòa đa (PUFA) omega-3, đặc biệt là DHA (Docosahexaenoic acid) và EPA (Eicosapentaenoic acid), rất cần thiết cho cơ thể con người Cả DHA và EPA đều thuộc nhóm omega-3, đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe, nhưng cơ thể không thể tự tổng hợp chúng.
DHA là một trong những axit béo không no đa nối đôi (PUFA) quan trọng trong ngành dược, giúp ngăn chặn và kiểm soát nhiều bệnh lý như bệnh tim mạch, viêm, dị ứng, ung thư, và các rối loạn về miễn dịch, tiểu đường, tăng huyết áp và bệnh thận Ngoài ra, DHA còn được biết đến như thực phẩm tốt cho não, do nó tập trung nhiều trong màng tế bào não và tế bào võng mạc của mắt.
EPA (C20:5, ω-3) là acid béo thiết yếu, chuyển hoá thành các chất sinh học quan trọng như prostaglandin và leucotrien Prostaglandin có tác dụng ức chế sự đông vón tiểu cầu, giảm nguy cơ hình thành huyết khối, đồng thời hỗ trợ giảm cholesterol và triglyceride trong máu, từ đó làm giảm độ nhớt của máu Ngoài ra, EPA còn giúp giảm tình trạng xơ vữa động mạch, mang lại lợi ích cho việc phòng ngừa và điều trị các bệnh tim mạch liên quan đến xơ vữa động mạch.
Hình 1.4 Cấu trúc phân tử DHA, EPA
Cá hồi, thuộc họ Salmonidae, là nguồn thực phẩm quý giá với nhiều lợi ích cho sức khỏe nhờ chứa vitamin, DHA, EPA, các nguyên tố vi chất và acid amin Loài cá này sinh sống ở các bờ biển Bắc Đại Tây Dương và Thái Bình Dương, trong khi ở Việt Nam, cá hồi được nuôi trồng chủ yếu tại Sa Pa, Đà Lạt, Lạng Sơn, Bắc Giang và một số vùng khác Đặc biệt, dầu cá hồi có hàm lượng cao các acid béo không no đa nối đôi ω-3 PUFA, với khoảng 11% EPA và 12,9% DHA.
Dầu cá hồi có hàm lượng omega-3 cao hơn nhiều loại dầu cá khác, nhưng khi chiết tách, hàm lượng DHA và EPA thu được từ dầu cá hồi chỉ đạt dưới 30%.
Do đó, việc nghiên cứu sản xuất triglyceride giàu DHA, EPA từ dầu cá hồi là cần thiết
1.3 2 Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá
DHA có thể được chiết xuất từ dầu cá và các sản phẩm triglyceride chứa hàm lượng DHA và EPA cao thông qua các phương pháp hóa học hoặc enzyme Phương pháp enzyme ưu việt hơn do giảm chi phí dung môi, thực hiện phản ứng trong điều kiện pH và nhiệt độ nhẹ, có tính đặc hiệu cao và dễ dàng thực hiện.
Lipase (EC 3.1.1.3) có khả năng xúc tác cả phản ứng thủy phân dầu và phản ứng ester hóa với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào loại lipase Điều kiện cụ thể của phản ứng sẽ quyết định loại phản ứng nào diễn ra Phản ứng thủy phân là phản ứng thuận nghịch và có thể thay đổi chiều khi có sự thay đổi về yếu tố, chẳng hạn như hàm lượng nước trong phản ứng.
Quá trình tổng hợp triglyceride giàu DHA và EPA, hay còn gọi là làm giàu DHA, EPA, diễn ra thông qua tính đặc hiệu của lipase, trong đó mỗi enzyme chỉ xúc tác thủy phân một loại acid béo nhất định trong glyceride Nhờ đặc tính này, các acid béo không mong muốn có thể bị loại bỏ, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc phân tử chất béo Qua các phản ứng enzyme đặc trưng, quá trình này giúp thu được sản phẩm có hàm lượng DHA và EPA cao hơn so với ban đầu.
Một trong những phương pháp enzyme hiệu quả để tổng hợp triglyceride giàu DHA là thủy phân và ester hóa chọn lọc, như thể hiện trong sơ đồ Hình 1.5.
Đến nay, nghiên cứu về việc ứng dụng lipase từ vi sinh vật để làm giàu DHA và EPA trong dầu cá đã được thực hiện nhiều, trong khi lipase từ thực vật vẫn chưa có công bố Một số loại lipase cố định như Candida cilyndracea, Candida rugosa, và Rhizomucor miehei đã được sử dụng để thủy phân dầu cá nhằm thu được acid béo omega 3 Lipase cố định mang lại nhiều ưu điểm so với lipase tự do, bao gồm độ bền cao hơn trong khoảng pH và nhiệt độ rộng, tính đặc hiệu tốt hơn, hoạt tính cao, và khả năng tái sử dụng Việc thu hồi lipase cố định cũng dễ dàng hơn, giúp giảm chi phí enzyme.
Hướng ứng dụng của đề tài là sử dụng lipase để thủy phân dầu cá hồi, từ đó tạo điều kiện cho quá trình làm giàu DHA và EPA trong dầu cá.
Hình 1.5 Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37]
Pha hữu cơ chứa glyceride
Ester của các acid béo khác DHA, EPA
Th ủ y phân b ởi lipase không đặ c hi ệ u
Chi ế t v ớ i hexan và KOH trong c ồ n
Chiết FFA trong pha nước
Ester hóa với butanol bởi lipase không đặ c hi ệ u v ớ i DHA, EPA
Tách phân đoạ n acid béo giàu DHA, EPA
Ester hóa với glycerol bởi lipase đặc hiệu với DHA, EPA
Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu
1.4.1 Tình hình nghiên c ứ u trên th ế gi ớ i
Trước đây, nghiên cứu về lipase chủ yếu tập trung vào việc thu nhận enzyme từ nuôi cấy vi sinh vật và động vật Hiện nay, lipase từ nguồn thực vật đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ từ các nhà khoa học trên toàn thế giới.
1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu đặc tính lipase từ thực vật
Bài viết tóm tắt những đặc tính của lipase từ các nguồn thực vật khác nhau, được nghiên cứu bởi nhiều tác giả trên thế giới, như thể hiện trong các Bảng 1.2, Bảng 1.3 và Bảng 1.4.
Bảng 1.2 cho thấy lipase từ các nguồn hạt chứa dầu đã được nghiên cứu chủ yếu về việc thu nhận và xác định các yếu tố như nhiệt độ, pH tối ưu, chất hoạt hóa và chất kìm hãm, cũng như tính đặc hiệu của lipase trên các cơ chất khác nhau Lipase từ hạt có dầu có nhiệt độ tối ưu tương đối cao, khoảng 37 - 70 o C, và hoạt động hiệu quả trong môi trường kiềm Ion Ca 2+ thường làm tăng hoạt độ của lipase, trong khi ion Cu 2+ và Ni 2+ lại làm giảm hoạt độ này Tuy nhiên, nghiên cứu về ứng dụng của loại lipase này vẫn còn hạn chế.
Nghiên cứu về tính chất của một số loại hạt ngũ cốc cho thấy lipase từ đậu và hạt hướng dương có khả năng thủy phân dầu để sản xuất acid béo, trong khi lipase từ cám gạo được sử dụng như một phụ gia trong chất tẩy rửa Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng tập trung vào khả năng thủy phân chất béo trong quá trình bảo quản hạt giống.
Lipase từ các loại mủ như mủ xương rồng, mủ sung và mủ đu đủ đã được nghiên cứu và xác định đặc tính bởi nhiều tác giả quốc tế Các nghiên cứu cho thấy lipase thô từ mủ quả Babaco và Plumeria rubra có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân dầu hướng dương và phản ứng chuyển nhóm acyl Ngoài ra, lipase từ vỏ và hạt quả đu đủ cũng đã được thu nhận và ứng dụng trong phản ứng thủy phân và tổng hợp ester Gần đây, lipase từ mủ đu đủ đã thu hút nhiều sự chú ý trong nghiên cứu về đặc tính và ứng dụng, tuy nhiên, enzyme thu được chủ yếu vẫn ở dạng chế phẩm thô Năm 2011, Slim Abdelkafi đã chiết tách enzyme thủy phân từ mủ đu đủ và xác định rằng enzyme này thể hiện hoạt tính esterase hơn là lipase Mặc dù lipase thô được xem là loại "cố định" trong mủ, nhưng việc tách chiết lipase ra khỏi mủ đu đủ vẫn là một thách thức lớn cần được nghiên cứu thêm.
Bảng 1.2 Tính chất của lipase từ một số loại hạt chứa dầu Ngu ồ n nguyên li ệ u thu lipase pH opt
T o opt ( o C) Ch ấ t ho ạ t hóa Ch ấ t ứ c ch ế Cơ chấ t Tài li ệ u tham kh ả o
H ạ t h ạ nh nhân (Amygdalus communis L.) 8,5 65 Ca 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ ,
Co 2+ , và Ba 2+ Mg 2+ , Cu 2+ và Ni 2+ Dầu đậu nành
H ạ t nguy ệ t qu ế ( Laurus nobilis L ) 8,0 50 Ca 2+ , Co 2+ , Cu 2+ ,
Fe 2+ , Mg 2+ Dầu bay laurel Isbilir và c ộ ng s ự
Qu ả ô liu ( europaea Olea) 5 Ca 2+ Cu 2+ D ầ u oliu Panzanaro S, (2010) [89]
H ạ t óc chó ( Juglans regia L.) 9,0 70 Cu 2+ , Ca 2+ , Hg 2+ ,
Mn 2+ , Ni 2 + Dầu oliu Yesáim Yesáilog˘lu và cộ ng s ự (2010) [125]
(Theobroma cacao L.) 9,0 38 CaCl 2 1mM, MgCl 2
CuCl 2 , HgCl 2 , FeCl 3 , AlCl 3 , EDTA và DMSO acid stearic, oleic và palmitic Ezema và cộng sự (2012)
H ạt dƣa hấ u tr ắ ng
Lipase acid và lipase ki ề m
37 Ca 2+ Pb 2+ D ầ u oliu Ezema và cộng sự (2012)
H ạt đậ u ph ộ ng, qu ả óc chó, h ạ t h ạ nh nhân, v ừ ng 5,4 40
Dầu hướng dương, bí ngô, đậ u nành, bắp, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và vừng
Bảng 1.3 Tính chất của lipase từ một số loại hạt ngũ cốc
Ngu ồ n nguyên li ệ u thu lipase pH opt T o opt
Ch ấ t ứ c ch ế Cơ chấ t Ứ ng d ụ ng Tài li ệ u tham kh ả o
B ố n lo ạ i ngô (Zea mays): Local yellow
(LY), Western yellow (WY), Western white (WW), Popcorn (POP)
8 50 - D ầ u oliu Th ủ y phân d ầu đậ u ph ộ ng, dầu cọ, dầu đậu nành (hoạt độ cao nhất)
Eze Sabinus Onyebuchi và cộng sự (2007) [120]
EDTA - D ầ u oliu Gadge, P.P và c ộ ng s ự
Th ủy phân đặ c hi ệu cơ chấ t chuỗi dài và chuỗi trung bình
Morgana Karin Pierozan và cộng sự, (2011) [93] Đậ u castor ( Ricinus communis ), Ngô
( Zea mays ), h ạt hướng dương
- Dầu đậu nành Th ủ y phân các lo ạ i d ầ u khác nhau để sản xuất acid béo Kádima C Santos và cộng sự (2013) [107]
H ạ t y ế n m ạ ch ( oat seeds ) 7,0 p - NPP Đặc hiệu cao với monoacylglycerol có acid béo m ạ ch ng ắ n
Cám g ạ o (rice bran) 7,0 p-nitrophenyl acetate
H ạ t gi ố ng ( Pachira Aquatica) 5,4 40 - Dầu đậu tương
- Nước thải - Chất tẩy rửa
- Xử lý nước thải gia cầm
Patrícia Peres Polizell và cộng sự
- Bổ sung vào chất tẩy rửa P Kanmani và cộng sự
Bảng 1.4 Tính chất của lipase từ một số loại mủ
Ngu ồ n nguyên li ệ u pH opt T o opt
( o C) Ch ấ t ho ạ t hóa Ch ấ t ứ c ch ế Cơ chấ t Ứ ng d ụ ng Tài li ệ u tham kh ả o
V ỏ và h ạ t qu ả đu đủ 8,5 - 10,0 30-60 protease phenylmethanosulfony l fluorate (PMSF)
- Ester hóa với acid sterid
9 37 sodium taurodeoxycholate (NaTCD) và ch ấ t t ẩ y r ửa ion lƣỡ ng c ự c Chaps
Triton X100, sodium dodecyl sulfate (SDS) tetradecyl trimethylammonium bromide (TTAB)
M ủ qu ả sung ( Ficus carica L.) (Moracea)
5,5 45 Ca 2+ và Cu 2+ Fe 2+ , Mg 2+ , và Zn 2+
M ủ qu ả đu đủ (Carica papaya)
- chuyển ester c ủ a 2-propanoic acid ester
Houda Lazreg Aref và cộng sự (2014) [52]
8,5 60 - Dầu hạt bông Paula Di Santo Meztler và cộng sự [77]
1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng lipase thực vật
Mangos và cộng sự đã thành công trong việc ứng dụng CPL để tổng hợp triacylglycerol chuỗi ngắn và chuỗi dài có năng lượng thấp, phục vụ cho sản xuất sữa công thức cho trẻ sơ sinh Ngoài ra, CPL cũng được sử dụng để tạo ra triacylglycerol cấu trúc thông qua phản ứng chuyển ester giữa ethyl ester và tripalmitin từ năm 2001.
Năm 2009, Porntippa Pinyaphong và Suree Phutrakul từ đại học Thái Lan đã nghiên cứu tổng hợp bơ ca cao nhân tạo từ dầu cọ với sự xúc tác của CPL Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như chất cho nhóm acyl, tỷ lệ cơ chất, hàm lượng nước ban đầu của enzyme, thời gian và nhiệt độ phản ứng, cùng với lượng enzyme đều ảnh hưởng đến sản phẩm cuối Trong ba chất cho nhóm acyl được thử nghiệm, methyl stearate là lựa chọn tốt nhất cho việc tổng hợp bơ ca cao nhân tạo, với điều kiện phản ứng tối ưu được xác định.
Trong nghiên cứu, điều kiện tối ưu để thu hồi bơ ca cao nhân tạo được thực hiện ở nhiệt độ 45 độ C trong 4 giờ, với tỷ lệ cơ chất dầu cọ và methyl stearate là 1:4, lượng enzyme sử dụng đạt 18% và hoạt độ nước ban đầu là 0,11 Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi bơ ca cao đạt 55% so với lượng dầu cọ đã sử dụng.
Năm 2012, Weerasooriya và cộng sự đã chiết tách lipase kiềm từ hạt cao su, enzyme này được tinh sạch một phần và khảo sát đặc tính cũng như tiềm năng ứng dụng làm phụ gia trong chất tẩy rửa Lipase cho thấy khả năng tương thích với cả chất hoạt động bề mặt ion và không ion, cũng như chất oxy hóa và chất tẩy rửa thương mại Hoạt động của enzyme vẫn duy trì khi có mặt Triton X100 và Ca2+, nhưng giảm đáng kể khi có Tween 80, Tween 20 và SDS Lipase này hoạt động hiệu quả ở pH 8 và nhiệt độ 40°C, đồng thời ổn định đáng kể trong khoảng pH 8 đến 10 và ở nhiệt độ thấp 30°C.
Vào năm 2012, Carla Tecelão và cộng sự đã nghiên cứu việc sử dụng lipase mủ đu đủ làm chất xúc tác trong tổng hợp chất béo thay thế sữa mẹ (HMFS), nhằm đánh giá tiềm năng của CPL tự cố định như một chất xúc tác sinh học với chi phí thấp thay cho lipase thương mại Hai chế phẩm CPL khác nhau được chiết xuất và sử dụng làm chất xúc tác cho phản ứng thế gốc acid giữa tripalmitin và acid oleic hoặc omega-3 PUFA ở 60 độ C trong môi trường không có dung môi Sau 24 giờ, tỷ lệ mol acid oleic phản ứng đạt 22,1% khi sử dụng CPL I làm xúc tác.
Năm 2013, Matheus H.M Avelar và cộng sự đã chiết xuất lipase từ bột đậu castor (Ricinus communis L.) để thủy phân các loại dầu thực vật, đạt hiệu suất thu acid béo cao Dịch chiết enzyme cho thấy hoạt độ cao hơn trên dầu giàu acid linoleic và acid linolenic, như dầu đậu tương (86,1 ± 2,3 UI/g) và dầu hạt cải (81,3 ± 2,4 UI/g), so với dầu oliu (61,1 ± 4,5 UI/g) Quá trình thủy phân trong lò phản ứng có cánh khuấy đạt hiệu suất 88,2 ± 6,80% sau 3 giờ Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu cho thủy phân dầu hạt cải là không bổ sung CaCl2, ở 37,5 o C và tỷ lệ dầu : dung dịch đệm là 30 wt% Kết quả cho thấy việc sử dụng lipase từ hạt đậu castor để thủy phân dầu thực vật là khả thi và có ý nghĩa kinh tế trong sản xuất acid béo tự do từ triglycerides, một hợp chất quan trọng cho ngành công nghiệp hóa dầu.
Lipase thô từ thực vật, như lipase mủ đu đủ, đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm sản xuất bơ cacao nhân tạo, chất béo thay thế sữa mẹ, và bổ sung vào chất tẩy rửa Lipase từ hạt cao su và bột đậu cũng được sử dụng để thủy phân chất béo nhằm sản xuất acid béo Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của lipase thực vật, đặc biệt là từ mủ đu đủ Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào công bố về ứng dụng lipase thực vật trong thủy phân dầu cá, mở ra hướng nghiên cứu mới cho đề tài này.
1.4.2 Tình hình nghiên c ứu trong nướ c Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu và ứng dụng về lipase còn chƣa nhiều Nghiên cứu về lipase mới chỉ tập trung vào thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật, động vật Tuy nhiên, nghiên cứu lipase từ nguồn thực vật hầu nhƣ chƣa đƣợc quan tâm.
- Nghiên cứu về đặc tính của lipase
Năm 2008, Đinh Thị Vĩnh Hà đã nghiên cứu sự biến đổi hoạt độ lipase, protease và amylase của hạt đậu tương nảy mầm trong điều kiện thiếu nước Kết quả cho thấy, trong điều kiện đủ nước, hoạt độ lipase tăng dần từ ngày thứ nhất, đạt đỉnh vào ngày thứ ba, sau đó ổn định và giảm đến ngày thứ bảy Ngược lại, trong điều kiện thiếu nước, hoạt độ lipase cũng tăng từ ngày thứ nhất nhưng với tốc độ chậm hơn, đạt đỉnh vào ngày thứ năm và giảm xuống vào ngày thứ bảy.
Năm 2011, Trần Đăng Khoa và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính lipase từ chủng Bacillus subtilis OII (BS7), cho thấy lipase đạt hiệu suất cao nhất ở pH 7 và nồng độ dầu oliu 1,2% (w/w) sau 3 ngày nuôi cấy Chế phẩm lipase này có khả năng chịu kiềm tốt với pH tối ưu 10 và nhiệt độ tối ưu 60°C Ion Mg2+ và Ca2+ duy trì hoạt tính lipase, trong khi Zn2+, Cu2+ và SDS 0,2% làm giảm 95% hoạt tính này Khối lượng phân tử của lipase từ Bacillus được xác định khoảng 23,8 kDa.
- Nghiên cứu ứng dụng lipase
Năm 2004, tác giả Đặng Thị Thu cùng các cộng sự thuộc Đại học Bách Khoa