Nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi của bình vôi núi cao ( stephania brachyandra) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose bệnh tự kỷ

TỔNG QUAN

Tổng quan về tự kỷ

1.1.1 Định nghĩa và sơ lược về lịch sử nghiên cứu tự kỷ

Tự kỷ (Autism) có nguồn gốc từ từ Hy Lạp "Autos", có nghĩa là "Tự thân", phản ánh sự thu mình vào thế giới riêng và cách ly với thế giới bên ngoài Thuật ngữ này lần đầu tiên được Bleuler sử dụng để mô tả một triệu chứng cơ bản của bệnh tâm thần phân liệt, trong đó người bệnh thường mất đi khả năng giao tiếp và tương tác xã hội, thể hiện qua các biểu hiện như thu mình và khó khăn trong việc giao tiếp.

Lịch sử nghiên cứu tự kỷ bắt đầu từ năm 1943 với các công trình của hai bác sĩ tâm lý nổi bật là Leo Kanner từ Ukraina và Hans Asperger từ Áo, lần lượt vào năm 1943 và 1944.

Leo Kanner là người đầu tiên xác định tự kỷ như một rối loạn tâm thần học ở trẻ em, nhấn mạnh rằng mặc dù có những điểm tương đồng với bệnh tâm thần phân liệt, nhưng tự kỷ lại có nhiều khác biệt rõ rệt Ông đã mô tả nhóm trẻ này với các biểu hiện hành vi đặc trưng như thiếu quan hệ tình cảm, thói quen lặp đi lặp lại một cách kỳ lạ và tỉ mỉ, ngôn ngữ nói hạn chế hoặc khác thường, sự yêu thích xoay các đồ vật hình tròn, cùng với khả năng nhìn nhận không gian và trí nhớ vượt trội.

"vẹt", hình thức bên ngoài có vẻ hấp dẫn, nhanh nhẹn, thông minh và thường khởi phát sớm trước 3 tuổi [10], [39]

Một năm sau, bác sĩ nhi khoa người Áo Hans Asperger đã xác định một dạng tự kỷ đặc biệt mà sau này được gọi là hội chứng Asperger

Năm 1964, Bernard Rimland cùng một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng tự kỷ có thể xuất phát từ những thay đổi cấu trúc trong bán cầu não trái hoặc từ sự thay đổi sinh hóa và chuyển hóa ở trẻ em Điều này dẫn đến việc trẻ tự kỷ gặp khó khăn trong việc liên kết các kích thích với kinh nghiệm cá nhân, đồng thời thiếu khả năng giao tiếp do không thể khái quát hóa các thông tin cụ thể.

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) được nghiên cứu từ những năm 70 và 80 của thế kỷ XX Theo quan điểm hiện đại, tự kỷ cổ điển hay tự kỷ ấu thơ của Kanner được xếp vào một nhóm rộng hơn.

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) bao gồm nhiều loại, như rối loạn tự kỷ, hội chứng Asperger, rối loạn bất hoà nhập tuổi ấu thơ (CDD) và hội chứng Rett Tất cả các rối loạn này đều gây ra những khiếm khuyết trong chức năng giao tiếp, xã hội và khả năng tưởng tượng.

Ngày 02/04 hàng năm được Liên hợp quốc công nhận là Ngày nhận thức về tự kỷ thế giới từ năm 2008 Tự kỷ được định nghĩa là một khuyết tật phát triển suốt đời, ảnh hưởng đến khả năng giao tiếp và tương tác xã hội của cá nhân.

Trong ba năm đầu đời, rối loạn thần kinh có thể ảnh hưởng đến hoạt động của não bộ, dẫn đến tình trạng tự kỷ Tự kỷ không phân biệt giới tính, chủng tộc hay tình trạng kinh tế xã hội, và có thể xảy ra ở bất kỳ ai Những đặc trưng chính của tự kỷ bao gồm khiếm khuyết trong tương tác xã hội, giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, cùng với các hành vi, sở thích và hoạt động hạn chế, lặp đi lặp lại.

Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ trẻ em mắc Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) trên toàn cầu là 1 trên 160 trẻ, tuy nhiên con số này chỉ là trung bình và tỷ lệ mắc thực tế có thể khác nhau tùy theo từng nghiên cứu.

Tỷ lệ trẻ em mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) đang gia tăng nhanh chóng, theo báo cáo của Mạng lưới theo dõi khuyết tật tự kỉ và phát triển (ADDM) của CDC tại Mỹ Cụ thể, tỷ lệ ASD ở trẻ 8 tuổi đã tăng từ 1/150 vào năm 2000 lên 1/68 vào năm 2010, và đạt 1/54 vào năm 2016, tương ứng với mức tăng 178%.

Tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) đã tăng đáng kể so với năm 2000, với sự phổ biến cao hơn ở bé trai so với bé gái Cụ thể, tỷ số trẻ mắc tự kỷ giữa bé trai và bé gái dao động từ 3,4/1 đến 4,7/1.

Tại Việt Nam, hiện chưa có số liệu chính thức về tỷ lệ trẻ mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) Tuy nhiên, nghiên cứu của Trần Văn Công và Nguyễn Thị Hoàng Yến (2017) ước tính tỷ lệ trẻ mắc ASD dao động khoảng 0,5%.

Theo nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự (2019), tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) ở trẻ em tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam là 75,2 trên 10.000 trẻ Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trẻ em sống ở thành phố có xu hướng mắc ASD cao hơn so với trẻ em ở nông thôn, đồng thời tỷ lệ mắc ASD ở trẻ em Việt Nam có dấu hiệu gia tăng.

Phân loại theo thể lâm sàng

Theo thể lâm sàng, tự kỷ gồm có 5 thể như sau [2]:

1 Tự kỷ điển hình (tự kỷ Kanner): bao gồm các dấu hiệu bất thường trong những lĩnh vực: tương tác xã hội, chậm hoặc rối loạn ngôn ngữ giao tiếp, hành vi định hình cùng với những mối quan tâm bị thu hẹp, khởi phát trước 3 tuổi

2 Hội chứng Asperger (tự kỷ chức năng cao): có các dấu hiệu kém tương tác xã hội nhưng vẫn có quan hệ với người thân, có khả năng nói được nhưng cách giao tiếp bất thường, không chậm phát triển nhận thức Các dấu hiệu bất thường xuất hiện sau 3 tuổi

Tổng quan về dược liệu Bình vôi núi cao

1.2 Tổng quan về dƣợc liệu Bình vôi núi cao

1.2.1 Tên gọi, vị trí phân loại

Bình vôi núi cao (BVNC) còn có tên gọi khác là bình vôi nhị ngắn, thuộc chi

Stephania Lour – một chi lớn nằm trong họ Tiết dê (Menispermaceae), bộ Hoàng liên

Ranunculales là một phân lớp trong họ Hoàng liên (Ranunculidae), thuộc lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) và ngành Mộc lan (Magnoliophyta) Tên khoa học đầy đủ của loài này là Stephania brachyandra Diels, được công nhận vào năm 1910.

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Hình 1.1 Một số hình ảnh cây BVNC ( Stephania brachyandra Diels)

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam)

Theo Sách đỏ Việt Nam, Stephania brachyandra được mô tả như sau:

Dây leo nhỏ, sống lâu năm với rễ củ to và hình dạng bất định Thân dây leo dài từ 2-3m trở lên, nhẵn và có lá mọc so le với cuống lá dính vào phiến lá hình khiên Phiến lá có hình trứng nhọn hoặc gần giống hình tam giác tròn, kích thước từ 6-14 x 5-10 cm, với đầu nhọn và gốc bằng hoặc hơi lồi Gân chính dạng chân vịt xuất phát từ vị trí đính cuống lá Hoa đơn tính khác gốc, với cụm hoa cái gồm 7-9 xim tán nhỏ, cuống cụm hoa dài 2-3 cm và đầu hơi phồng Hoa có cuống rất ngắn, mọc sát nhau ở đầu cuống cụm hoa, nhỏ với 1 lá đài và 2 cánh hoa xếp cùng một bên; lá đài màu lục nhạt, hình mác rộng, cánh hoa hình trứng ngược, màu vàng cam, bầu hoa hình trứng.

Cây có 14 nhị, với 4-5 nhụy và dạng gai nhỏ Quả hình trứng, hơi dẹt, kích thước khoảng 0,7-0,8 x 0,6-0,7 cm Hạt có hình dạng ngược, dẹt, cụt đầu và có lỗ ở giữa; trên lưng hạt có 4 hàng gai ngắn giống như mũ đinh Hiện tại chưa quan sát thấy hoa đực.

BVNC là loại cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc chịu bóng nhẹ, thích hợp với khí hậu ẩm mát quanh năm Cây thường sinh trưởng trong rừng kín thường xanh, có thể là rừng nguyên sinh hoặc thứ sinh, ở độ cao từ 800 đến 2000m Thời gian ra hoa của cây là vào tháng 5, trong khi quả chín từ tháng 6 đến tháng 8 Vào đầu mùa xuân, cây phát triển chồi từ thân và cổ rễ Đặc biệt, sau khi bị chặt phá, cây vẫn có khả năng tái sinh BVNC có thể được trồng bằng hạt hoặc từ các cây con thu thập trong tự nhiên.

BVNC, một loài cây quý, phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và Mi-an-ma Tại Việt Nam, cây này được phát hiện ở một số khu vực như Lai Châu (Phong Thổ), Lào Cai (Sa Pa) và Sơn La.

Các loài thuộc chi Stephania đã được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, với alcaloid là thành phần chính và phổ biến nhất Ngoài alcaloid, các hợp chất flavonoid, lignan, steroid, terpenoid và coumarin cũng đã được phân lập Tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần hóa học của loài S brachyandra vẫn còn hạn chế.

Trên thế giới, Shulin và cộng sự đã phân lập được sinoacutin, stephanin, crebanin và L-dicentrin từ BVNC [57]

In Vietnam, the chemical composition of BVNC is detailed in the book "Medicinal Plants and Animal Remedies in Vietnam," which includes compounds such as L-tetrahydropalmatin, cepharantin, cycleanin, dehydrodicentrin, dicentrin, stephanin, and sinoacutin.

In 2010, Nguyễn Quốc Huy isolated 18 compounds from the BVNC plant collected in Sa Pa (Lào Cai), including six protoberberine compounds (L-tetrahydropalmatin, (-)-corypalmin, (-)-isocorypalmin, (-)-corydalmin, discretamin, and (-)-stepholidin), three fourth-degree alkaloids (palmatin, dehydrocorydalmin, and palmatrubin), three flavonoids (kaempferin, juglanin, and quercetin), and three triterpenoid compounds (euscaphic acid, maslinic acid, and arjunic acid), along with stepharin, orientalin, and isostephaoxocanin Among these, L-tetrahydropalmatin (L-THP) has been the most extensively studied for its potential in developing sedative and psychotropic medications.

L-tetrahydropalmatin (L-THP) thu được từ S brachyandra có hàm lượng khá cao khi so sánh với một số loài tham khảo

Năm 2010, tác giả Nguyễn Quốc Huy đã định lượng L-THP của 3 loài nghiên cứu:

Bảng 1 1 Kết quả định lƣợng L-THP [7]

Năm 2020, Đỗ Thị Hà và các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu định lượng một số mẫu bình vôi trồng tại Việt Nam, cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hàm lượng rotundin (L-THP) Đặc biệt, hai mẫu có hàm lượng rotundin cao nhất đều thuộc loài S brachyandra.

BVNC là một loài thực vật có nguồn gen hiếm tại Việt Nam, nổi bật với rễ củ chứa hoạt chất có tác dụng an thần và giảm đau So với các loài bình vôi khác, BVNC sở hữu hàm lượng hoạt chất cao hơn, mang lại giá trị dược liệu đáng chú ý.

Theo y học cổ truyền, BVNC có vị đắng chát và tính hàn, giúp thanh nhiệt, giải độc, thông kinh hoạt lạc, và tán ứ trấn thông Rễ củ của BVNC được sử dụng để điều trị các bệnh như loét dạ dày, hành tá tràng, thần kinh suy nhược, kinh nguyệt không đều, chấn thương, phong thấp đau nhức, và các triệu chứng liên quan đến tiết thũng độc và thấp chẩn.

L-tetrahydropalmatin (rotundin) là một hợp chất được sử dụng trong y học hiện đại với tác dụng an thần, gây ngủ và giảm đau Nó có hiệu quả trong việc điều trị các rối loạn tâm thần chức năng, giảm căng thẳng thần kinh và giúp cải thiện tình trạng mất ngủ dai dẳng do nguyên nhân tâm lý.

1.2.6 Tác dụng dược lý hướng thần kinh

Tìm kiếm trên các cơ sở dữ liệu như Pubmed và Google Scholar với từ khóa "Stephania brachyandra", "Bình vôi núi cao" và "Bình vôi nhị ngắn" cho thấy chưa có nghiên cứu cụ thể nào được thực hiện về các chủ đề này.

Loài bình vôi có 16 tác dụng dược lý, trong đó nổi bật là tác dụng hướng thần kinh Nhiều hoạt chất chiết xuất từ các loài thuộc chi Stephania Lour đã được nghiên cứu sâu về khả năng tác động đến hệ thần kinh.

Tetrahydropalmatin là alcaloid được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc chi

Stephania, có ái lực gắn cao với receptor α 1A -adrenergic và α 2A -adrenergic, D 1 , D 2 và

THP có tác dụng đối kháng trên các receptor D3 của dopamin và các receptor serotonin như 5-HT 1A, 5-HT 1D, 5-HT 4 và 5-HT 7 Tác dụng đối kháng của THP trên receptor dopamin giảm dần theo thứ tự D1, D2, D3 Bên cạnh đó, THP cũng đối kháng receptor α 1A -adrenergic, hoạt hóa receptor α 2A -adrenergic và là chất điều hòa dị lập thể dương tính của receptor GABA A Đặc biệt, THP có khả năng đối kháng tác dụng hoạt hóa của cocain trên các receptor serotonin, noradrenalin và dopamin, đồng thời tác động lên receptor 5-HT 1A và α-adrenergic giúp giảm nhẹ các tác dụng ngoại tháp.

[44] Sử dụng 10,0 mg/kg TT methamphetamin gây suy giảm khả năng duy trì trí nhớ không gian, nhưng sự suy giảm này có thể được phục hồi bằng L-THP [22]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Nguồn gốc: Bình vôi núi cao do khoa Tài Nguyên - Viện Dược liệu thu hái tại Sa

Pa (Lào Cai) và xác định tên khoa học Mẫu nghiên cứu được bảo lưu và bảo quản tại Phòng Tiêu bản - Khoa Tài Nguyên, Viện Dược Liệu

Quy trình chiết xuất dược liệu bao gồm các bước: sấy khô, xay thô, và ngâm với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng trong hai lần, mỗi lần kéo dài 5 ngày Sau đó, các dịch chiết được gộp lại và dung môi được thu hồi dưới áp suất giảm.

Cao chiết từ củ Bình vôi núi cao (Stephania brachyandra Diels) đạt hiệu suất 9,03% là sản phẩm của dự án FIRST, nghiên cứu về dược liệu có khả năng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ Dự án này, mang mã số 07/FIRST/1.a/NIMM, được thực hiện trong giai đoạn 2017-2019 dưới sự dẫn dắt của PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng tại Viện Dược liệu.

2.1.2 Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu

Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) được sử dụng trong các thí nghiệm do GS Masamitsu Yamaguchi từ Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản cung cấp, bao gồm hai chủng là Rugose và Canton-S.

+ Chủng Rugose là chủng ruồi giấm mang gen rugose bị đột biến với mã số

FBal0138152 được sử dụng làm mô hình bệnh tự kỷ

+ Chủng ruồi giấm hoang dại Canton-S với mã số FBst0064349 được sử dụng làm nhóm chứng sinh lý

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

⁕ Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2 1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

8 N-amyl acetat Wako, Nhật Bản

12 Sữa bột nguyên kem Việt Nam

⁕ Dụng cụ, thiết bị: Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong bảng 2.2

Bảng 2 2 Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu

STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc

1 Buồng tam giác và kính Việt Nam

2 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung

3 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ

4 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng

6 Đĩa petri 90 mm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ

7 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản

8 Kính hiển vi soi nổi Olympus, Nhật Bản

9 Lò vi sóng Electrolux, Thụy Điển

11 Máy quay phim Canon, Nhật Bản

13 Miếng lót mềm Việt Nam

14 Ống chứa mùi Corning, Mỹ

16 Hệ thống theo dõi nhịp sinh học trên ruồi giấm Trikinetic, Mỹ

17 Một số dụng cụ, thiết bị khác

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình chuẩn bị ruồi giấm phục vụ nghiên cứu

2.2.1.1 Nhân dòng ruồi giấm và chia lô thí nghiệm

Tiến hành lai giữa các cặp ruồi bố mẹ chủng Rugose với tỷ lệ đực cái 1:1 nhằm tạo ra dòng ruồi tự kỷ, đồng thời sử dụng chủng Canton-S để phát triển dòng ruồi đối chứng sinh lý.

Môi trường thức ăn cơ bản cho ruồi giấm bao gồm các thành phần sau: đường saccarose (5 % w/v), nấm men (5 % w/v), sữa bột (3 % w/v), agar (1 % w/v), acid propionic (0.5 % v/v), natri benzoat 10% (1 % v/v)

Thức ăn cho ruồi được thay đổi mỗi 3 ngày để đảm bảo cung cấp đủ dinh dưỡng cho ruồi trong suốt quá trình thí nghiệm Ruồi giấm được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với nhiệt độ 25 ± 1 o C, độ ẩm 50%, và chu kỳ ánh sáng 12 giờ sáng - 12 giờ tối, bắt đầu từ 07 giờ sáng.

19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ)

- Lô sinh lý: ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản

- Lô bệnh lý: ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản

 Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản kết hợp BVNC nồng độ 2mg/ml

 Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản kết hợp BVNC nồng độ 4mg/ml

2.2.1.2 Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu

Ruồi bố mẹ được chuyển vào ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu để đẻ trứng trong khoảng 2-3 ngày Sau khi ruồi đẻ trứng, toàn bộ ruồi bố mẹ sẽ được lấy ra khỏi ống Trứng sau đó sẽ phát triển thành ấu trùng, và chúng tôi sẽ thu thập ấu trùng ở giai đoạn ba (third-instar) để phục vụ cho thí nghiệm.

+ Đối với ruồi trưởng thành:

Ruồi bố mẹ được chuyển vào ống thức ăn có mẫu nghiên cứu để đẻ trứng trong 2-3 ngày Sau đó, ruồi bố mẹ sẽ được lấy ra khỏi ống Ấu trùng sẽ nở và đóng kén trong khoảng 6-8 ngày Theo dõi ngày nở của kén để thu thập cá thể ruồi F1 mới nở, sau đó chuyển chúng sang ống thức ăn mới có mẫu nghiên cứu Các cá thể ruồi F1 này sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tại các thời điểm thích hợp.

2.2.2.1 Thử nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng (social space assay)

Khả năng hình thành cộng đồng và tương tác xã hội là yếu tố quan trọng trong việc đánh giá mức độ bệnh tự kỷ Dựa trên mô hình đánh giá của Simon và cộng sự (2012), chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng cải thiện khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm mang bệnh tự kỷ khi sử dụng cao chiết cồn BVNC Mục tiêu là đánh giá hiệu quả cải thiện hành vi của đối tượng nghiên cứu này.

Thử nghiệm hành vi tương tác cộng đồng Thử nghiệm hành vi trí nhớ ngắn hạn Đánh giá hành vi vận động

Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học

Thử nghiệm được thiết kế như sau:

Buồng đánh giá có hình dạng tam giác cân bằng, làm từ nhựa dày 0,5cm, với cạnh đáy dài 15,3cm và chiều cao tương ứng Buồng này được đậy kín bằng hai tấm kính kích thước 18cm x 18cm, tạo điều kiện cho ruồi hoạt động trong không gian hai chiều.

Hình 2 1 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng của ruồi giấm [62]

Hình ảnh thực tế của buồng đánh giá hình tam giác (bên trái) và kích thước của buồng (bên phải) cho thấy sự tương tác cộng đồng được biểu thị qua khoảng cách ngắn nhất tới các cá thể xung quanh.

Ruồi mới nở được phân loại theo giới tính và được chuyển vào các ống chứa thức ăn chuẩn với khoảng 40 con mỗi ống, nuôi trong 3-4 ngày Sau khi gây mê, ruồi được đặt vào buồng tam giác kín bằng hai phiến kính và để yên trong 15 phút Tiến hành đập nhẹ buồng thí nghiệm xuống bàn ba lần để đảm bảo tất cả ruồi xuất phát đồng thời từ đáy buồng Sau đó, cho ruồi tự do vận động và tương tác trong buồng trong 20 phút trước khi chụp ảnh và phân tích kết quả Quá trình này được lặp lại 8 lần cho mỗi nhóm.

Chỉ số đánh giá là khoảng cách của mỗi con ruồi tới con ruồi gần nó nhất

2.2.2.2 Thử nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm (odor - taste learning)

Mô hình đánh giá khả năng ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm là một phương pháp quan trọng để kiểm tra khả năng nhớ ngắn hạn của Drosophila ASD.

Thử nghiệm được thiết kế như sau:

1 Chuẩn bị môi trường thạch:

- Đĩa petri X chứa 1,5 % thạch agar và đường sucrose 2M

- Đĩa petri Y chứa 1,5 % thạch agar và không có đường

- Lấy 10 àl dung dịch mựi octanol cho vào ống đựng mựi Đặt là mựi OCT

- Pha loóng dung dịch mựi n-amyl acetat với parafin (1:50), lấy 10àl dịch pha loãng này cho vào các ống mùi còn lại Đặt là mùi AM

- Đánh dấu các ống để phân biệt 2 mùi

- Lựa chọn 24 ấu trùng 3-5 ngày tuổi còn ở dưới thức ăn, rửa sạch thức ăn còn bám trên ấu trùng

- Đặt ống đựng mùi AM (n-amyl acetat) lên đĩa X, đậy nắp để yên trong 1 phút

- Lấy những ấu trùng đã rửa sạch ở trên cho vào đĩa X, cho chúng làm quen với mùi AM và môi trường đĩa X có đường trong thạch trong 5 phút

- Đến phút thứ 4 của quá trình trên, đặt ống đựng mùi OCT (mùi còn lại) vào đĩa

Y, đậy nắp để yên trong 1 phút

- Sau khi hết 5 phút, chuyển các ấu trùng ở đĩa X sang đĩa Y, cho chúng làm quen với mùi OCT và đĩa Y không có đường trong thạch trong 5 phút

- Lặp lại quá trình trên 3 lần

Vào phút thứ 4 của bước tập luyện cuối cùng, hãy đặt ống mùi vào 3 đĩa test Đặt mùi AM ở một bên của đĩa test (theo vạch đã kẻ sẵn ở giữa) và mùi OCT ở bên còn lại Sau đó, đậy nắp và để yên trong 1 phút.

- Sau khi hết 5 phút của bước tập luyện cuối cùng, lần lượt chuyển 8 ấu trùng lên từng đĩa test và tiến hành kiểm tra trong 3 phút

- Sau khi hết thời gian kiểm tra, đếm số ấu trùng ở 2 bên, phía mùi AM và OCT, ghi nhận kết quả

Quá trình được thực hiện nhiều lần nhằm giảm thiểu sai số, kết hợp mùi AM với đĩa X và mùi OCT với đĩa Y Ở lần tiếp theo, sẽ tiến hành hoán đổi, sử dụng mùi OCT với đĩa X và mùi AM với đĩa Y.

- Các ấu trùng khi cho vào đĩa thạch, được đặt vào khoảng chính giữa đĩa thạch đã kẻ từ trước

Hình 2 2 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm

Kết quả được tính theo chỉ số PREF AM , PREF OCT và LI

PREF AM là chỉ số ưu tiên của mùi AM, được xác định thông qua các thí nghiệm kết hợp mùi AM với phần thưởng Chỉ số này giúp đo lường tỷ lệ ấu trùng ghi nhớ mùi và khả năng di chuyển về phía nguồn mùi đó.

PREF OCT là chỉ số ưu tiên của mùi OCT, được xác định thông qua các thí nghiệm trong đó mùi OCT được kết hợp với phần thưởng Mục tiêu của các thí nghiệm này là đo lường tỷ lệ ghi nhớ mùi và sự hướng về phía mùi OCT.

- LI là chỉ số học tập (Learning Index)

+ LI > 0 cho thấy ấu trùng có khả năng học tập hay ghi nhớ

+ LI ~0 cho thấy ấu trùng không có khả năng học tập hay ghi nhớ

+LI < 0 cho thấy mùi gây khó chịu cho ruồi giấm

2.2.2.3 Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm (crawling assay)

Dựa trên nghiên cứu của Nichols và cộng sự năm 2012, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm, với mục tiêu chính là khảo sát sự cải thiện khả năng vận động của cao chiết BVNC.

Thử nghiệm được tiến hành như sau:

- Chuẩn bị đĩa petri đường kính 10-12cm, làm sạch

- Đổ thạch Agar 1,2 % lên đĩa, bề mặt láng đều, để ráo nước trước khi thí nghiệm

Thu ấu trùng bậc 3, khoảng 5 ngày tuổi, nằm trong môi trường thức ăn cách bề mặt 1-2cm, đang bò ổn định với kích thước đồng đều Để lựa chọn ấu trùng đực, cần soi bộ phận sinh dục của chúng dưới kính hiển vi.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ

Sự suy giảm khả năng hoạt động cộng đồng và tương tác xã hội là dấu hiệu chính để nhận diện bệnh lý tự kỷ Do đó, mô hình tương tác cộng đồng là tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả của thuốc điều trị tự kỷ Thử nghiệm được thực hiện trên ruồi giấm trưởng thành 3 ngày tuổi và tiến hành đồng thời trên các lô ruồi khác nhau, với kết quả được trình bày trong Hình 3.1.

Khoảng cách tới con gần nhất (cm)

Hình 3 1 Thử nghiệm hành vi tương tác cộng đồng trên ruồi giấm trưởng thành

A) Hình ảnh phân bố của quần thể ruồi trong không gian B) Kết quả phân tích khoảng cách tương tác không gian của ruồi giấm ở các lô khác nhau N`0-650 cá thể/lô

** p < 0,01; *** p < 0,001 so sánh với lô chứng bệnh lý (Rugose)

 Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.

 Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ.

Ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ được nghiên cứu thông qua các lô thử BVNC 2 và BVNC 4, trong đó cao BVNC được áp dụng ở nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml để điều trị.

Kết quả từ Hình 3.1 cho thấy khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể ruồi giấm đột biến gen rugose (Rugose) lớn hơn so với ruồi giấm chủng hoang dại (Canton-S), với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Trong Hình A, các cá thể thuộc nhóm Rugose phân tán riêng lẻ trong không gian, ít di chuyển thành từng đám như nhóm chứng sinh lý (Canton-S) Sau khi điều trị bằng cao BVNC ở nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml, các lô ruồi đột biến gen rugose cũng cho thấy khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể.

29 cá thể giảm đáng kể so với lô chứng bệnh lý, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê tương ứng với p < 0,01 và p < 0,001.

Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ

Thử nghiệm học tập của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ dựa trên mùi vị nhằm đánh giá khả năng ghi nhớ Quá trình thí nghiệm được chia thành hai giai đoạn: luyện tập và kiểm tra Kết quả được đánh giá thông qua chỉ số học tập LI và được thể hiện trong Hình 3.2, bao gồm 4 nhóm khác nhau.

Hình 3 2 Kết quả đánh giá chỉ số học tập (LI)

A) Giá trị PREF AM khi AM kết hợp với phần thưởng B) Giá trị PREF OCT khi OCT kết hợp với phần thưởng C) Chỉ số học tập LI được tính theo giá trị PREF AM và PREF OCT , được biểu diễn bằng biểu đồ box-and-whisker plot (n ~ 200) * p < 0.05 so với lô chứng bệnh lý

 Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.

 Rugose: ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ.

 BVNC (mg/ml): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ được điều trị bằng cao BVNC ở các nồng độ tương ứng

Kết quả nghiên cứu cho thấy lô chứng bệnh lý có điểm học tập LI thấp hơn lô chứng sinh lý, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Ngoài ra, ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose được sử dụng BVNC ở nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml cho điểm học tập LI cao hơn lô ruồi bệnh lý không được điều trị, với sự khác biệt cũng đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động trên ấu trùng ruồi giấm bậc ba và ruồi giấm tự kỷ trưởng thành mang gen đột biến rugose

3.3.1 Kết quả đánh giá khả năng khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm (crawling assay) Đánh giá khả năng vận động của ấu trùng bậc ba, chúng tôi tiến hành thử nghiệm hành vi di chuyển theo công bố của Nichols và cộng sự (2012) Thử nghiệm được thực hiện bằng cách đo quãng đường di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trong 45 giây, qua đó tính được vận tốc trung bình của ấu trùng ruồi giấm Tiến hành so sánh tốc độ di chuyển của ấu trùng giữa 4 lô bằng One-way ANOVA Kết quả được thể hiện trong

Hình 3 3 Hình ảnh đường đi của ấu trùng ruồi giấm bậc ba sau khi phân tích qua phần mềm Image-J

Hình 3 4 Kết quả phân tích tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm bậc ba

* p < 0,05; ** p < 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý (Rugose) N5-45 cá thể/lô

 Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.

 Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ, không được điều trị với BVNC.

Ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ được thử nghiệm điều trị bằng cao BVNC với nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml Các lô thử BVNC 2 và BVNC 4 cho thấy hiệu quả trong việc điều trị tình trạng này.

Tốc độ trung bình (cm/s)

Kết quả nghiên cứu cho thấy lô ấu trùng ruồi giấm bệnh lý (Rugose) di chuyển chậm hơn lô chứng sinh lý (Canton-S) khoảng 14% với ý nghĩa thống kê p < 0,05 Mặc dù lô ấu trùng được điều trị bằng cao chiết cồn BVNC nồng độ 2mg/ml có tốc độ bò cải thiện, nhưng sự khác biệt so với lô bệnh lý không có ý nghĩa thống kê Ngược lại, tốc độ bò ở ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose được điều trị bằng cao chiết cồn BVNC nồng độ 4mg/ml lại cao hơn đáng kể.

19 % so với lô bệnh lý, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01

3.3.2 Kết quả đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay) Để đánh giá sự thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm, bao gồm tổng thời gian hoạt động trong ngày, thời gian thức và ngủ; chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng máy theo dõi hoạt động thức ngủ Trikinetics trong 7 ngày Tần suất hoạt động của ruồi tại mỗi khoảng thời gian được ghi nhận là số lần ruồi di chuyển qua đèn laser cảm biến Kết quả được thể hiện trong Hình 3.5 và Hình 3.6

Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm được thể hiện qua hình 3.5, trong đó trục hoành biểu thị các mốc thời gian trong một ngày, còn trục tung thể hiện số lần vận động của ruồi.

 Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.

 Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ, không được điều trị với BVNC.

Rugose + BVNC 2mg/ml và Rugose + BVNC 4mg/ml là các lô thử nghiệm sử dụng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ, được điều trị bằng cao BVNC với các nồng độ tương ứng 2mg/ml và 4mg/ml.

Số lần vận động Đỉnh hoạt động ban đêm Đỉnh hoạt động ban ngày

CantonS Rugose Rugose + BVNC 2mg/ml Rugose + BVNC 4mg/ml

Hình 3 6 Kết quả phân tích tổng số lần vận động trong thời gian 7 ngày

* p < 0,05; ** p < 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý (Rugose)

 CantonS (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.

 Rugose : ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ.

BVNC 2mg/ml và BVNC 4mg/ml là các lô thử được sử dụng để điều trị ruồi giấm đột biến gen rugose mắc bệnh tự kỷ, với các nồng độ tương ứng là 2mg/ml và 4mg/ml.

Kết quả xác định nhịp sinh học cho thấy cường độ hoạt động của bốn nhóm ruồi có sự lặp lại rõ rệt giữa các ngày theo dõi Ruồi chủ yếu hoạt động vào hai thời điểm trong ngày, với hai đỉnh cường độ hoạt động cao nhất: từ 6h-8h là đỉnh hoạt động ban ngày và từ 18h-20h là đỉnh hoạt động ban đêm.

Kết quả nghiên cứu cho thấy ruồi giấm đột biến gen có tổng số lần hoạt động trong 7 ngày thấp hơn so với ruồi giấm hoang dại, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p