Nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh của một số dược liệu trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro

TỔNG QUAN

Tổng quan về đột quỵ não

1.1.1 Định nghĩa Đột quỵ là một bệnh lý mạch máu và được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) định nghĩa là một hội chứng lâm sàng bao gồm: “Các dấu hiệu rối loạn chức năng của não (khu trú hoặc toàn thể) phát triển nhanh, kéo dài trên 24 giờ hoặc dẫn đến tử vong, không xác định được nguyên nhân nào khác ngoài căn nguyên mạch máu”

Theo cơ chế bệnh sinh đột quỵ có thể chia thành hai thể chính:

Thiếu máu cục bộ (Ischemic stroke)

Đột quỵ xảy ra khi một động mạch cung cấp máu cho một phần não bị tắc nghẽn, dẫn đến rối loạn chức năng nhu mô não Có bốn nguyên nhân chính gây ra tình trạng này: huyết khối, thuyên tắc mạch, giảm tưới máu toàn thân và huyết khối xoang tĩnh mạch não Đặc biệt, đột quỵ không xác định nguồn gốc, được gọi là Cryptogenic, chiếm từ 30-40% các trường hợp đột quỵ thiếu máu cục bộ.

Xuất huyết não xảy ra khi một động mạch trong não bị rò rỉ hoặc vỡ, dẫn đến máu tràn ra và tăng áp lực, gây hủy hoại tế bào não Hai nguyên nhân chính gây ra tình trạng này là huyết áp cao và chứng phình mạch, làm giãn và vỡ mạch máu Xuất huyết não được chia thành hai loại: xuất huyết nội sọ và xuất huyết dưới màng nhện.

Cơn thiếu máu não cục bộ thoáng qua (TIA - Transient ischemic attack)

Cơn thiếu máu não tạm thời (TIA) có triệu chứng lâm sàng tương tự như đột quỵ, nhưng tình trạng chảy máu thường được ngăn chặn trong vòng 5 phút TIA được xem là dấu hiệu cảnh báo quan trọng của đột quỵ, với hơn 30% người trải qua TIA mà không được điều trị sẽ gặp phải đột quỵ nghiêm trọng trong vòng 1 năm.

Yếu tố nguy cơ của đột quỵ thiếu máu cục bộ được phân thành hai loại: yếu tố không thay đổi được và yếu tố có thể thay đổi hoặc điều trị Các yếu tố không thay đổi được bao gồm tuổi tác, giới tính, di truyền, chủng tộc và tiền sử bệnh.

Nguy cơ mắc đột quỵ tăng gấp đôi cứ mỗi 10 năm đối với người lớn trên 55 tuổi, với người Mỹ gốc Phi, người châu Á, người Mỹ gốc Latinh và Tây Ban Nha có nguy cơ tử vong cao hơn so với người da trắng cùng độ tuổi Các yếu tố nguy cơ có thể thay đổi hoặc điều trị của đột quỵ thiếu máu cục bộ bao gồm tăng huyết áp, hút thuốc lá, đái tháo đường, tăng cholesterol, thiếu vận động, béo phì, cơn thiếu máu não cục bộ thoáng qua, tiêu thụ rượu quá mức, bệnh động mạch cảnh, động mạch ngoại biên và các bệnh tim mạch khác.

Đột quỵ thiếu máu não cục bộ

1.2.1 Đặc điểm phân bố các động mạch não

Não được cung cấp máu bởi hai hệ thống động mạch chính: động mạch cảnh trong và động mạch sống - nền Hệ động mạch cảnh trong cung cấp máu cho khoảng 2/3 phần trước của bán cầu đại não và chia thành bốn nhánh: động mạch não trước, động mạch não giữa, động mạch thông sau và động mạch mạch mạc trước Mỗi động mạch não lại chia thành hai loại nhánh: nhánh nông cấp máu cho vỏ não và nhánh sâu đi vào trong não Trong khi đó, hệ động mạch sống - nền cung cấp máu cho thân não, tiểu não, mặt dưới thùy thái dương và thùy chẩm Hai hệ thống động mạch này liên kết với nhau qua đa giác Willis.

1.2.2 Đặc điểm sinh lý tuần hoàn và chuyển hóa ở não

Lưu lượng tuần hoàn não ở người lớn trung bình là 49,8 ± 5,4 ml/100 g não/phút, trong đó chất xám đạt 79,7 - 10,7 ml/100 g não/phút và chất trắng là 20,5 ± 2,5 ml/100 g não/phút Thể tích máu não dao động từ 4 – 5 ml/100 g, với thời gian chuyển máu trung bình khoảng 3,2 - 3,5 giây Ở trẻ em, lưu lượng tuần hoàn não thường lớn hơn so với người lớn, trong khi từ 60 tuổi trở đi, lưu lượng này giảm nhanh chóng.

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh thiếu máu não cục bộ

Não chỉ chiếm 2% khối lượng cơ thể nhưng tiêu thụ đến 20% tổng lượng oxy, cho thấy sự quan trọng của nó trong việc duy trì chức năng sống Cơ chế bệnh sinh của thiếu máu não cục bộ rất phức tạp, liên quan đến nhiều quá trình như cạn kiệt năng lượng tế bào do giảm tưới máu, nhiễm độc kích thích, stress oxy hóa, và tổn thương hàng rào máu não Những yếu tố này dẫn đến tổn thương vi mạch, kích hoạt cầm máu, viêm và cuối cùng là cái chết của các tế bào thần kinh, tế bào thần kinh đệm và tế bào nội mô Mức độ tổn thương vĩnh viễn sẽ phụ thuộc vào mức độ và thời gian thiếu máu não.

1.2.3.1 Vùng lõi thiếu máu và vùng penumbra (vùng tranh tối tranh sáng)

Trong thiếu máu não cục bộ, vùng não bị giảm lưu lượng máu nghiêm trọng dưới 1 ml/g/phút được gọi là vùng lõi thiếu máu, nơi các tế bào chết nhanh chóng do phân giải lipid, protein và cạn kiệt năng lượng Bên cạnh đó, vùng penumbra là khu vực có lưu lượng máu từ 2-4 ml/g/phút, nơi chức năng bị giảm nhưng cấu trúc vẫn còn nguyên vẹn Các tế bào ở vùng penumbra sẽ chết theo lập trình sau vài giờ hoặc vài ngày từ khi khởi phát thiếu máu não cục bộ, do đó, hồi phục chức năng của tế bào thần kinh ở đây có thể cải thiện tổn thương và hậu quả do thiếu máu cục bộ gây ra.

1.2.3.2 Ảnh hưởng của thiếu máu não cục bộ ở cấp độ tế bào

Sự giảm đột ngột oxy và glucose ngăn chặn sản xuất ATP, ảnh hưởng nghiêm trọng đến các quá trình phụ thuộc năng lượng của mô và dẫn đến tổn thương tế bào Tế bào thần kinh cần oxy và glucose ổn định để duy trì dòng ion qua màng tế bào, và chúng rất dễ bị tổn thương khi có sự thay đổi nồng độ oxy trong máu Các cơ chế liên quan đến tổn thương mô và bảo vệ thần kinh trong trường hợp thiếu máu não cục bộ bao gồm nhiều yếu tố khác nhau.

Cạn kiệt năng lượng do suy ty thể

Thiếu máu não cục bộ gây ra sự mất mát kali và ATP, hai thành phần thiết yếu cho quá trình trao đổi năng lượng Mặc dù cạn kiệt năng lượng không gây chết tế bào ngay lập tức, nhưng sau 5 - 10 phút tắc nghẽn, có thể dẫn đến tổn thương không thể phục hồi Hơn nữa, tắc nghẽn một phần động mạch kéo dài cũng có thể gây ra những tác động nghiêm trọng do suy giảm dòng gradient ion và sản xuất các chất thải từ quá trình chuyển hóa kỵ khí như acid lactic và ion hydro.

Mất chức năng bơm ion màng

Khi dòng máu giảm, các bơm ion phụ thuộc năng lượng mất chức năng, gây ra sự mất K+ và sự trao đổi với Na+, Cl-, Ca2+, dẫn đến phù tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm Sự gia tăng Ca2+ trong tế bào kích hoạt các enzyme như protease, kinase, lipase và endonuclease, dẫn đến quá trình chết tế bào theo lập trình (apoptosis).

Giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh kích thích:

Glutamat được giải phóng từ tế bào chết và tích tụ ở môi trường ngoại bào, gây ra sự kích thích quá mức các thụ thể AMPA, NMDA và kainit, cho phép dòng Na+ đi vào tế bào.

Khi Ca 2+ xâm nhập vào tế bào, nó gây rối loạn hoạt động của nhiều enzym như protease, lipase và nuclease Sự hoạt động của các enzym này và các sản phẩm chuyển hóa của chúng, bao gồm các gốc oxy tự do, dẫn đến tổn thương màng tế bào, vật liệu di truyền và protein cấu trúc của neuron, cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào.

Protein liên kết synaptosomal (SNAP-25)

SNAP-25 là một protein thần kinh quan trọng, nằm ở đầu sợi thần kinh và có vai trò trong việc giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh Nghiên cứu cho thấy nồng độ mARN của SNAP-25 tăng cao tại vùng lõi thiếu máu và vùng penumbra, đặc biệt là vào ngày thứ 6 sau khi xảy ra thiếu máu não cục bộ.

Sản xuất các gốc tự do và các loại oxy hoạt động khác

Các gốc tự do như anion superoxid, gốc hydroxyl và nitric oxid (NO) xuất hiện trong tổn thương do đột quỵ, với sự gia tăng sản xuất đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu lâm sàng Chúng tương tác với ADN, protein và lipid, gây ra tổn thương và rối loạn chức năng ở nhiều mức độ Cả gốc oxy hoạt động và nitơ phản ứng đều tham gia vào các con đường gây chết tế bào sau đột quỵ thông qua cơ chế apoptosis và viêm.

Chết tế bào theo lập trình (Apoptosis)

Khác với necrosis, apoptosis là quá trình gây chết tế bào thần kinh ngoại biên Tổn thương do thiếu máu não cục bộ kích hoạt các phản ứng sớm trong biểu hiện gen của Bcl-2 và p53, dẫn đến sự giải phóng các phân tử tiền apoptosis như cytochrom c và yếu tố gây ra apoptosis từ ty thể.

Dòng thác thiếu máu não cục bộ kích hoạt nhiều cơ chế bảo vệ nhằm chống lại apoptosis và necrosis Các chất tham gia vào cơ chế bảo vệ này bao gồm protein sốc nhiệt HSP 70, gen Bcl-2 và Interleukin-10.

1.2.3.3 Phù não và các ảnh hưởng trong đột quỵ thiếu máu não cục bộ

Phù là nguyên nhân chính gây ra nhiều trường hợp tử vong và khuyết tật trong đột quỵ thiếu máu cục bộ Hiện nay, phù được phân loại thành hai loại khác nhau.

Phù do nhiễm độc tế bào là tình trạng diễn ra nhanh chóng, trong vài phút đến vài giờ, và có thể hồi phục khi hàng rào máu não còn nguyên vẹn Tình trạng này được đặc trưng bởi sự phù nề của tế bào thần kinh, tế bào thần kinh đệm và tế bào nội mô, do sự suy giảm trong quá trình vận chuyển ion, đặc biệt là natri (Na+).

Ca 2+ ) phụ thuộc ATP cũng như sản xuất gốc tự do

Tổng quan về một số loại dược liệu

1.3.1 Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis )

Hình 1.2 Hình ảnh toàn cây, hoa, quả tươi và quả khô dành dành [10]

Dành dành, có tên khoa học là Gardenia jasminoides Ellis, là một loại cây bụi nhỏ thuộc họ Cà phê (Rubiace) Cây có cành màu nâu nhẵn, lá mọc đối hoặc vòng 3, hình trái xoan với đầu tù hoặc hơi nhọn Hoa của cây lớn, mọc đơn độc ở đầu cành, có màu trắng hoặc trắng ngà và rất thơm Quả hình trứng hoặc hình bầu dục với 6-9 góc, có đài tồn tại ở đỉnh và cạnh lồi có cánh, khi chín có màu vàng và thịt quả màu vàng cam, hạt rất nhiều, dẹt, có mùi thơm và vị đắng Dành dành được tìm thấy lần đầu tiên ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản.

Dành dành, một loại cây phổ biến ở Việt Nam, chủ yếu phân bố tại vùng đồng bằng và trung du Cây này chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng như iridoid glycosid, flavonoid, sắc tố vàng gardenia, triterpen và acid hữu cơ, góp phần vào các tác dụng sinh học của nó.

Theo y học cổ truyền, dành dành có vị đắng và tính hàn, tác động lên các kinh: tâm, phế, tam tiêu, với công dụng tả hỏa, trừ phiền, thanh nhiệt, lợi tiểu, lương huyết giải độc, và loại bỏ cục máu đông để thúc đẩy lưu thông máu Nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro đã chỉ ra các tác dụng dược lý của dịch chiết quả dành dành, bao gồm chống viêm, chống trầm cảm, bảo vệ gan, cùng với các lợi ích cho hệ thần kinh, tim mạch và tiêu hóa Dành dành cũng được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền.

Yueju Wan và Zhi-Zi-Hou-Pu Tang được sử dụng để điều trị các rối loạn tâm thần như khó chịu, lo âu và trầm cảm thông qua việc tăng cường yếu tố dinh dưỡng thần kinh từ não Iridoid glycosid là thành phần chính có hoạt tính sinh học, giúp điều trị tổn thương do thiếu máu cục bộ não nhờ vào khả năng chống oxy hóa và ngăn ngừa chết tế bào thần kinh Bên cạnh đó, các hợp chất bay hơi cũng đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy học tập và ghi nhớ, trong khi glycoprotein và saponin toàn phần thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh Nghiên cứu về dành dành cho thấy tiềm năng cải thiện tình trạng thiếu máu não cục bộ mạn tính nhờ vào tác dụng dược lý của nhiều thành phần khác nhau.

Dịch chiết dành dành và các thành phần của nó đã được nghiên cứu về tác dụng bảo vệ thần kinh và cải thiện trí nhớ, đặc biệt trong các mô hình thiếu máu não cục bộ mạn tính Geniposid, một hợp chất có trong dịch chiết này, cho thấy tiềm năng trong việc điều trị bệnh Parkinson, giảm triệu chứng trầm cảm và hạn chế các chấn thương não ở chuột.

Dành dành có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh ở vỏ não và hồi hải mã trong mô hình đột quỵ thiếu máu cục bộ, chủ yếu nhờ vào khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa gốc tự do, giảm độc tính của nitric oxide (NO) và giảm hoạt động của acetylcholinesterase Mặc dù nhiều nghiên cứu hiện nay chỉ tập trung vào tác dụng của các thành phần riêng lẻ như geniposid, nhưng cơ chế bệnh sinh của thiếu máu cục bộ não rất phức tạp Dịch chiết từ dành dành chứa nhiều thành phần có hoạt tính, do đó, tác dụng bảo vệ thần kinh của nó có thể là kết quả của nhiều cơ chế khác nhau.

15 trị hơn khi khám phá các ứng dụng trong điều trị thiếu máu não cục bộ mạn tính trên dịch chiết dành dành toàn phần [50]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của một số iridoid glycosid [50]

1.3.2 Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F H Chen )

Hình 1.4 Hình ảnh toàn cây, hoa và củ của tam thất [41]

Tam thất có tên khoa học là Panax notoginseng (Burk.) F H Chen thuộc họ

Nhân sâm (Araliaceae) là cây thân thảo lâu năm, có rễ củ hình con quay và lá kép chân vịt với 3-4 lá mọc vòng Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, hoa màu lục hoặc vàng nhạt, quả mọng hình cầu dẹt, khi chín có màu đỏ Cây có nguồn gốc từ Nam Trung Quốc và đã được trồng tại Việt Nam từ những năm 1970-1984, chủ yếu ở các huyện Sa Pa, Bắc Hà, Mẫu Sơn, Đồng Văn và Quản Bạ Hơn 200 thành phần hóa học đã được phân lập từ P notoginseng, với các saponin chiếm từ 4,42 – 12%, trong đó 5 saponin chính như notoginsenosid R1, ginsenosid Rb1, Rg1, Rd và Re chiếm tới 90% tổng saponin Ginsenosid Rb1, Rg1 và notoginsenosid R1 được sử dụng làm chất chuẩn để đánh giá chất lượng của tam thất, bên cạnh đó còn có flavonoid, phytosterol, polysaccharid, acid amin và muối vô cơ.

Tam thất, theo y học cổ truyền, có vị ngọt, đắng, tính ấm, tác động lên các kinh can và thận, mang lại nhiều lợi ích như hoạt huyết, bổ huyết, cầm máu, và giảm đau Nó được sử dụng để điều trị các vấn đề như thổ huyết, chảy máu cam, và rong kinh, đồng thời có tác dụng tích cực trong việc phòng ngừa và điều trị thiếu máu não cục bộ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin trong tam thất có khả năng giảm viêm, stress oxy hóa, và apoptosis, đồng thời cải thiện chức năng ty thể và hàng rào máu não Các dịch chiết từ tam thất có khả năng điều hòa sự kích hoạt tế bào thần kinh nội mô, giảm sản xuất các chất trung gian gây viêm Tác dụng chống oxy hóa của tam thất được thể hiện qua việc ức chế sản xuất gốc tự do và tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa Ngoài ra, tam thất còn hỗ trợ sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc thần kinh, đồng thời bảo vệ các tế bào thần kinh trong trường hợp đột quỵ thiếu máu não cục bộ.

Tam thất không chỉ có tác dụng bảo vệ thần kinh mà còn mang lại nhiều lợi ích cho hệ tim mạch, như bảo vệ tế bào cơ tim khỏi tổn thương do stress oxy hóa trong mô hình thiếu máu cục bộ Nó giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch thông qua tác dụng chống viêm và điều hòa lipid máu Bên cạnh đó, tam thất còn có tác dụng cầm máu, chữa lành vết thương, chống khối u, điều hòa miễn dịch và bảo vệ gan, thận.

1.3.3 Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume )

Hình 1.5 Hình ảnh toàn cây, hoa ngưu tất [21]

Ngưu tất, hay còn gọi là Achyranthes bidentata Blume, thuộc họ Dền (Amaranthaceae), là cây thảo cao từ 60-80cm với rễ củ hình trụ dài và nhiều rễ phụ to Thân cây mảnh, có cạnh, phình lên ở đốt, màu lục hoặc nâu tía, với cành mọc hướng lên Lá đơn, mọc đối, có hình bầu dục hoặc hình mác dài; cụm hoa mọc ở ngọn thân và kẽ lá thành bông dài, quả hình bầu dục chứa 1 hạt Cây có nguồn gốc từ Đông Bắc Trung Quốc hoặc Nhật Bản, được nhập vào Việt Nam từ năm 1960 và hiện trồng chủ yếu ở Sa Pa, Sìn.

Hồ (Lai Châu), Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Văn Điển (Hà Nội) là những ví dụ tiêu biểu về cây thuốc có nguồn gốc ôn đới, đã được trồng thành công ở vùng đồng bằng có khí hậu nhiệt đới gió mùa Tại Việt Nam, rễ cây cỏ xước được các thầy thuốc y học cổ truyền và người dân sử dụng như một sự thay thế cho ngưu tất, còn được gọi là ngưu tất nam Các loài thuộc chi Achyranthes chứa nhiều hợp chất thiên nhiên phong phú như triterpenoid saponin, ketosteroid, sterol, flavonoid và anthraquinon, trong đó polysaccharid và polypeptid là những thành phần chính tạo ra hoạt tính sinh học đáng chú ý cả in vivo và in vitro.

Ngưu tất, một loại thảo dược trong y học cổ truyền, có vị đắng chua, tính bình và không độc, chủ yếu tác động vào kinh can và thận Dạng sống của ngưu tất giúp hành huyết, tán ứ, tiêu ung và lợi thấp, trong khi dạng chín lại bổ can, ích thận, cường gân và tráng cốt Ngưu tất sống có công dụng chữa trị các triệu chứng như cổ họng sưng đau, mụn nhọt, tiểu rát buốt, tiểu ra máu, bế kinh, khó đẻ, và đau bụng sau sinh do huyết ứ Ngưu tất sao tẩm có tác dụng chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, và các triệu chứng co quắp hoặc bại liệt Tuy nhiên, ngưu tất không được khuyến cáo sử dụng cho phụ nữ mang thai hoặc trong trường hợp băng huyết.

Ngưu tất đã được coi là một thành phần quan trọng trong y học cổ truyền Trung Hoa nhờ khả năng thúc đẩy lưu thông máu và loại bỏ cục máu đông Thành phần polypeptid k (ABPPk) được chiết xuất từ ngưu tất có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh, góp phần vào việc cải thiện sức khỏe.

ABPPk đã được chứng minh là có tác dụng giảm thể tích nhồi máu và ngăn ngừa tổn thương oxy hóa ở não trong mô hình gây tắc động mạch não giữa Nghiên cứu cho thấy ABPPk ức chế sự hoạt hóa protease phân hủy chất nền nội mô, bảo vệ tính toàn vẹn của hàng rào máu não Đồng thời, các polypeptid từ ngưu tất (ABPP) cũng giúp phục hồi chức năng vận động, cảm giác và nhận thức trong mô hình đột quỵ thiếu máu cục bộ bằng cách giảm thiểu tổn thương tế bào trong hệ thần kinh trung ương Trên mô hình in vitro, ABPP đã tăng cường khả năng sống sót của tế bào thần kinh và làm giảm hoạt động cùng biểu hiện của protein caspase trong bối cảnh tổn thương do glutamat.

Chất trung gian gây chết tế bào theo apoptosis có vai trò quan trọng trong việc giảm tổn thương do stress oxy hóa Bằng cách giảm nồng độ của các gốc oxy hoạt động (ROS), chất này giúp ngăn ngừa rối loạn chức năng của ty thể, từ đó bảo vệ tế bào khỏi các tác động tiêu cực.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt non chủng Swiss albino, từ 5 đến 7 ngày tuổi, được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Chúng được nuôi trong phòng chăn nuôi với điều kiện nhiệt độ ổn định ở mức 25 ± 1 độ C và độ ẩm 65 ± 5% Chu kỳ ánh sáng được duy trì 12 giờ, từ 6:00 đến 18:00, và thức ăn cùng nước uống được cung cấp theo nhu cầu của chuột.

Phương pháp nghiên cứu

Các mẫu dược liệu được thu hái từ một số tỉnh thành trong nước và được xác định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu Sau khi thu hái, các mẫu này được sấy khô ở nhiệt độ 50 độ C và bảo quản trong túi nilon kín để tránh ẩm, đảm bảo nơi bảo quản khô ráo.

Mẫu thử dành dành (cao GJ)

Cao chiết được thực hiện tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu theo phương pháp đã được công nhận trước đó Nguyên liệu quả dành dành được thu mua từ tỉnh Bắc Ninh.

100 g quả dành dành khô được xay thành bột mịn và chiết hồi lưu 3 lần với ethanol 50

Quy trình chiết xuất được thực hiện qua ba lần, sử dụng ethanol 50% với 700ml trong 2 giờ, 500ml trong 1,5 giờ và 500ml trong 1 giờ, sau mỗi lần chiết, dịch chiết được lọc và gộp lại Dung môi được cất dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 oC, sau đó cao chiết được sấy khô trong tủ sấy chân không ở cùng nhiệt độ cho đến khi đạt khối lượng không đổi, với hiệu suất chiết xuất là 32,4% Phân tích HPLC cho thấy hàm lượng geniposid trong cao chiết ethanol 50% từ quả dành dành ước tính đạt 11,70 ± 0,04%.

Mẫu thử tam thất (cao PNG)

Cao tam thất được chế biến tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu theo phương pháp đã công bố trước đây Rễ củ tam thất được sấy khô ở 50 oC và nghiền thành bột mịn, sau đó bột dược liệu được chiết hồi lưu hai lần với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 7/1 trong 2 giờ bằng ethanol 70% Dịch chiết được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm ở 50 oC và sau đó sấy khô trong tủ sấy chân không để thu được cao khô, với hiệu suất chiết đạt 28,02% Cao tam thất được bảo quản ở 4 oC cho đến khi được sử dụng để nghiên cứu tác dụng dược lý Phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy cao chiết tam thất chứa 15,86% Rg1 và 12,04%.

Mẫu thử lá hồng (cao DKF)

Cao định chuẩn lá hồng được chuẩn bị tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, theo phương pháp đã công bố Lá hồng thu hái từ tỉnh Lạng Sơn được sấy khô ở nhiệt độ 40 – 50 oC, sau đó xay nhỏ với kích thước 2 – 5 mm Dược liệu được chiết xuất bằng ethanol 70% ba lần, với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 10/8/8 (ml/g) và thời gian chiết là 2h, 1,5h và 1h Dịch chiết từ ba lần được gộp lại, cô đặc đến nồng độ cồn 40% và hấp phụ lên cột hạt nhựa D101 Sau khi rửa bằng ethanol 30% cho đến khi nhạt màu, cột được rửa giải bằng ethanol 60% Dịch chiết ethanol 60%, sau khi thu hồi bớt dung môi, được cô cách thủy đến cao đặc và sấy khô ở 50 oC cho đến khi đạt hàm lượng flavonoid mong muốn.

21 % (định lượng HPLC), độ ẩm cao chiết < 5 % (cao DKF)

Cao định chuẩn ngưu tất được sản xuất bởi Khoa Công nghệ chiết xuất, Viện Dược liệu, thông qua quy trình chiết ngâm lạnh 4 kg rễ ngưu tất bằng ethanol 80% trong 3 lần, mỗi lần kéo dài 24 giờ Dịch chiết cồn sau đó được cô thu hồi dung môi dưới áp suất, giảm thể tích còn 1/10 Dịch cô đặc được phân tán trong nước và hấp phụ trên cột nhựa D101 Sau quá trình hấp phụ, hạt được rửa giải loại tạp bằng dung môi nước và ethanol 20%, tiếp theo là rửa giải bằng ethanol 50%, thu được 89 g cao với hàm lượng saponin tổng đạt 40,24% (định lượng bằng phương pháp UV theo acid oleanoic).

2.3.2 Nuôi cấy lát cắt hồi hải mã (Organotypic hippocampal slice culture - OHSCs)

Não bộ của chuột nhắt non chủng Swiss albino 5 - 7 ngày tuổi được lấy ra và vùng hồi hải mã được phân lập trong môi trường phù hợp Các lát cắt dày 450 μm được tạo ra bằng máy cắt McIlwain tissue chopper và chuyển sang tấm màng lọc Omnipore trong đĩa nhựa hình doughnut Đĩa này được đặt trong đĩa 6 giếng chứa môi trường nuôi cấy gồm 50% Minimum essential medium, 25% Hank’s balanced salt solutions, 23% huyết thanh ngựa đã được tiệt trùng, cùng với 6,5 g/L glucose, 50 unit/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin sulfat và 2% B-27 Các lát cắt được nuôi cấy trong tủ cấy ở điều kiện 37 °C, 95% không khí ẩm - 5% CO2 trong 7 ngày và môi trường nuôi cấy được thay 2 lần mỗi tuần trước khi tiến hành thí nghiệm.

2.3.3 Mô hình gây thiếu oxy và glucose (Oxygen and glucose deprivation - OGD) trên lát cắt hồi hải mã nuôi cấy (OHSCs)

OHSCs được đặt trong môi trường thiếu D-glucose và cân bằng với hỗn hợp khí 95% N2 – 5% CO2 trong 90 phút Sau đó, các lát cắt được đặt trong hộp kín thổi bằng dòng khí 95% N2 – 5% CO2 trong khoảng 60 phút Cuối cùng, lát cắt được đưa ra khỏi hộp và nuôi cấy trong điều kiện thông thường trong 24 giờ trước khi đánh giá mức độ tổn thương tế bào.

2.3.4 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh trước những tổn thương gây bởi thiếu máu não cục bộ

Thuốc thử MK-801 hydrogen maleat được bổ sung vào môi trường nuôi cấy trước 24 giờ khi thực hiện OGD và ngay sau quá trình này.

OGD Cao chiết của thuốc thử và thuốc đối chứng dương MK-801 hydrogen maleat được hòa tan trong DMSO để tạo thành dung dịch gốc, sau đó được bảo quản ở -20 °C cho đến khi sử dụng Nồng độ DMSO trong môi trường nuôi cấy tế bào được duy trì dưới 0,05 % (v/v), đảm bảo rằng DMSO không ảnh hưởng đến khả năng sống sót của các tế bào thần kinh trên lát cắt thùy hải mã nuôi cấy.

Hình 2.2 minh họa sơ đồ thử nghiệm nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của các dược liệu sau khi thực hiện mô hình thiếu oxy glucose (OGD) Phần 2.3.5 sẽ tập trung vào việc đánh giá mức độ tổn thương tế bào trên các tế bào thần kinh được nuôi cấy trong môi trường OHSCs.

Mức độ tổn thương tế bào trên OHSCs được đánh giá thông qua việc xác định mức hấp thụ propidium iodid (PI) sau 24 giờ xử lý OGD PI được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 30 phút trước khi tiến hành đánh giá tổn thương Hình ảnh huỳnh quang của PI được ghi lại bằng kính hiển vi huỳnh quang, và cường độ sáng của tín hiệu PI được phân tích bằng phần mềm Image-J (ver 1.41, NIH; Bethesda, MD, USA) Giá trị thu được từ các lát cắt mô xử lý với 100 μM N-Methyl D-aspartic acid (NMDA) được coi là 100% tổn thương, từ đó so sánh với các giá trị thu được từ các lát cắt mô đã xử lý với các thuốc thử khác.

Xử lý số liệu

Phân tích thống kê được thực hiện bằng SigmaPlot 12.0 (SYSTAT software Inc, Richmond, CA, USA), với kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM Sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá thông qua phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA), sau đó áp dụng test hậu kiểm Student-Newman-Keuls để so sánh từng cặp Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Bảng 2.3 Chú thích ký hiệu giá trị p p < 0,05 p < 0,01 p < 0,001

Khác biệt so với OHSCs sinh lý * ** ***

Khác biệt so với OHSCs bệnh lý # ## ###

KẾT QUẢ

Triển khai mô hình gây thiếu máu não trên lát cắt thùy hồi hải mã nuôi cấy in

Hiện nay, các mô hình gây thiếu oxy và glucose (OGD) được thực hiện với thời gian khác nhau tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu Một nghiên cứu đã sử dụng lát cắt hồi hải mã để đánh giá tổn thương não và khả năng bảo vệ, sửa chữa thần kinh, cho thấy rằng thời gian OGD từ 0 đến 125 phút ảnh hưởng đến mức độ hấp thụ PI của tế bào Cụ thể, tại 60 phút, mức độ hấp thụ PI đạt cực đại và không tăng lên nhiều sau 75 phút Để xác định khoảng thời gian tối ưu cho các thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành OGD trên tế bào hồi hải mã trong các khoảng thời gian 30, 60 và 90 phút, nhằm lựa chọn thời gian phù hợp cho nghiên cứu tiếp theo.

p < 0,001 so với OHSCs sinh lý.

Kết quả hình trên chỉ ra rằng:

Thời gian OGD từ 30, 60 đến 90 phút đều làm tăng đáng kể tỷ lệ hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý so với OHSCs sinh lý Mức độ tổn thương tế bào thần kinh trên OHSCs có sự phụ thuộc vào thời gian thực hiện OGD.

Sau 30 phút, số lượng tế bào chết vẫn còn ít, điều này khiến tác dụng của thuốc chưa thể hiện rõ trong các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo Tuy nhiên, sau 90 phút, số lượng tế bào thần kinh chết đã lên đến gần 100%, dẫn đến việc sử dụng thuốc cũng không thể phục hồi được tình trạng tế bào.

Do đó, 60 phút là thời gian tối ưu để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của dành dành, tam thất, ngưu tất, lá hồng trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro

Để đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của các dược liệu, cần thêm thuốc thử vào môi trường nuôi cấy 24 giờ trước khi thực hiện mô hình gây thiếu oxy.

27 glucose Sau khi gây mô hình OGD trong thời gian 60 phút, thay môi trường OGD và tiếp tục ủ thuốc thêm 24 giờ

3.2.1 Tác dụng của cao chiết cồn dành dành và geniposid trên mô hình OGD

3.2.1.1 Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết cồn dành dành

Nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của dành dành trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro cho thấy hình ảnh đặc trưng của lát cắt hồi hải mã và mức độ hấp thụ đáng chú ý.

PI *** p < 0,001 so với OHSCs sinh lý, ### p < 0,001 so với OHSCs bệnh lý

Kết quả hình trên cho thấy:

 % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,001)

 Sử dụng MK-801 liều 25 àM, % hấp thụ PI của OHSCs gõy mụ hỡnh OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001)

Sử dụng cao chiết cồn dành dành với nồng độ 10 µg/ml và 30 µg/ml đã cho thấy sự giảm đáng kể về % hấp thụ PI của OHSCs trong mô hình OGD so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý, với giá trị p < 0,001.

Kết quả cho thấy việc sử dụng cao chiết cồn dành dành có tác dụng bảo vệ thần kinh hồi hải mã trên mô hình OGD

Nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của geniposid trên mô hình thiếu máu cục bộ não in vitro, với hình ảnh đặc trưng của lát cắt hồi hải mã và mức độ hấp thụ được ghi nhận.

PI *** p < 0,001 so với OHSCs sinh lý, ### p < 0,001 so với OHSCs bệnh lý

Kết quả hình trên cho thấy:

 % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,001)

 Sử dụng MK-801 liều 25 àM, % hấp thụ PI của OHSCs gõy mụ hỡnh OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001)

 Sử dụng geniposid ở nồng độ 5 và 25 àM, % hấp thụ PI ở OHSCs gõy mụ hỡnh OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001)

Như vậy, việc sử dụng geniposid liều 5 và 25 àM cú tỏc dụng bảo vệ tế bào thần kinh hồi hải mã trên mô hình OGD

3.2.2 Tác dụng của cao chiết cồn tam thất trên mô hình OGD

Tam thất đã được đánh giá về tác dụng bảo vệ thần kinh trong mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro, với hình ảnh đặc trưng từ lát cắt hồi hải mã và mức độ hấp thụ được ghi nhận.

PI **p < 0,01 so với OHSCs sinh lý; # p < 0,05, ## p < 0,01 so với OHSCs bệnh lý

Kết quả hình trên cho thấy:

 % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,01)

 Sử dụng MK-801 liều 25 àM, % hấp thụ PI của OHSCs gõy mụ hỡnh OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,01)

Sử dụng cao chiết cồn tam thất với nồng độ 30 µg/ml đã cho thấy sự giảm đáng kể % hấp thụ PI của OHSCs trong mô hình OGD so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý, với p < 0,05.

Sử dụng cao chiết cồn tam thất với nồng độ 10 µg/ml đã cho thấy % hấp thụ PI của OHSCs trong mô hình OGD giảm, tuy nhiên sự giảm này không có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ.

PI của OHSCs bệnh lý

Kết quả này cho thấy cao chiết cồn tam thất liều 30 àg/ml cú tỏc dụng bảo vệ tế bào thần kinh hồi hải mã trên mô hình OGD

3.2.3 Tác dụng của cao định chuẩn ngưu tất trên mô hình OGD

Hình 3.5 trình bày đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của ngưu tất trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro (A) Hình ảnh đặc trưng cho thấy lát cắt hồi hải mã, trong khi (B) thể hiện mức độ hấp thụ của mẫu nghiên cứu.

PI ***p < 0,001 so với OHSCs sinh lý, # p < 0,05 so với OHSCs bệnh lý

Kết quả hình trên cho thấy:

 % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,001)

 Sử dụng MK-801 liều 25 àM, % hấp thụ PI của OHSCs gõy mụ hỡnh OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,05)

 Sử dụng cao định chuẩn ngưu tất ở nồng độ 10 àg/ml và 30 àg/ml cú làm giảm

% hấp thụ PI ở OHSCs gây mô hình OGD Tuy nhiên mức giảm không có ý nghĩa thống kê

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao định chuẩn ngưu tất với liều 10 và 30 µg/ml không có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh hồi hải mã trong mô hình thiếu oxy-glucose (OGD).

3.2.4 Tác dụng của cao định chuẩn lá hồng trên mô hình OGD

Hình 3.6 trình bày đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của lá hồng trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro (A) Hình ảnh đặc trưng của lát cắt hồi hải mã cho thấy cấu trúc rõ ràng, và (B) mức độ hấp thụ được đo lường để xác định hiệu quả bảo vệ.

PI *** p < 0,001 so với OHSCs sinh lý, ### p < 0,001 so với OHSCs bệnh lý

Kết quả hình trên cho thấy:

 % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,001)

 Sử dụng MK-801 liều 25 àM, % hấp thụ PI của OHSCs gõy mụ hỡnh OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001)

Sử dụng cao định chuẩn lỏ hồng với nồng độ 5 àg/ml, 10 àg/ml và 30 àg/ml, % hấp thụ PI của OHSCs trong mô hình OGD đã giảm một cách có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001).

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao định chuẩn lỏ hồng với liều 5, 10 và 30 µg/ml có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh hồi hải mã trong mô hình thiếu oxy-glucose (OGD).

BÀN LUẬN