TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Toddalia Juss
Chi Toddalia Juss, hay còn gọi là Xít xa, thuộc họ Cam (Rutaceae) và là một trong 26 chi của họ này Theo Hệ thống phân loại Thực vật hiển hoa của Takhtajan (2009), họ Cam (Rutaceae) có vị trí quan trọng trong giới thực vật.
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Năm 2012, Bùi Thu Hà đã thực hiện nghiên cứu về phân loại họ Cam (Rutaceae Juss.) tại Việt Nam, trong đó mô tả và minh họa chi tiết các chi và loài thuộc họ này Tác giả đã xác định được 107 loài, 1 phân loài và 3 thứ thuộc 26 chi, được phân loại theo 5 tông của 3 phân họ, như thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1 Bảng mô tả tóm tắt các chi và loài của họ Cam ở Việt Nam
Trong đó, Toddalia asiatica (L.) Lam là loài duy nhất thuộc chi Todallia
1.1.2 Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố chi Toddalia Juss
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật và sinh thái của chi Toddalia Juss Đặc điểm thực vật: Cây bụi (thường vươn dài) hoặc thân gỗ, thường có gai
Lá mọc so le, có cuống dài từ 1-4 cm, với 3 lá chét hình elip hoặc hình trứng, kích thước 3-10 × 1-4 cm, gốc lá hơi nhọn và đỉnh lá thuôn dài Hoa nhỏ, nhiều, thành chùm đơn ở nách lá, với cụm hoa dài 17 cm, cánh hoa màu trắng sữa, hình trứng hoặc elip Quả mọng, màu vàng cam, đường kính 5-10 mm, có 5 ô chứa mỗi ô 1 hạt hình thận, mùi chanh và vị cay thơm Loài này phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Malaysia, Myanmar, và nhiều nước khác, chủ yếu ra hoa vào mùa xuân và mùa hè, quả chín vào mùa thu và mùa đông.
1.1.2.2 Phân bố chi Toddalia Juss ở Việt Nam
Chi Toddalia Juss phổ biến ở Việt Nam, thường xuất hiện trong các khu rừng thưa, ven đường, trên các sườn núi và hẻm núi, đặc biệt tại Lào Cai và các tỉnh từ Ninh Bình đến Quảng Trị, kéo dài đến khu vực Nam Trung Bộ.
1.1.3 Thành phần hóa học chi Toddalia Juss
Nghiên cứu toàn cầu về thành phần hóa học của cây Cam núi chủ yếu tập trung vào rễ và vỏ rễ Các hợp chất đã được phân lập từ cây này bao gồm coumarin, alcaloid, tinh dầu và một số nhóm hợp chất khác.
Coumarin là một trong những nhóm hợp chất đã được phân lập nhiều nhất từ rễ cây cam núi (Toddalia asiatica)
Bảng 1.2 Các hợp chất coumarin đã được phân lập từ cây Cam núi
Nhóm Hợp chất Bộ phận dùng
6-(2-hydroxy-3-methoxy-3-methyl- butyl)-5,7-dimethoxy-coumarin
6-(3-chloro-2-hydroxy-3-methyl-butyl)- 5,7- dimethoxy-coumarin
Ngoài các nhóm coumarin đã được phân loại, một số dạng khác của coumarin cũng đã được xác định Năm 2009, Wang Fei và các cộng sự đã phân lập hai ete coumarin-monoterpen là geranyloxy-5-methoxycoumarin và geranyloxy-5,7-dimethoxycoumarin Đến năm 2020, Li Yan cùng các cộng sự đã phân lập ba hợp chất coumarin glycosid, bao gồm toddalolacton 2j-O-β-D-glucopyranosid và hai đồng phân (±)-toddalolacton 3j-O-β-D-glucopyranosid.
Alcaloid là một thành phần phổ biến trong T asiatica, và nhiều nghiên cứu đã được công bố về nhóm hợp chất này Các alcaloid đã được phân lập có thể được phân loại theo bảng sau.
Bảng 1.3 Các hợp chất alcaloid đã được phân lập từ cây Cam núi
Nhóm hợp chất Hợp chất Bộ phận dùng
Norchelerythrin Thân, rễ [47] Chelerythrine-ψ-cyanid Rễ [22]
8-hydroxydihydrochelerythrin Vỏ rễ [22] 8-methoxydihydrochelerythrin Vỏ rễ [22] 8-acetonyldihydrochelerythrin Vỏ rễ [22]
4-methoxy-1-methyl-2- quinolon Vỏ rễ [16]
3-(2,3-dihydroxy-3-methyl- butyl)-4,7- dihydroxy-1- methyl-1H-quinolin-2-on
N-methyl-4-hydroxy-7- methoxy-3(2,3-epoxy-3- methyl-butyl)-1H-quinolin-2-on
Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng có sự khác biệt lớn trong thành phần hóa học của tinh dầu ở các mẫu khác nhau
Năm 2012, Xin Chao Liu và các cộng sự đã phát hiện ra 58 thành phần của tinh dầu rễ cây T asiatica, trong đó hàm lượng sesquiterpenoid và monoterpenoid gần như bằng nhau, lần lượt là 35,41% và 31,87% Các hợp chất chính bao gồm geraniol (9,84%), D-limonen (7,52%), isopimpinellin (6,62%), α-gurjunen (6,25%) và 4-vinylguaiacol (5,94%) Tinh dầu này được thu thập từ rễ cây T asiatica tại thành phố Quý.
Dương (Trung Quốc) chủ yếu chứa α-cadinol (17,08%), spathulenol (12,06%), α- amorphen (9,18%), δ-cadinen (9,03%), germacren D- 4 - ol (8,22%), β-bisabolene (6,08%), và trans-nerolidol (5,67%) [28]
The essential oil extracted from the roots of T asiatica, harvested in India, contains key components including linalool (12.4%), borneol (9.4%), p-cymene (8.75%), α-terpineol (8.7%), methyl chavicol (7.1%), D-limonene (6.58%), terpinolene (6.4%), α-pinene (6.25%), 1,8-cineole (5.6%), β-pinene (4.75%), eugenol (4.56%), and bornyl acetate (4.3%).
Sự thay đổi này có thể do các yếu tố như thời gian thu hoạch, địa phương, khí hậu, mùa vụ cũng như thời gian bảo quản dược liệu
Ngoài các nhóm chất trên thì người ta còn phân lập được một số nhóm chất khác như amid, flavonoid (dihydrofisetin, diosmetin, diosmin và hesperidin), acid hữu cơ,…[36]
Hình 1.1 Công thức hóa học của diosmetin, diosmin
Năm 2015, Jiang Hu và các cộng sự đã phân lập thành công ba amid mới từ rễ cây Cam núi, bao gồm: (7Z) -N- (4'-metoxyphenethyl) - 3-metoxy-4-hydroxycinnamamid, (7Z) -N- (4'-hydroxyphenetyl) -3-metoxy-4,5-dihydroxycinnamamid, và (7E) -N- (4'-hydroxyphenetyl) -3,4,5-trihydroxycinnamamid, cùng với một amid đã biết là (7Z) -N- (4'-hydroxyphenetyl) -3-metoxy-4-hydroxycinnamamid.
1.1.4 Giá trị sử dụng của chi Toddalia Juss
Trên thế giới, Todalia asiatica (L.) Lam đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền từ thế kỷ 18
Người dân Ấn Độ sử dụng rễ và rễ nhỏ cây Cam núi để chữa lỵ và điều kinh, trong khi quả của cây này được dùng để chữa ho và làm gia vị Ở Trung Quốc, vỏ rễ và rễ nhỏ T asiatica được sử dụng để điều trị đau dạ dày, thấp khớp, và các vấn đề liên quan đến kinh nguyệt Tại Đông Phi, vỏ rễ và rễ nhỏ của cây Cam núi giúp kích thích tiêu hóa và chữa chướng bụng Ở đảo Reunion, rễ được dùng để chữa đau dạ dày và sốt rét Tại Việt Nam, rễ Cam núi chữa lỵ, điều hòa kinh nguyệt và giúp phục hồi sức khỏe sau cơn sốt, trong khi vỏ rễ có tác dụng cầm máu và giảm đau Lá cây được dùng để điều trị đau bụng, còn quả có vị cay như hồ tiêu, không chỉ là gia vị mà còn có tác dụng trị ho.
Một số tác dụng dược lý của chi Toddalia Juss:
Tinh dầu chiết xuất từ lá T asiatica đã được nghiên cứu và cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả Kết quả từ phương pháp khuếch tán đĩa thạch cho thấy tinh dầu này có khả năng chống lại nhiều loại vi khuẩn và nấm, bao gồm Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella newport, Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger và Microspermumhus stolonifer, đến độ pha loãng 1:20.
Năm 2009, Duraipandiyan và Ignacimuthu đã phân lập thành công flindersin, một alcaloid quinolon, thông qua quá trình chiết liên tục bằng ethyl acetat Hợp chất này cho thấy khả năng ức chế đáng kể vi khuẩn Staphylococcus epidermidis.
The study identified significant antimicrobial activity of various microorganisms, with minimum inhibitory concentrations (MIC) measured in mg/ml: Enterobacter aerogenes (62.5), Shigella flexneri (62.5), Klebsiella pneumoniae (62.5), Escherichia coli (62.5), and fungal species such as Aspergillus flavus (15.625), Candida krusei (125), and Botrytis cinerea (125) In 2012, the same research group extracted ulopterol, a potent antibacterial compound, alongside flindersin from the leaves of Toddalia asiatica (L.) Lam.
Toddalia asiatica (L.) Lam đã được chứng minh có khả năng kháng vi rút H1N1 mạnh mẽ thông qua các xét nghiệm MTS và PCR Nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng vi rút của Toddalia asiatica hiệu quả trong điều trị đồng thời nhiễm vi rút cúm, và vẫn duy trì hiệu quả ngay cả khi sử dụng 24 giờ trước và sau khi khởi phát bệnh.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm phần cành nhỏ, lá và quả của cây Cam núi được thu hái được thu hái tại thôn Măng Rương, xã Ngọc Lây, huyện Tu
Mơ Rông, tỉnh Kon Tum
Vào ngày 20/01/2021, mẫu thực vật đã được thu hái và mang về Hà Nội, bao gồm lá và quả được chiết tinh dầu khi còn tươi Một phần lá và cành nhỏ được bảo quản trong ethanol 50% để phục vụ cho vi phẫu thực vật Phần mẫu còn lại được phơi khô và sấy trong tủ sấy thông gió ở nhiệt độ 60 °C, sau đó nghiền thành bột và bảo quản trong túi nilon kín để phục vụ cho việc định tính sơ bộ các hợp chất hóa học và nghiên cứu đặc điểm hiển vi của lá, cành nhỏ và quả.
Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học và hiện đang được bảo quản tại Bảo tàng thực vật thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia.
- Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: nước cất, nước Javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin
- Dùng trong định tính sơ bộ các thành phần hóa học: HCl đặc, h TT Diazo,
TT Fehling A & B, Na 2 CO 3 , chì acetat 10%, NaOH 10%, FeCl 3 5%, dd gelatin 1%, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, …
- Dùng trong sắc ký lớp mỏng:
+ Dung môi: ethanol, ethylacetat, toluen, acid formic,…
+ Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merck
+ Thuốc thử NP/PEG, thuốc thử Vanilin/ethanol/H2SO4 đặc
+ Tất cả các hóa chất và dung môi đều đạt tiêu chuẩn DĐVN V
2.1.2.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị
• Dụng cụ bằng thủy tinh: Cốc có mỏ, đũa thủy tinh, phễu, bình gạn, pipet, ống nghiệm,
• Dao lam, phiến kính, lam kính
• Dụng cụ khác: Bát sứ, chày, thuyền tán, khay tráng men,…
• Tủ sấy MEMMERT (Đức), bếp điện
• Cân kĩ thuật SATORIUS TE412
• Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP29)
• Kính hiển vi LEICA DM 1000
• Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H)
• Hệ thống sắc ký bản mỏng bán tự động CAMAG (HPTLC) gồm: Máy chấm sắc kí CAMAG Linomat 5, hệ thống triển khai sắc ký tự động ADC-
2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy tính cài đặt phần mềm visionCATS
• Máy sắc ký khí kết hợp khối phổ Agilent Technologies (GC-MS).
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
- Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:
+ Vi phẫu: Lá, cành nhỏ
+ Bột: Lá, cành nhỏ, quả
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học
- Định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong lá, cành mẫu nghiên cứu
- Xác định hàm lượng tinh dầu trong lá, quả
- Triển khai sắc kí lớp mỏng dịch chiết cành nhỏ và lá
- Định tính các thành phần hóa học trong tinh dầu lá, quả bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Xác định thành phần cấu tử và tỷ lệ phần trăm của từng thành phần trong tinh dầu lá và quả được thực hiện bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) Phương pháp này cho phép phân tích chính xác các hợp chất có trong tinh dầu, từ đó cung cấp thông tin chi tiết về thành phần hóa học và tính chất của chúng.
2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật
- Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu thân rễ và lá của mẫu nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm hình thái của mẫu thực vật Để xác định tên khoa học của cây, chúng tôi áp dụng phương pháp so sánh và đối chiếu với các tài liệu chuyên sâu như Thực vật chí Trung Quốc Ngoài ra, sự hỗ trợ từ các chuyên gia phân loại thực vật tại Bảo tàng thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giám định tên khoa học của loài.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi
- Đặc điểm vi phẫu: Mẫu nghiên cứu (lá, quả) được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi học trong kiểm nghiệm dược liệu
[6], mô tả vi phẫu và chụp ảnh
Bột dược liệu được tạo ra từ mẫu nghiên cứu (lá, quả, cành nhỏ) sau khi được sấy khô và nghiền nhỏ bằng thuyền tán Sau đó, bột được rây qua sàng 180 μm để đạt được độ mịn cần thiết Việc soi bột dược liệu giúp tìm kiếm, quan sát và mô tả các đặc điểm của bột, đồng thời chụp ảnh để lưu lại hình ảnh minh họa.
2.3.3 Phương pháp hóa học Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học theo các phương pháp được trình bày ở Phụ lục 2
2.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
2.3.4.1 Triển khai sắc ký lớp mỏng dịch chiết cành nhỏ và lá Cam núi (Toddalia asiatica)
Để chuẩn bị dịch chấm sắc ký, đầu tiên cân 1g bột dược liệu thô vào bình nón và đun cách thủy với 50ml methanol trong 20-30 phút Sau đó, lọc lấy phần dịch trong và lắc ba lần với n-hexan (mỗi lần 5ml), loại bỏ lớp n-hexan và giữ lại lớp nước Tiếp theo, lắc lớp nước với ethyl acetat ba lần (5ml/lần), loại bỏ lớp nước và thu lấy lớp ethyl acetat Gộp các dịch chiết phân đoạn ethyl acetat, cất thu hồi dung môi đến cặn Cuối cùng, hòa tan cặn thu được trong 1ml methanol, lọc để loại bỏ tủa và thu được dịch chấm sắc ký lớp mỏng.
- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm
- Pha động: Hệ I: Toluen - ethyl acetat - acid formic (14:10:1)
Hệ II: Ethyl acetat - acid formic – nước (8:1:1)
Để triển khai sắc ký, đầu tiên, đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi và đậy kín Sau đó, để yên và quan sát quá trình chạy sắc ký cho đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 1 cm Khi đạt yêu cầu, lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt.
Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
254 nm và 366 nm Sau đó phun thuốc thử hiện màu NP/PEG rồi quan sát, chụp ảnh ở bước sóng 366 nm
2.3.4.2 Định tính thành phần tinh dầu thu được bằng SKLM
+ Mẫu tinh dầu cất được loại nước bằng Na2SO4 khan, sau đó pha loãng trong cloroform để chấm sắc ký
+ Lượng mẫu chấm sắc ký: Quả: 12 àl; Lỏ 12 àl
+ Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel 60 F 254 của Merck
+ Pha động: Hệ dung môi khai triển toluen – ethyl acetat (97:3)
Sau khi thực hiện sắc ký, tiến hành sấy nhẹ bản mỏng và quan sát sắc ký đồ ở bước sóng 254 và 366 nm Tiếp theo, phun dung dịch vanilin/ethanol/H2SO4 đặc để hiện màu, sau đó quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ dưới ánh sáng thường.
2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu
Dùng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP29)
- Xử lý, phân loại mẫu tươi thành mẫu cành nhỏ, quả, lá
- Cân chính xác một lượng mẫu nhất định đem đi cất tinh dầu, một lượng khác đem đi xác định hàm ẩm
- Cho mẫu vào nồi cất, thêm nước ngập mẫu khoảng 3-4cm
Lắp đặt bộ dụng cụ cất tinh dầu và tiến hành quá trình cất kéo hơi nước trong khoảng 3-4 giờ Tiếp theo, theo dõi thể tích tinh dầu cho đến khi không còn tăng lên nữa và ghi lại kết quả.
- Xác định hàm lượng tinh dầu theo tỉ lệ phần trăm thể tích trên khối lượng dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:
Trong đó: H%: hàm lượng tinh dầu (%); X: mất khối lượng do làm khô của dược liệu (%); V: thể tích tinh dầu cất được (ml); M: khối lượng dược liệu đem cất (g)
2.3.6 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ
Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) là một phương pháp phân tích hiệu quả, bao gồm thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Sau khi các hợp chất trong tinh dầu được phân tách, detector khối phổ sẽ xác định các thành phần bằng cách so sánh phổ khối của chất cần phân tích với thư viện phổ Phương pháp này hiện đang được ứng dụng rộng rãi để định tính và định lượng các thành phần trong tinh dầu.
Hệ thống máy sắc ký GC-MS gồm các bộ phận: Sắc ký khí Agilent Technologies 7890 A và hệ thống MS gồm có Agilent Technologies 5975
C, cột sắc ký DB- 5MS với các thông số: chiều dài cột 30 m, đường kính cột 0,25 mm, kích thước hạt nhồi 0,25 μm (30 m/0,25 mm/0,25 μm) Loại khí mang được sử dụng là Helium với tốc độ khí mang 1 ml/phút Dùng dung môi n-hexan để pha loãng tinh dầu, thể tích tiêm mẫu 1 microlit, chế độ chia dòng 50:1
Nhiệt độ được cài đặt như sau: 60 °C trong 15 phút đầu, sau đó tăng dần nhiệt độ lên 180 °C (3 °C/phút), tổng thời gian phân tích 70 phút
Để xác định các thành phần trong tinh dầu, phương pháp so sánh độ trùng lặp về phổ khối với các chất trong thư viện là rất quan trọng Đồng thời, giá trị RI cũng được so sánh với dữ liệu từ thư viện NIST và các cơ sở dữ liệu đã công bố Giá trị RI được tính dựa trên thời gian lưu thực tế của các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu của các alkan trong dãy đồng đẳng alkan từ C9 đến C20, được thực hiện dưới cùng điều kiện sắc ký Công thức tính RI được áp dụng để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.
Trong đó: RTx: Thời gian lưu của chất phân tích;
R: Thời gian lưu của alkan liền trước pic phân tích;
RTn+1: Thời gian lưu của alkan liền sau pic phân tích; n: Số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích
2.3.7 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Dựa vào các tài liệu tham khảo [4], [31], [48], [50] tiến hành thử hoạt tính vi sinh vật bằng vật liệu và phương pháp như sau:
Chủng vi sinh vật kiểm định:
- Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa
- Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis ATCC 6633, Staphylococcus aureus
- Nấm sợi (mốc): Aspergillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC
- Nấm men: Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae
Chủng chuẩn từ nguồn ATCC, Manassas, Mỹ, được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và hiện đang được lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Pha dịch vi sinh vật:
Sử dụng que cấy vô trùng để lấy 1 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh vật, sau đó hòa tan vào 10ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex để tạo ra huyền dịch vi sinh vật Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với chuẩn 0,5 McFarland (đo ở λ U0nm), đạt được huyền dịch có nồng độ 150 x 10^6 CFU/mL.
Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc Tryptic Soy Agar (TSB- Merck) cho vi khuẩn
- Gentamycin cho vi khuẩn Gr (-), doxycyclin cho vi khuẩn Gr (+) và nystatin cho nấm sợi và nấm men (Kháng sinh được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm
Pha dung dịch gốc từ dung dịch mẹ bằng nước cất vô trùng, sau đó pha loãng đến nồng độ cần thiết: gentamycin (16 - 8 - 4 IU/mg), doxycylin (0,4 - 0,2 - 0,1 IU/mg) và nystatin (12 - 6 - 3 IU/mg).
Thử nghiệm và đánh giá kết quả
Pha mẫu với DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ) Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để tạo ra dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 àg/ml, với mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần Các mẫu được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 °C trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30 °C trong 48 giờ cho các loại vi sinh vật khác.
Mẫu đối chứng: sử dụng NaCl 0,9% tương ứng với thể tích mẫu là mẫu chứng âm tính (-) và chứng dương tính (+) là các kháng sinh chuẩn
Mẫu được xác định có hoạt tính khi không có sự phát triển của vi sinh vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng (-), với giá trị CFU < 5 khi nuôi cấy lại ở nồng độ này Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), mẫu được test ở nhiều nồng độ khác nhau, và mẫu được coi là có hoạt tính khi giá trị MIC ≤ 50 (àg/mL).
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nghiên cứu về thực vật
Cây nhỏ, thân gỗ, mọc bò và có gai, với cành mảnh màu nâu nhạt, đường kính khoảng 4 mm, có đốm trắng và gai cong ở gốc dài 2 mm Lá mọc so le, gồm 3 lá chét, dài 6,5 cm, hình trứng, có cuống và gân giữa rõ ràng, gốc thuôn và đỉnh dài với mép hơi khía răng 2 mm Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm đơn, hoa nhỏ, màu vàng lục, có 5 lá đài rất nhỏ và 5 cánh hoa hình trứng Hoa đực có nhị mảnh, dài hơn cánh hoa, trong khi hoa cái chưa được mô tả.
Quả mọng mọc thành chùm dài 6 cm, đường kính quả 6 mm, có rãnh, có mũi nhọn ở đầu (J, K) Quả có 7 ô chứa mỗi ô 1 hạt hình thận, hạt 2,5 mm, mang phôi
Dựa trên hình thái mẫu nghiên cứu và đối chiếu với tài liệu phân loại thực vật như Thực vật chí Trung Quốc, cùng với bản mô tả gốc loài Toddalia asiatica (L.) Lam và sự tư vấn từ các chuyên gia, chúng tôi xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Toddalia asiatica (L.) Lam thuộc họ Cam (Rutaceae) Mẫu vật này được lưu giữ tại Bảo tàng thực vật (HNU), khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu mẫu nghiên cứu
3.2.1 Đặc điểm vi phẫu cành nhỏ Cam núi (Toddalia asiatica)
Dưới kính hiển vi, vi phẫu cành nhỏ cho thấy các đặc điểm đáng chú ý, với mặt cắt ngang có hình dạng tròn Biểu bì được cấu tạo từ một lớp tế bào hình chữ nhật, trên bề mặt có sự hiện diện của lông che chở đơn bào và lông che chở đa bào.
Mô mềm vỏ bao gồm 4-6 lớp tế bào hình đa giác hoặc bầu dục, với vách mỏng và xếp sát nhau Trong vùng mô mềm vỏ, có sự hiện diện của các túi tiết tinh dầu lớn Trụ bì hóa sợi được xếp thành từng bó ở phía ngoài libe - gỗ, tạo nên cấu trúc libe cấp 2.
Gỗ cấp 2 bao gồm các tế bào nhỏ xếp thành từng cụm liên tục, với nhiều mạch gỗ hình tròn có kích thước không đều, sắp xếp theo dãy hướng tâm Mô mềm ruột được cấu tạo từ các tế bào hình tròn hoặc đa giác, trong đó các tế bào ở tâm vi phẫu có kích thước lớn hơn so với các tế bào bên ngoài Ngoài ra, trong mô mềm ruột còn có sự hiện diện của các tinh thể calci oxalat hình cầu phân bố rải rác.
Hình 3.1 Đặc điểm hình thái cây Cam núi (T asiatica)
Cây có cấu trúc phức tạp bao gồm nhiều bộ phận quan trọng như cụm hoa, cành mang lá và quả Một số bộ phận của lá, bao gồm mép lá, đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp Cành mang gai và gai nhọn giúp bảo vệ cây khỏi sự xâm nhập của động vật Ngoài ra, chùm quả và cấu trúc quả được thể hiện qua các lát cắt ngang và dọc, cho thấy sự phát triển của hạt bên trong.
Hình 3.2 Vi phẫu cắt ngang cành nhỏ Cam núi (T asiatica)
1 Lông che chở; 2 Biểu bì 3 Mô mềm vỏ; 4 Túi tiết; 5 Sợi; 6 Libe;
7 Gỗ; 8 Mô mềm ruột; 9 Tinh thể calci oxalat
3.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi, thấy các đặc điểm vi phẫu lá (Hình 3.3) như sau:
Phần gân chính: Gân dưới lồi, hơi lõm ở giữa, gân trên hơi lồi Biểu bì trên
Biểu bì dưới được cấu tạo bởi một lớp tế bào nhỏ xếp đều đặn, trong khi biểu bì trên là mô dày với các tế bào thành dày Mô mềm có hình dạng đa giác hoặc tròn, kích thước không đồng đều và sắp xếp lộn xộn mà không có khoảng gian bào Bó libe-gỗ là một phần quan trọng trong cấu trúc này.
Hình cung nằm giữa gân lá, với gỗ được sắp xếp thành hình vòng tròn và các mạch gỗ hướng tâm Libe bao quanh hình cung gỗ, tạo nên cấu trúc đặc biệt cho lá cây.
Phần phiến lá bao gồm biểu bì trên và biểu bì dưới giống như phần gân lá, với hạ bì là lớp tế bào hình chữ nhật xếp sát biểu bì trên Dưới hạ bì là mô giậu, gồm 1-2 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đứng đều đặn và vuông góc với biểu bì trên của lá Dưới lớp mô giậu là mô khuyết, chứa các tế bào không đều, được sắp xếp lỏng lẻo để tạo ra những khoảng gian bào lớn.
Hình 3.3 Vi phẫu cắt ngang lá Cam núi (T asiatica)
1 Biểu bì dưới; 2 Mô mềm; 3 Libe; 4 Gỗ; 5 Mô dày; 6 Biểu bì trên;
7 Mô mềm khuyết; 8 Mô mềm giậu; 9 Tế bào tiết
Nghiên cứu về đặc điểm vi học bột dược liệu
3.3.1 Đặc điểm bột lá và cành nhỏ
Lá và cành nhỏ được sấy khô, nghiền nhỏ và rây qua rây có kích thước mắt rây 180, tạo ra bột mịn dùng để làm tiêu bản Hỗn hợp bột từ lá và cành có màu nâu xanh và tỏa ra mùi thơm nhẹ.
Khi quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi, có thể nhận thấy các đặc điểm nổi bật như: mảnh biểu bì với lỗ khí hình hạt đậu úp vào nhau, mảnh mạch chứa mạch xoắn và mạch điểm Ngoài ra, sợi dài được tập trung thành bó, lông che chở đa bào rải rác và có sự hiện diện của tinh thể canxi oxalat hình cầu gai cùng tinh thể canxi oxalat hình khối.
Hình 3.4 Đặc điểm bột lá và cành nhỏ Cam núi (T asiatica)
1 Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 2&6 Mảnh mạch 3 Sợi; 4&5 Lông che chở đa bào; 7 Mạch điểm; 8 & 9 Tinh thể calci oxalat
Quả sau khi làm khụ được nghiền nhỏ và rây qua rây có kích thước mắt 180 để thu được bột mịn dùng làm tiêu bản Bột quả có màu nâu và tỏa ra mùi thơm giống như cam chanh.
Quan sát bột quả trên kính hiển vi (Hình 3.5), thấy có các đặc điểm sau: Mảnh mạch (1), nội nhũ (2), mảnh vỏ quả (3), tế bào cứng (4)
Hình 3.5 Đặc điểm bột quả Cam núi (T asiatica)
Định tính hóa học
Các nhóm chất trong cành nhỏ và lá cây Cam núi (Toddalia asiatica) đã được định tính sơ bộ thông qua các phản ứng hóa học, và kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong cành nhỏ và lá cây
STT Nhóm chất Phản ứng định tính
Cành nhỏ Lá Kết quả
Phản ứng với dd FeCl 3 5% + + Phản ứng với hơi amoniac + -
Phản ứng mở, đóng vòng lacton +
Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis- Trans + -
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt - Âm tính - Âm tính
Phản ứng với TT Mayer - Âm tính
Phản ứng với dd FeCl 3 5% +
+ Âm tính Phản ứng với dd gelatin 1% + -
Phản ứng với dd chì acetat
6 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Âm tính - Âm tính
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na 2 CO 3 - Âm tính - Âm tính
9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A và Fehling B + Dương tính + Dương tính
10 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin
11 Polysaccarid Phản ứng với TT Lugol - Âm tính - Âm tính
Các phản ứng hóa học cho thấy cành nhỏ của cây Cam núi chứa flavonoid, coumarin, tanin, đường khử và acid amin, trong khi lá cây chứa đường khử và acid amin.
Xác định hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây Cam núi
Cất tinh dầu từ lá, cành nhỏ và quả của cây Cam núi (Toddalia asiatica) được thực hiện bằng dụng cụ định lượng theo Dược điển Mỹ (USP29) Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu trong lá là 0,18% và trong quả là 0,62%, trong khi lượng tinh dầu thu được từ cành nhỏ là không đáng kể.
Tinh dầu lá và quả có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng, trong, sánh.
Sắc ký lớp mỏng dịch chiết các bộ phận cây Cam núi
Tiến hành triển khai sắc kí trên 2 hệ dung môi Kết quả sắc kí đồ được trình bày ở hình 3.6 và hình 3.7
Hệ I: Toluen - ethyl acetat - acid formic (14:10:1)
Hình 3.6 Ảnh chụp sắc kí đồ dịch chiết cành nhỏ, lá của cây Cam núi hệ I
(A) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG (B) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG (C) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG
Ở bước sóng 366 nm sau khi phun TT NP/PEG, màu sắc và vị trí vết trên SKĐ của dịch chiết cành và lá Cam núi cho thấy sự hiện diện của clorophyl với vết huỳnh quang màu đỏ, nhiều hơn ở lá so với cành Một số vết có giá trị R f là 0,32; 0,44 và 0,83 cho thấy sự tương đồng trong thành phần hóa học giữa dịch chiết lá và dịch chiết cành Tuy nhiên, một số vết như vết màu vàng nâu với R f = 0,03 chỉ được quan sát trên SKĐ dịch chiết cành, không xuất hiện ở dịch chiết lá.
Hệ II: Ethyl acetat - acid formic – nước (8:1:1)
Hình 3.7 Ảnh chụp sắc kí đồ dịch chiết cành, lá của cây Cam núi hệ II
(A) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG (B) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG (C) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG
Hệ dung môi số 2, với tính phân cực cao, cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong sắc ký đồ (SKĐ) của cành nhỏ và lá Cành nhỏ có ba vết màu xanh, nâu cam và cam, trong khi lá chỉ có hai vết màu xanh lá và xanh dương Ở bước sóng 366 nm, SKĐ của cành xuất hiện vết huỳnh quang màu nâu cam tại Rf = 0,58, trong khi lá không có vết này Ngược lại, tại Rf = 0,37, SKĐ của lá có vết huỳnh quang màu xanh lá, không xuất hiện ở cành Điều này cho thấy các vết màu cam trên SKĐ của cành thường là flavonoid, phù hợp với kết quả định tính sơ bộ từ các phương pháp hóa học.
Sắc kí đồ của cành và lá cho thấy sự tương đồng rõ rệt, với các vết phát huỳnh quang có màu sắc và vị trí tương đương tại các giá trị Rf = 0,42.
= 0,73, R f tuy nhiên sắc kí đồ của cành có cường độ vết đậm hơn so với trong sắc kí đồ của lá.
Sắc ký lớp mỏng tinh dầu các bộ phận cây Cam núi
Sau khi thực hiện sắc ký trên nhiều hệ, hệ toluen – ethyl acetat (97:3) đã cho kết quả tối ưu nhất Hình 3.8 trình bày sắc ký đồ của dịch chấm tinh dầu quả và tinh dầu lá từ mẫu nghiên cứu.
Hình 3.8 Sắc ký đồ tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu
Hình 3.8 Sắc ký đồ tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu
(A) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử vanilin/ethanol/ H2SO4 đặc
(B) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử vanilin/ethanol/ H2SO4 đặc
(C) Ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử vanilin/ethanol/ H2SO4 đặc
Sắc ký đồ tinh dầu quả và lá sau khi phun TT cho thấy sự xuất hiện của nhiều vết khác nhau, với tinh dầu quả có ít nhất 14 vết và tinh dầu lá có ít nhất 15 vết Hai vết tương đồng được ghi nhận tại Rf = 0,26 và Rf = 0,39 Đặc biệt, tại Rf = 0,8, sắc ký đồ tinh dầu quả xuất hiện một vết lớn đáng chú ý.
Sắc ký khí kết hợp khối phổ tinh dầu
Thành phần hóa học của tinh dầu trong các bộ phận của cây Cam núi (Toddalia asiatica) được trình bày như trong bảng sau:
Bảng 3.2 Thành phần cấu tử tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu
STT Thành phần RI Tính toán
Từ kết quả ở bảng 3.2, các thành phần trong tinh dầu được phân chia theo các nhóm cấu trúc và trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 So sánh thành phần tinh dầu trong các bộ phận mẫu nghiên cứu
Nhóm chất Thành phần Quả (%) Lá
Không chứa oxy β-elemen 3,72 6,30 β-Selinen 4,26 3,55 α-selinen 1,53
Từ kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu cho thấy:
Tinh dầu mẫu nghiên cứu chủ yếu bao gồm các monoterpenoid và sesquiterpenoid Tinh dầu lá chứa ít nhất 20 cấu tử, trong khi tinh dầu quả có ít nhất 29 cấu tử Trong số đó, có 10 thành phần chung, bao gồm: α-pinen, camphen, β-pinen, β-myrcen, o-cymen, β-elemen, β-selinen, spathulenol, t-muurolol và α-cadinol.
- Ở mỗi loại tinh dầu có một số cấu tử với hàm lượng cao Cụ thể là:
+ Lá: Nerolidol (15,05%), spathulenol (12,85%), limonen (11,72%) + Quả: β-Phellandren (18,61%), germacren D (12,65%).
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu
Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu mẫu nghiên cứu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, μg/mL) Tinh dầu quả Tinh dầu lá
Chú thích: (-) không xác định (không biểu hiện hoạt tính tại nồng độ thử nghiệm)
Kết luận: Mẫu tinh dầu quả có biểu hiện hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn B subtilis và nấm men S cerevisiae
Mẫu tinh dầu lá có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn B subtilis, S aureus và nấm men S cerevisiae Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Gram (-), nấm mốc (2 chủng) và nấm men C albicans, tinh dầu này gần như không có tác dụng.
Bàn luận
Mẫu nghiên cứu đã được phân tích, mô tả cụ thể các đặc điểm hình thái, đặc biệt
