BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI HỒNG TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN LÁ CÂY HỒNG XIÊM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI HỒNG TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN LÁ CÂY HỒNG XIÊM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Vũ Văn Điền 2.ThS. Chử Thị Thanh Huyền Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược cổ truyền 2. Bộ môn Vi sinh-Sinh học HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Vũ Văn Điền – Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Chử Thị Thanh Huyền đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Cao Văn Thu đã giúp đỡ tôi thực hiện thử tác dụng kháng khuẩn. TS. Nguyễn Quốc Huy đã giúp đỡ tôi xác định tên khoa học của mẫu cây nghiên cứu. Các thầy cô giáo trong bộ môn Dược Cổ Truyền, Đại học Dược Hà Nội. Cảm ơn nhà trường đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài. Cảm ơn gia đình bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2014 Sinh viên Bùi Hồng Tài MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 2 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Manilkara 2 1.1.2. Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae) 2 1.1.3. Đặc điểm chi Manilkara 2 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây hồng xiêm 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY HỒNG XIÊM 4 1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC 5 1.4. TÍNH VỊ, CÔNG NĂNG 6 1.5. CÔNG DỤNG 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8 2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 8 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 8 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 8 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10 2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10 2.2.2. Nghiên cứu về hóa học 10 2.2.3. Thử tác dụng kháng khuẩn 10 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10 2.3.2. Nghiên cứu về hóa học 10 2.3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn 11 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA 12 3.1. NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 12 3.1.1. Đặc điểm dược liệu lá cây hồng xiêm 12 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá 12 3.1.3. Đặc điểm bột lá 13 3.2. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 14 3.2.1. Định tính các nhóm chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 14 3.2.2. Chiết xuất 21 3.2.3. Định tính các phân đoạn bằng SKLM 25 3.2.4. Phân lập chất từ cắn phân đoạn Ethyl acetat 31 3.3. THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN 39 3.3.1. Chuẩn bị 39 3.3.2. Tiến hành 40 3.4. BÀN LUẬN 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây hồng xiêm có nguồn gốc từ Nam Mỹ, chủ yếu ở Mêhicô. Hiện nay được di thực vào nhiều nước nhiệt đới. Ở châu Á, hồng xiêm được trồng nhiều nhất tại Thái Lan, Philippin, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Campuchia, Việt Nam [14]. Ở Việt Nam, chủ yếu được trồng ở miền Nam, nhưng ở miền Bắc cũng được trồng ở nhiều nơi. Cây trồng chủ yếu để lấy quả. Nhựa chiết từ vỏ và quả hồng xiêm sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm, lá cây hầu như không được sử dụng [14], [11]. Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về cây hồng xiêm rất hạn chế đặc biệt nghiên cứu về lá cây hầu như chưa có. Tuy nhiên ở nước ngoài có khá nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của lá cây. Với mục đích nghiên cứu để tìm hiểu khả năng khai thác và sử dụng lá cây hồng xiêm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng xiêm ” được thực hiện với một số mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu và bột lá cây hồng xiêm. 2. Nghiên cứu các nhóm chất và phân lập chất từ lá cây hồng xiêm. 3. Thử hoạt tính kháng khuẩn lá cây hồng xiêm. Để thực hiện những mục tiêu đã đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây hồng xiêm thu hái ở Nghệ An: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá, đặc điểm bột lá. 2. Xác định các nhóm chất có trong lá cây và các phân đoạn dịch chiết bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng. 3. Định lượng sơ bộ khối lượng các phân đoạn. 4. Định hướng phân lập chất sạch từ phân đoạn ethyl acetat. 5. Thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết toàn phần. 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Manilkara Cây hồng xiêm có tên khoa học là Manilkara zapota (L.) P.Van Royen [5]. Tên đồng nghĩa: Achras zapota L. [5]. Tên nước ngoài: Sapota, sapodilla plum (Anh), sapotier, sapotillier (Pháp) [14],[17]. Chi Manilkara, họ Hồng xiêm (Sapotaceae), bộ Hồng xiêm (Sapotales), phân lớp Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc lan (Magnolisida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta). Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnolisida) Phân lớp Sổ (Dilleniidae) Bộ Hồng xiêm (Sapotales) Họ Hồng xiêm (Sapotaceae) Chi Manilkara [5], [1]. 1.1.2. Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae) Họ Hồng xiêm hay còn gọi là họ Xabôchê [8], [1]. Cây gỗ, lá đơn, thường mọc cách, không có lá kèm hay lá kèm nhỏ rụng sớm. Cây thường có mủ trắng, hoa lưỡng tính, cánh hoa thường có phần phụ ở bên hay ở lưng, vòng nhị ngoài thường là nhị lép. Hoa thành bó, bộ nhị gồm 2-3 vòng, bộ nhụy gồm 4-12 lá noãn, quả mọng, hạt có nội nhũ dầu [1], [6]. Ở Việt Nam có 16 chi, trên 40 loài [1]. 1.1.3. Đặc điểm chi Manilkara Chi Manilkara gồm xấp xỉ 79 loài phân bố khắp các vùng nhiệt đới (30 loài ở Nam và Trung Mỹ, 35 loài ở châu Phi và 14 ở Đông Nam Á) [15]. Cây gỗ, lá đơn, thường mọc cách, không có lá kèm hay lá kèm nhỏ rụng sớm. Cây thường có mủ trắng, hoa lưỡng tính, cánh hoa có phụ bộ ở lưng, tiểu nhụy bằng số cánh hoa, có tiểu nhụy lép. Hoa có 6 lá đài, 6 cánh hoa, hột dẹp, dài [8]. 3 Chi Manilkara có chứa triterpenes, saponin và flavonoid. Dịch chiết có hoạt tính kháng sinh, diệt ký sinh trùng, chống côn trùng có hại, kháng cholinesterase [18]. 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây hồng xiêm 1.1.4.1. Đặc điểm thực vật Ảnh toàn cây Cành mang hoa Quả Hạt Hình 1.1. Hình ảnh một số bộ phận cây hồng xiêm Cây to, cao 10-15m, phân cành nhiều [14], mủ trắng, vỏ xám nâu, lỗ bì tròn [5]. Cành và lá khi còn non được phủ lông tơ. Lá mọc gần nhau ở chót nhánh [5], mọc so le, dày và dai, hình trứng hoặc trái xoan, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, mặt trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt, gân phụ nhiều, xếp song song, đều đặn [14], cách nhau 4-6 mm [5]. Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, lưỡng tính màu vàng nhạt, đài 6 răng, xếp thành hai hàng, phủ lông màu vàng, tràng 6 cánh, nhị 6, nhị lép nhiều, bầu 10-12 ô [14], [5]. Quả mọng hình trứng, vỏ mỏng màu nâu, rốn kéo dài màu nâu nhạt và nháp, hạt dẹt, màu đen, nhọn ở hai đầu [14], [11]. Quả có đường kính 4-8 cm, chứa 2-5 hạt [30]. Mùa hoa: Tháng 5-8, mùa quả: Tháng 9-11 [14]. 4 1.1.4.2. Phân bố Cây có nguồn gốc Trung Mỹ và Nam Mỹ, chủ yếu ở Mêhicô [14], [19], [24], [31]. Hiện nay được di thực vào nhiều nước nhiệt đới. Ở châu Á, hồng xiêm được trồng nhiều nhất tại Thái Lan, Philippin, Malaysia, Indonesia, Srilanca, Ấn Độ, Campuchia và Việt Nam [14], [17]. Ở Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam, trừ vùng núi cao trên 1000m. Hồng xiêm là cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, với nhiệt độ thích hợp từ 24 đến 30˚C. Cây trồng ở các tỉnh phía Bắc có thể chịu được nhiệt độ dưới 10˚C về mùa đông. Cây không mọc được ở vùng khô hạn [14]. 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY HỒNG XIÊM Lá và vỏ thân chứa terpenoid, flavonoid, glycosid [21], [28].  Lá cây hồng xiêm chứa steroid, triterpenoid, terpenoid, phenol, coumarin, tanin, glycosid tim, saponin, anthraquinon [26], flavonoid (apigenin-7-O-α-L- rhamnosid, myricetin-3-O-α-L-rhamnosid [24]), acid béo trong đó acid béo không no chiếm 32,32% (thành phần chính là: acid oleic 13,95%, acid linoleidic 10,18% và acid linoleic 5,96%) [17], [24], acid oleanolic, lupeol acetat [17]), acid béo no chiếm 59,95% (acid palmitic 48,01%, acid stearic 8,3%), hydrocarbon chiếm 89,303% các hợp chất không xà phòng hóa, thành phần chính n-Triacontan 49,50% và n-octacosan 23,83%, 2 sterol (sitosterol 3,40%, stigmasterol 2,61%) [24].  Vỏ cây chứa 11,8% chất tanin [14], [17], [20], saponin và một lượng nhỏ alkaloid kết tinh gọi là sapotin [5] và chất nhựa mủ. Nhựa mủ khi cô đặc, khối lượng giảm còn 30-33%, có màu trắng sau chuyển thành màu đỏ hồng. Nhựa mủ chứa 44,8% chất nhựa, 17,2% carbohydrat, 3,4% chất gôm và 9% đường. Khi tinh chế chất nhựa mủ bằng cách rửa nhiều lần với kiềm mạnh, sau đó trung hòa và sấy khô, sẽ thu được một chất bột vô định hình, không tan trong nước [14].  Quả chứa carbohydrat, protein, chất béo, canxi, phosphor, sắt, acid ascorbic, fructose 4,47-7,13%, sucrose 1,48-8,75%, tổng số đường 11,14-20,43%, tinh bột 2,98%, tanin 3,16-6,45% [17], [24], [29], polyphenols (methyl chlorogentat, 5 dihydromyricetin, quercitrin, myricitrin, catechin, epicatechin, gallocatechin, gallic acid) [22].  Qủa hồng xiêm còn xanh và vỏ thân chứa chất dịch sữa, trong đó gôm chiếm 20-25% và nhiều tanin [14], [17]. Quả chín chứa 14% đường mà thành phần chủ yếu là sacharose, dextrose và levulose [17].  Hạt chứa 1% saponin và 0,08% sapotinin [14], [17], dầu béo và acid cyanhydric [14], alkaloid, phenol (Quercitol [20], [21]), flavonoid [27]. 1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC  Hoạt tính kháng khuẩn:  Vỏ thân và lá: Dịch chiết ethanol, methanol và nước có hoạt tính kháng khuẩn với 4 gram (+) (Bacillus subtilis BTCC19, Bacillus megaterium BTCC18, Bacillus cereus ATCC258 and Sarcina lutea ATCC27803), 5 gram (-) (Escherichia coli ATCC25922, Shigella sonnei ATTC8992, Shigella shiga ATCC27853, Shigella dysenteriae ATCC561 and Salmonella typhi ATCC14228 và 5 chủng nấm (Aspergillus flavus ACCT10558, Aspergillus fumigatus ATTC10231, Candida albicans ATTC25889, Vasianfactum sp ATTC235561, Fusarium sp ACCT56390) [21], [25], [28]. Dịch chiết methanol, ethanol có hoạt tính mạnh hơn dịch chiết nước [25], [28].  Hạt: Dịch chiết aceton có hoạt tính kháng khuẩn với Vibrio cholerae MTCC 3906, Salmonella paratyphi A, Shigella flexneri MTCC 1457, Staphylococcus epidermidis MTCC 435 [25], [28].  Hạ đường huyết: Dịch chiết nước và cồn của lá cây hồng xiêm giảm đáng kể nồng độ đường trong máu so với tác dụng của metformin. Tuy nhiên dịch chiết không thay đổi đáng kể nồng độ đường trong máu của những con chuột bình thường. Cơ chế hoạt động có thể tương tự của biguanid (metformin) [24], [28].  Hạ cholesterol: Dịch chiết nước và dịch chiết cồn lá làm giảm đáng kể mức độ cholesterol trong máu chuột gần với atorvastatin [24]. [...]... ký cột 2.2.3 Thử tác dụng kháng khuẩn  Thử tác dụng kháng khuẩn của 3 loại cao lỏng cồn ở 3 nồng độ 1:1, 1:2, 1:4 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật  Nghiên cứu đặc điểm hình thái: Quan sát, chụp ảnh, mô tả đặc điểm lá  Nghiên cứu đặc điểm vi học: - Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và bột lá theo tài liệu: [3], [4], [12] - Quan sát cấu tạo vi phẫu lá và bột lá bằng kính hiển... (Shi) - Proteus mirabilis BV 108 (Pro) 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật  Nghiên cứu đặc điểm bột và vi phẫu lá hồng xiêm  Mô tả đặc điểm dược liệu lá hồng xiêm 2.2.2 Nghiên cứu về hóa học  Định tính các nhóm chất chính trong lá cây hồng xiêm bằng phản ứng hóa học  Chiết phân đoạn, xác định hàm lượng các phân đoạn và định tính các phân đoạn dịch chiết bằng sắc ký lớp... thuốc chữa ho, giúp tiêu hóa hoặc làm thơm miệng [11], [28]  Lá sắc uống hàng ngày để giảm huyết áp [17], chữa ho, cảm lạnh, tiêu chảy [16] 8 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu  Mẫu nghiên cứu Mẫu tươi: Lá cây tươi rửa sạch, dùng làm vi phẫu và nghiên cứu đặc điểm thực vật Mẫu khô: Lá cây hồng xiêm sau khi làm sạch, được...  Tác dụng chống oxy hóa:  Dịch chiết ethanol, methanol, aceton và nước từ lá có tác dụng chống oxy hóa trên chuột Trong đó dịch chiết methanol tác dụng yếu, dịch chiết aceton có tác dụng chống oxy hóa mạnh [16]  Dịch chiết methanol, aceton, ethanol, ethyl acetat, nước của hạt hồng xiêm có tác dụng chống oxy hóa, trong đó dịch chiết cồn có tác dụng mạnh hơn ở cùng nồng độ [19] Tác dụng chống oxy hóa. .. của cây hồng xiêm chủ yếu do polyphenolic [16] (gallocatechin, catechin) [28]  Tác dụng diệt giun sán: Dịch chiết ethanol và chloroform phôi hạt hồng xiêm có tác dụng làm tê liệt và diệt giun sán (sau 8 và 23 phút với dịch chiết chloroform, sau 3,3 và 7 phút với dịch chiết ethanol (12,5 mg/ml) [24]  Tác dụng giảm đau : Dịch chiết methanol và ether dầu hỏa lá cây hồng xiêm với liều 200mg/kg có tác dụng. .. khuẩn Di: Đường kính vòng vô khuẩn SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song (n=3) Hình 2.1 Sơ đồ đặt khoanh giấy tẩm mẫu thử trên thạch Chú thích: 1: Mẫu cao lỏng 1:1 2: Mẫu cao lỏng 1:2 3: Mẫu cao lỏng 1:4 C: Kháng sinh chuẩn 12 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA 3.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 3.1.1 Đặc điểm dược liệu lá cây hồng xiêm Hình 3.1 Ảnh chụp lá cây hồng xiêm Lá. .. vi - Chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh 2.3.2 Nghiên cứu về hóa học - Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng theo tài liệu: [2], [3], [7], [10] - Phân lập các chất bằng sắc ký cột theo tài liệu [3] 11 2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng cồn 1:1, 1:2, 1:4 với các chủng vi khuẩn Gram (+),... Tán thành bột mịn dùng để soi bột - Xay thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo dùng để nghiên cứu hóa học và thử tác dụng kháng khuẩn  Nơi thu hái: Thanh Chương – Nghệ An  Thời điểm thu hái: 11/2013  Mẫu dược liệu được TS Nguyễn Quốc Huy – Bộ môn thực vật – Trường ĐH Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Manilkara zapota (L.) P Royen, họ Hồng xiêm (Sapotaceae) 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu. .. bột, uống với rượu [14], [19], [25], chữa mất ngủ [17] Liều cao gây độc và khó đái [14]  Vỏ cây có tác dụng kháng khuẩn, làm se, giải nhiệt và chữa tiêu chảy [25], [11], [19], [28], [16], ngày uống 6 đến 12g [11]  Nhựa chiết từ cây hồng xiêm có tên là chicle được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Nhựa lấy từ vỏ cây được gọi là chicle covent, nhựa thu từ quả gọi là chicle blanco hay... (7), mảnh mạch dẫn chứa tinh thể canxi oxalat (8) Hình 3.2 Ảnh chụp vi phẫu lá cây hồng xiêm dưới KHV Ghi chú : a Phiến lá: 8 Biểu bì dưới 9 Mô khuyết b Gân lá: 1 Biểu bì dưới 10 Mô dậu 11 Biểu bì trên 5 Libe 2 Mô dày 6 Gỗ 3 Mô mềm vỏ 7 Mô mềm ruột 4 Bó sợi chứa tinh thể 14 Hình 3.3 Ảnh chụp một số đặc điểm bột lá cây hồng xiêm Ghi chú: 1 Tinh thể canxi oxalat hình khối 2 Mảnh biểu bì 3 Mảnh mạch dẫn . nghiên cứu để tìm hiểu khả năng khai thác và sử dụng lá cây hồng xiêm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật  Nghiên cứu đặc điểm bột và vi phẫu lá hồng xiêm.  Mô tả đặc điểm dược liệu lá hồng xiêm. 2.2.2. Nghiên cứu về hóa học  Định. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI HỒNG TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN LÁ CÂY HỒNG XIÊM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ