ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là chồi cây giống nuôi cấy mô invtro cây cỏ ngọt M3
- Giai đoan tạo cây hoàn chỉnh được thực hiện trong phòng thí nghiệm NCM - TB thực vật, TTTHTN thuộc trường Đại học Vinh
- Các nghiên cứu trong giai đoạn huấn luyện thích nghi được tiến hành tại nhà lưới, TTTHTN thuộc trường Đại học Vinh
2.1.3 Thời gian nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2011 đến 4/2012.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IAA) đến quá trình phát sinh rễ (giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây (giai đoạn huấn luyện thích nghi)
- Theo dõi quá trinh sống của cây giống.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nhân giống vô tính in vitro bao gồm 4 giai đoạn, trong đó giai đoạn 1 là giai đoạn cấy mẫu cây, được coi là giai đoạn khó khăn nhất và có ý nghĩa quyết định cho toàn bộ quy trình Mục tiêu của giai đoạn này là tạo ra nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro.
Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:
- Mô tồn tại và sinh trưởng tốt
Kết quả của giai đoạn lấy mẫu phụ thuộc vào vị trí của các bộ phận như đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, đoạn thân, cành, mảng lá và rễ Để khử trùng mô nuôi cấy, hóa chất diệt vi sinh vật được sử dụng phổ biến, và hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng thâm nhập của chúng Để nâng cao hiệu quả của hóa chất diệt khuẩn, thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như Tween.
Để khử trùng mẫu cấy, các hóa chất như 20, Tween 80, fotoflo, teepol hoặc phối hợp với cồn 70° thường được sử dụng, với yêu cầu đảm bảo khả năng diệt vi sinh vật tốt và ít ảnh hưởng đến mô thực vật Các hóa chất phổ biến bao gồm HgCl, CaOCl2, NaOCl, và H2O2, trong đó NaOCl và CaOCl2 được ưa chuộng hơn do độc tính thấp và không ức chế sự sinh trưởng của mẫu Đối với những mẫu dễ bị hóa nâu khi nuôi cấy, có thể thêm than hoạt tính vào môi trường hoặc ngâm mẫu trong hỗn hợp axit ascobic và axit citric với nồng độ từ 25-150 mg/l trước khi cấy.
Ngoài các mẫu đã đề cập, việc sử dụng chất kháng sinh để khử trùng mẫu là rất hiệu quả Hai loại kháng sinh phổ biến là gentamixin và ampixilin, với liều lượng từ 50-100 mg/l Sau khi xử lý hóa chất, ngâm mẫu thực vật trong dung dịch chứa kháng sinh trong khoảng 30 phút sẽ tăng cường đáng kể hiệu quả của quá trình vô trùng mẫu cấy.
Chọn phương pháp khử trùng phù hợp sẽ tăng tỷ lệ sống sót, trong khi việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ thúc đẩy mẫu phát triển nhanh chóng.
Môi trường nuôi cấy thường dùng là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) b Giai đoạn 2: Nhân nhanh
Quá trình nhân giống in vitro tập trung vào việc tối ưu hóa hệ số nhân chồi, với giai đoạn nhân nhanh là then chốt Giai đoạn này kích thích mô nuôi cấy phát triển hình thái và gia tăng số lượng qua các phương pháp như hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Để đạt hiệu quả cao nhất, việc xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh phù hợp là rất quan trọng Thời gian cho giai đoạn này có thể kéo dài từ 10-36 tháng, nhưng cần tránh kéo dài quá lâu để hạn chế hiện tượng biến dị xoma do mẫu cấy chuyển nhiều lần Để nâng cao hệ số nhân chồi, cần bổ sung môi trường dinh dưỡng và các chất điều tiết sinh trưởng như auxin, xytokinin, giberelin, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ và ánh sáng thích hợp Giai đoạn cuối cùng là kích thích ra rễ để tạo ra cây in vitro hoàn chỉnh.
Môi trường nuôi cấy thường bổ sung một lượng nhỏ auxin, hormone thực vật quan trọng cho việc tạo rễ bất định, với các loại phổ biến như IAA, IBA, α-NAA và 2,4 D Giai đoạn này kéo dài từ 2-8 tuần Giai đoạn huấn luyện thích nghi là bước cuối cùng trong vi nhân giống, quyết định khả năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn Cây con cần được chuyển từ điều kiện vô trùng ra môi trường tự nhiên, đòi hỏi quá trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu để tồn tại và phát triển Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong đó cây cần được chăm sóc và bảo vệ khỏi các yếu tố bất lợi như mất nước, nhiễm khuẩn và nấm.
Trong giai đoạn này, nhiều loài cây có thể được chuyển từ chồi chưa ra rễ sang đất, nhưng phần lớn là cây hoàn chỉnh với đầy đủ rễ, thân và lá được đưa từ ống nghiệm ra đất Để đảm bảo sự phát triển tốt, giai đoạn này cần có giá thể chăm sóc phù hợp.
- Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định
- Có giá thể nhận cây in vitro thích hợp, đạt yêu cầu tơi xốp, thoát nước
Để đảm bảo sự phát triển của cây, cần duy trì độ ẩm cho cây sau khi đưa ra từ ống nghiệm Cần che chắn cây để giữ ẩm và tránh ánh sáng mạnh Độ ẩm của đất nên đạt từ 76 - 80%, trong khi độ ẩm không khí cần đạt từ 82 - 85%.
2.3.1 Kỹ thuật nhân giống in vitro
Vật liệu nghiên cứu được sử dụng là các chồi cây cỏ ngọt M3 nuôi cấy trong ống nghiệm, với các chồi có 2-3 cặp lá đồng đều, nhằm tạo ra cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi.
Nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nghiên cứu
2.3.1.2 Giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Để nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến sự ra rễ của chồi in vitro chúng tôi sử dụng các công thức với nồng độ như sau:
Trong nghiên cứu này, các nồng độ IAA được sử dụng là 1mg/l, 2mg/l, 3mg/l và 4mg/l trong môi trường nền bao gồm MS, 8g/l Agar, 30g/l sacaroza, 10% nước dừa và 2.5ml KI Đối chứng không bổ sung IAA để so sánh hiệu quả của các nồng độ khác nhau.
Các chỉ tiêm hình thái là:
- Số rễ trung bình/ cây - Chiều dài trung bình rễ/ cây Thời gian nghiên cứu của giai đoạn này là 4 tuần
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, theo dõi 10 bình mỗi lần, mỗi bình chứa 3-5 chồi, mỗi chồi có 2 mắt ngủ Điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn này bao gồm nhiệt độ 25 ± 2°C và độ ẩm thích hợp.
65-70 %; ánh sáng: 2000 - 2500 lux; Thời gian chiếu sáng là 12h/ngày
Môi trường cơ bản để nuôi cấy cở bản thường được sử dụng là môi trường Muarshine- skoog, 1962 (MS) có thành phần được nêu trong bảng sau:
Tổng số rễ Tổng số chồi theo dõi
Tổng chiều dài rễ Tổng số chồi theo dõi
Bảng 1.6 Thành phần môi trường nền MS được sử dụng trong NCM-TB thực vật [4],[10]
Hóa chất Nồng độ (mg/l) Đa lượng
Glycine Myo- inositol Nicotin acid Pyrodocine Thiamine
Các chất hữu cơ Saccarose
2.3.1.3 Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Khi các cây cỏ ngọt in vitro đạt tiêu chuẩn với mỗi chồi có 4-6 rễ và chiều dài trung bình từ 3-4cm, cây sẽ được đưa ra vườn ươm Trong giai đoạn này, chúng tôi sắp xếp các cây in vitro vào các loại giá thể khác nhau và chăm sóc trong cùng điều kiện để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sức sống của cây.
Các công thức giá thể được bố trí là:
CT3 là sự kết hợp giữa cát phù sa và đất thịt theo tỷ lệ 1:1 Điều kiện huấn luyện lý tưởng bao gồm độ ẩm không khí từ 80 đến 85%, độ ẩm giá thể từ 65 đến 80%, và nhiệt độ khoảng 25 ± 2°C Ngoài ra, cần bổ sung nguồn khoáng bằng dung dịch dinh dưỡng để đảm bảo sự phát triển tối ưu.
MS phun lên lá dưới dạng sương mù
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ cây sống - Độ tăng chiều cao - Số lá mới/cây - Hình thái cây, màu sắc lá
- Sự phát triển của rễ:
Thời gian của giai đoạn này là 4 tuần
2 3.2 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng toán xác suất thống kê trên phần mềm Microsoft Excel 2003
Chiều cao đo lần cuối cùng - chiều cao ban đầu
Số lá đếm được lần cuối - số lá ban đầu
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu giai đoạn ra rễ
IAA là hormone kích thích sự phát triển của rễ bất định Trong giai đoạn thí nghiệm, chúng tôi đã thêm IAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường nền để đánh giá tác động của nó.
Nghiên cứu sau 40 ngày cho thấy việc bổ sung các nồng độ khác nhau của IAA vào môi trường nhân giống cỏ ngọt đã ảnh hưởng đáng kể đến sự ra rễ và hình thái rễ của cây.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến thời gian ra rễ và khả năng ra rễ của cây cỏ ngọt in vitro (sau 6 tuần nuôi cấy)
40 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 ngày ra rễ số chồi ra rễ
Công thức Nồng độ IAA
Số chồi cấy Ngày bắt đầu ra rễ Số chồi ra rễ Tỷ lệ ra rễ
Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến thời gian và số chồi ra rễ của cây cỏ ngọt in vitro (sau 6 tuần nuôi cấy)
Theo dõi khả năng sinh trưởng rễ của chồi cây cỏ ngọt in vitro (sau 6 tuần nuôi cấy) chúng tôi thu được kết quả được trình bày ở bảng
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng sinh trưởng của rễ cây cỏ ngọt in vitro (sau 6 tuần nuôi cấy) Công thức
Số rễ Cây Độ dài rễ
(ĐC) CT1 CT2 CT3 CT4 số rễ cây độ dài rễ
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sinh trưởng của cây cỏ ngọt in vitro (sau 6 tuấn nuôi cấy)
Các công thức bổ sung IAA đã cho thấy số lượng rễ hình thành từ chồi in vitro nhiều hơn, đồng thời rễ cũng cứng và khỏe hơn so với công thức đối chứng, mặc dù chiều dài trung bình của rễ có ngắn hơn.
Thời gian bắt đầu ra rễ của các công thức thí nghiệm cho thấy sự khác biệt rõ rệt Công thức đối chứng có tỷ lệ cây ra rễ thấp nhất, với một số cây không ra rễ và thời gian ra rễ kéo dài đến 35 ngày, lâu hơn so với các công thức thử nghiệm chỉ từ 16 đến 28 ngày Đặc biệt, tất cả các công thức bổ sung IAA vào môi trường đều đạt tỷ lệ ra rễ 100%.
Nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung IAA vào môi trường nuôi cấy với nồng độ từ 1-4mg/l, thời gian ra rễ của chồi cây cỏ ngọt dao động từ 16 đến 28 ngày, cho thấy IAA có ảnh hưởng đến thời gian ra rễ Nồng độ IAA cao hơn dẫn đến thời gian ra rễ sớm hơn; đặc biệt, với nồng độ 4mg/l, thời gian ra rễ chỉ còn 16 ngày, nhanh hơn so với nồng độ 3mg/l (21 ngày) Tuy nhiên, khi xem xét số lượng rễ trên mỗi cây và chiều dài trung bình của rễ, CT3 với nồng độ 3mg/l lại cho số lượng rễ nhiều hơn so với CT4.
Công thức CT1 với nồng độ 1mg/l IAA cho thấy cây in vitro ra rễ sớm hơn so với công thức đối chứng, nhưng thời gian ra rễ vẫn tương đối chậm (28 ngày) và chỉ phát sinh rễ bất định sau 4 tuần Rễ mới ngắn và dễ đứt hơn so với công thức đối chứng, cho thấy nồng độ 1mg/l IAA vẫn còn thấp, dẫn đến khả năng kích thích ra rễ và phát triển rễ chưa đạt hiệu quả cao.
Nồng độ IAA 2mg/l trong công thức CT2 dẫn đến cây phát triển thấp và yếu, mặc dù số lượng rễ tăng lên, nhưng hình thái rễ không có nhiều khác biệt so với công thức 1 Điều này cho thấy 2mg/l IAA vẫn chưa phải là nồng độ tối ưu cho sự phát triển rễ của cây cỏ ngọt in vitro.
Công thức CT3 với nồng độ IAA 3mg/l cho hiệu quả kích thích ra rễ tốt hơn so với các công thức khác, giúp rễ phát triển nhanh, cây in vitro cao từ 6,2-6,8 cm, lá xanh đậm và dáng cây cứng đẹp Tất cả cây đều ra rễ sớm với trung bình 4,68 rễ/cây, đường kính rễ lớn hơn và đặc biệt ít bị đứt gãy khi chuyển ra vườn ươm Điều này chứng tỏ nồng độ 3mg/l IAA rất hiệu quả trong việc kích thích chồi cỏ ngọt in vitro ra rễ, tạo ra cây hoàn chỉnh.
Công thức CT4 với nồng độ 4mg/l IAA cho thấy chồi in vitro phát triển có bộ rễ lớn (35.91cm) nhưng lại yếu, dòn và dễ gãy, dẫn đến cây thấp và không khỏe mạnh Hình thái cây in vitro ở công thức này cũng thấp hơn, cho thấy nồng độ IAA cao đã ức chế khả năng sinh trưởng của chồi cây cỏ ngọt.
Như vậy theo chúng tôi, bổ sung vào môi trường dinh dưỡng 3mg/l IAA (CT3) là thích hợp nhất cho sự ra rễ của chồi cỏ ngọt in vitro
Cây invitro sau 1 tuần ra rễ Cây in vitro sau 3 tuần ra rễ
Cây in vitro ra rễ sau 4 tuần ra rễ Cây in vitro chuẩn bị ra vườn ươm
Hình 3.2 Chồi cỏ ngọt M3 in vitro trong giai đoạn ra rễ
Kết quả nghiên cứu giai đoạn thích nghi
Để khảo sát tác động của giá thể đối với sự sống còn của cây in vitro, chúng tôi đã thiết lập ba công thức giá thể khác nhau, tất cả đều được áp dụng trong cùng một điều kiện huấn luyện.
Cây con được chăm sóc theo các yêu cầu chặt chẽ về nhiệt độ, ánh sáng, gió,… Kết quả giai đoạn huấn luyện thích nghi được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của giá thể, dinh dưỡng đến sức sống của cây cỏ ngọt M3 in vitro
Số lá mới cây (lá)
Hình thái cây in vitro
Cây nhỏ, lá mỏng, xanh nhạt, dễ bị đổ, sinh trưởng chậm
Cây mập, khoẻ, lá to, dày, xanh, ít bị đổ và héo; sinh trưởng mạnh
Cây to, lá mỏng, xanh nhạt, sinh trưởng nhanh nhưng 1số cây hay bị héo, đổ non tỷ lệ sống
CT1: cát CT2: đất thịt
CT3: đất thịt+ cát tỷ lệ sống
Hình 3.3 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ của cây cỏ ngọt M3 in vitro
CT1: cát CT2: đất thịt
CT3: đất thịt+ cát số lá mới/ cây chiều cao cây
Hình 3.4 Ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cây cỏ ngọt M3 in vitro
Giá thể cát không phù hợp cho việc huấn luyện cây cỏ ngọt in vitro, với các chỉ tiêu đánh giá kém hơn so với các loại giá thể khác Cây cỏ ngọt in vitro rất nhạy cảm với độ ẩm của giá thể cát, mặc dù được phun nước thường xuyên, nhưng khả năng giữ ẩm của cát kém Điều này dẫn đến tình trạng cây bị thiếu nước, héo và đổ rạp Tỷ lệ sống sót của cây chỉ đạt 70,35%, chiều cao trung bình chỉ đạt 5,83 cm, với 4,14 lá mới/cây, trong khi bộ rễ phát triển nhanh nhưng yếu, làm giảm sức sống của cây.
Giá thể đất thịt nghiền mịn mang lại kết quả nghiên cứu vượt trội cho cây con với tỷ lệ sống và thích nghi đạt 94,3% Chiều cao cây đạt 7,20 cm, trung bình có 5,67 lá mới mỗi cây Mặc dù bộ rễ phát triển chậm ban đầu, nhưng sang tuần thứ hai, cây bắt đầu phát triển mạnh mẽ với đường kính thân lớn, lá dày, đẹp và màu xanh đậm, tạo nên dáng cây khỏe mạnh, tràn đầy sức sống.
Giá thể kết hợp giữa cát và đất thịt mang lại tỷ lệ sống cao cho cây, đạt 89,76%, với chiều cao trung bình là 6,76 cm Tuy nhiên, số lượng lá mới chỉ đạt 5,23 lá, thấp hơn so với giá thể đất thịt Cây phát triển lớn với lá mỏng và sinh trưởng nhanh, nhưng không có độ bóng đẹp như trong công thức 2.
Như vậy trong cùng một điều kiện huấn luyện, với độ ẩm không khí 80
Để huấn luyện thích nghi cây cỏ ngọt in vitro, giá thể phù hợp nhất là đất thịt với độ ẩm đạt 65 - 80% và nhiệt độ duy trì ở mức 25 ± 2 độ C Nguồn khoáng bổ sung cần sử dụng là dung dịch dinh dưỡng MS, trong đó độ ẩm cần đạt khoảng 85%.
Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi khuyến nghị hai giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống cỏ ngọt in vitro, bao gồm giai đoạn ra rễ và giai đoạn huấn luyện thích nghi.
Quy trình Điều kiện nuôi cấy
Giai đoạn vào mẫu, cấy gây
Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
Cây in vitro hoàn chỉnh
Giai đoạn huấn luyện thích nghi Cây in vitro
MS + 8g/l Agar + 30g/l saccaroza + 10% nước dừa + 3mg/l IAA +
2.5ml KI Thời gian ra rễ là là 4 tuần
Giá thể sử dụng để huấn luyện: Đất thịt Thời gian huấn luyện là 4 tuần
Lưu ý trong giai đoạn huấn luyện thích nghi cây cỏ ngọt
Cây in vitro khi chuyển từ môi trường nuôi cấy sang tự nhiên thường có sức đề kháng yếu do sự thay đổi đột ngột về điều kiện sống Để giúp cây con thích nghi, giai đoạn đầu cần tạo ra môi trường huấn luyện với độ ẩm và ánh sáng phù hợp, sau đó từ từ điều chỉnh các yếu tố này để cây có thể phát triển tốt hơn.
Cây cỏ ngọt in vitro là loại cây khó thích nghi với môi trường tự nhiên, dễ bị đổ gãy và nhạy cảm với độ ẩm Trong điều kiện độ ẩm trên 80%, cây dễ bị thối rữa, trong khi môi trường quá khô khiến cây héo và đổ rạp Do đó, việc che chắn và chăm sóc cây cần được thực hiện cẩn thận Khi tưới nước, nên phun sương để tránh làm cây con bị đổ.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu, chúng tôi xây dựng quy trình kỹ thuật in vitro trong nhân giống cỏ ngọt M3 như sau:
1 Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
Môi trường thích hợp cho chồi cỏ ngọt in vitro ra rễ là:
(MS + 8 g/l agar +30 g/l saccaroza +10% nước dừa +3mg/l IAA + 2.5ml KI)
Thời gian ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh là 4 tuần
Trong 3 giai đoạn nuôi cấy ở phòng thí nghiệm ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, các chồi cỏ ngọt in vitro được nuôi cấy trong điều kiện: nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm 65 - 70 %, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, và thời gian chiếu sáng là 12h / ngày
2 Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Giá thể lý tưởng cho việc huấn luyện cây cỏ ngọt in vitro là đất thịt nghiền mịn, với điều kiện môi trường bao gồm độ ẩm không khí từ 80 - 85%, độ ẩm giá thể từ 65 - 80%, và nhiệt độ duy trì ở mức 25 ± 2°C Để cung cấp nguồn khoáng bổ sung, dung dịch dinh dưỡng MS nên được phun lên lá dưới dạng sương mù.
Thời gian của giai đoạn này là 4 tuần
B Đề nghị Đề tài cần được nghiên cứu mở rộng để đánh giá vai trò sinh lý của các chất điều tiết sinh trưởng khác đối với nhân giống invitro cây cỏ ngọt để xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống invitro loại cây có giá trị kinh tế cao và mang lại nhiều lợi ích này.