LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo Th.s Phạm Thị Như Quỳnh, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào hướng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp quý báu thầy cô giáo môn sinh lí – sinh hố, tạo điều kiện ủng hộ cán phịng thí nghiệm Ni cấy mơ – tế bào thực vật Cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trình thực đề tài Lần tham gia nghiên cứu khoa học không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn bè để đề tài nghiên cứu tơi hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng năm 2012 Sinh viên thực Lê Thị Mai MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I: Tổng quan tài liệu 1.1 Tìm hiểu chung khoai lang 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố khoai lang 1.1.2 Đặc điểm thực vật khoai lang 1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh khoai lang 11 1.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống khoai lang công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro giới ở Việt Nam 12 1.2.1 Trên giới 13 1.2.2 Ở Việt Nam 14 Chương II: Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 17 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 17 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Quy trình nghiên cứu 17 2.3.2 Vật liệu khởi đầu 18 2.3.3 Giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh 18 2.3.4 Giai đoạn huấn luyện thích nghi 19 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 19 Chương III Kết nghiên cứu thảo luận 21 3.1 Kết nghiên cứu giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh 21 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn huấn luyện thích nghi 28 3.3 Một số lưu ý quá trình nhân giống khoai lang Nhật Beniazuma 31 3.3.1 Vô trùng 31 3.3.2 Giai đoạn ở phịng thí nghiệm 32 3.3.3 Giai đoạn huấn luyện thích nghi 32 Kết luận đề nghị 33 A Kết luận 33 B Đề nghị 33 Tài liệu tham khảo 34 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN BA : Benzyl Adenine BAP : 6- benzylamino purin CT : Công thức CT ĐC : Công thức đối chứng Chất ĐTST : Chất điều tiết sinh trưởng IAA : Axít Indolylacetic In vitro : (điều kiện) nuôi cấy nhân tạo MS : (Môi trường) Marashige & Skoog 1962 mg : milligam NCM – TB : Nuôi cấy mô – tế bào SPFMV : Sweetpotato feathery motte virus α-NAA : Naphthylacetic axit 2,4-D : Dichlorophenory Acetic Acid DANH MỤC BẢNG SỔ LIỆU, BIỂU ĐỒ, HÌNH VẼ Bảng 1: Ảnh hưởng IAA đến thời gian rễ khả rễ chồi khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) Bảng 2: Ảnh hưởng IAA đến khả sinh trưởng rễ khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) Bảng 3: ảnh h-ởng cỏc giá thể đến sức sèng cđa c©y khoai lang in vitro ở giai đoạn vườn ươm (sau tuần thích nghi) Biểu đồ : Ảnh hưởng IAA đến thời gian rễ chồi khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy ) Biểu đồ : Ảnh hưởng IAA lên rễ chiều dài rễ chồi khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) Biểu đồ 3: Ảnh hưởng các giá thể đến sức sống khoai lang in vitro giai đoạn vườn ươm (sau tuần thích nghi) Hình 1: Chồi khoai lang in vitro sau tuần rễ Hình 2: Chồi khoai lang in vitro sau tuần rễ Hình 3: Cây khoai lang in vitro trước đưa vườn ươm Hình 4: Cây khoai lang in vitro sau tuần thích nghi ngồi vườn ươm Hình 5: Cây khoai lang in vitro sau tuần thích nghi ngồi vườn ươm Hình 6: Cây khoai lang in vitro sau tuần thích nghi ngồi vườn ươm ĐẶT VẤN ĐỀ Cây khoai lang (Ipomoea batatas L), thuộc giới thực vật (Plantea), lớp hai lá mầm (Magnoliopsida), Cà (Solanales), họ Bìm Bìm (Convolvulaceae), chi khoai lang (Ipomoea), có củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ) trồng rộng rãi ở nhiều vùng khác giới Châu Á, Châu Phi Châu Mỹ La Tinh Ở Việt Nam, khoai lang lương thực truyền thống đứng thứ ba sau lúa, ngô Khoai lang với thời gian sinh trưởng ngắn, có khả thích ứng rộng, trồng ở khắp nơi nước từ Đồng đến miền núi Duyên Hải Miền Trung… Khoai lang cịn trồng ở nhiều vùng sinh thái chân đất khác Trong số các lương thực, có củ giữ vai trị quan trọng sản xuất lương thực ở nước nông nghiệp nghèo, chậm phát triển (Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc, 2004) Đặc biệt năm mùa hạn hán hay ở vùng sản xuất khó khăn, khoai lang chủ lực giải lương thực thức ăn gia súc Tại số vùng sinh thái có điều kiện đặc biệt khoai lang xếp ngang hàng chí cịn cao lúa nói khoai lang chủ lực, củ khoai lang sử dụng khá đa dạng Theo số liệu thống kê Tổ chức Lương Thực Nông Nghiệp Liên Hợp Quốc, giới 77% khoai lang sử dụng làm lương thực, 13% làm thức ăn gia súc, 3% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác như: luộc để ăn sáng, làm mứt, làm bánh kẹo, nước giải khát, rượu, làm thuốc, dùng thay cho bột mì để làm bánh bích qui Phần loại bỏ chiếm 6% (FAO, Horton, 1988) phần thân lá vừa sử dụng làm rau xanh cho người đồng thời nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi gia súc Tuy nhiên suất khoai lang thấp bấp bênh sử dụng giống thoái hóa dẫn đến nguồn giống chưa đáp ứng chất lượng số lượng, quan tâm đến biện pháp canh tác, sâu bệnh Hiện giống khoai lang Nhật tiếng chất lượng cao thích nghi điều kiện ở Việt Nam trở thành đối tượng nghiên cứu thời Từ thực tế này, vấn đề đặt cần có hệ thống hoàn chỉnh liên tục để nhân giống, lưu trữ, phục tráng giống nhân nhanh giống mới, đảm bảo hiệu quả, an toàn, đáp ứng yêu cầu sản xuất Nuôi cấy mô tế bào in vitro công nghệ đại cho phép sản xuất giống bệnh với quy mô lớn, cung cấp giống với số lượng lớn cho sản xuất thời gian ngắn nhất, giống hệt bố mẹ các đặc tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng lớn, thể tính ưu việt so với các phương pháp nhân giống truyền thống khác Xuất phát từ vấn đề trên, để tìm hiểu nghiên cứu sâu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt nghiên cứu việc nhân nhanh giống khoai lang cơng nghệ in vitro góp phần cung cấp liệu hồn thiện cơng nghệ nhân nhanh giống khoai lang để có nguồn giống tốt, đảm bảo số lượng chất lượng cho người dân, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng kỹ thuật tạo hoàn chỉnh huấn luyện thích nghi giống khoai lang Nhật Beniazuma” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: Góp phần hồn thiện quy trình nhân giống khoai lang Beniazuma phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật, phục vụ cho cơng tác trì sản xuất giống khoai lang chất lượng cao để cung ứng cho sản xuất NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI : Thử nghiệm tìm điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho các giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh huấn luyện thích nghi giống khoai lang Beniazuma CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung khoai lang 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố khoai lang a Nguồn gốc: Khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên Dấu tích củ khơ tồn lâu khám phá Caves Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1977) Người ta tìm thấy diện khoai lang vùng Mayan Trung Mỹ Astin (1977) giả thuyết có hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang Guatamala nam Peru Trong số cơng trình khác đa dạng loài khoai lang cao ở Colombia, Equador nam Peru.[2] Khoai lang khám phá bởi Christophe Columbus thám hiểm tìm châu Mỹ năm 1492 Ông đưa vào Tây Ban Nha gọi khoai tây Tây Ban Nha, sau gọi khoai lang Khoai lang mở rộng theo hai đường: Con dường từ Tây Ban Nha giới thiệu vào châu Âu sau truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ Tây Ấn Con đường khác người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines vào khoảng năm 1521, sau tiếp tuc đưa đến châu Phi Khoai lang đưa Trung Quốc từ Philippines xuất ở Phúc Kiến năm 1594 Con đường khác vào Trung Quốc người Tây Ban Nha, đưa vào vùng Combatfami năm 1674 Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615 Khoai lang tiếp tục đưa vào Malaysia các nước Nam Á, Đông Nam Á.[2] Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại “Thực vật thảo”, “Lĩnh nam tạp kỳ” “Quảng Đông tân ngữ” Lê Quý Đơn khoai lang du nhập vào nước ta từ Philippines vào khoảng cuối đời Minh cai trị Cây trồng phạm vi rộng vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam lên tới độ cao 2.300m so với mặt nước biển b Phân bố : - Trên giới : Ngày nay, khoai lang trồng rộng khắp khu vực nhiệt đới ôn đới với lượng nước đủ để hỗ trợ phát triển Theo thống kê FAO năm 2004 sản lượng tồn giới 127 triệu Phần lớn Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu diện tích trồng khoảng 49 000km2 Sản lượng lớn đầu người quốc gia mà khoai lang lương thực phần ăn quần đảo Solomon với 160/kg/người/năm Bắc Carolina, bang đứng đầu Mỹ sản xuất khoai lang, năm cung cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm cho quốc gia Mississipi bang chủ lực việc trồng khoai lang, khoai lang trồng diện tích khoảng 8.200 mẫu Anh Khoai lang từ Mississipi đóng góp khoảng 19 triệu USD vào kinh tế bang có khoảng 150 trang trại ở thành phố trồng khoai lang - Ở nước ta : Khoai lang trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt đồng ven biển Đây loại có củ quan trọng, có khả thích ứng mạnh, tương đối sâu bệnh, trồng nhiều loại đất khác Khoai lang trồng nhiều vụ năm, dễ trồng, cho suất cao, tương đối ổn định Khoai lang trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc, Đồng Sơng Hồng, Đồng Sông Cửu Long… 1.1.2 Đặc điểm thực vật khoai lang : * Rễ: Khoai lang sau trồng 3-4 ngày mọc rễ mới, điều kiện khô hạn nhiệt độ ẩm độ thấp khoai mọc rễ non chậm Rễ mọc ở các đốt thân đất Mỗi đốt có khả rễ 15-20 rễ, thường có 5-10 rễ phân hóa thành rễ dày có hội thành củ.[1] * Thân : Thân khoai lang có dạng bị hay nửa đứng, thân phổ biến màu xanh, tím xanh tím Thân có nhiều đốt với chiều dài lóng khác Ở mắt đốt mọc rễ phụ Độ dài đốt phụ thuộc vào giống Căn vào độ dài thân người ta chia làm hai loại: loại thân dài khoảng 2-5m, loại ngắn 0,5-1m.Thân phát triển dài ngắn ngồi yếu tố giống cịn phụ thuộc vào chế độ mưa, loại đất, phân bón.[1] * Lá : Lá khoai lang lá đơn, mọc cách, mặt lá gồm cuống lá phiến lá Cuống dài 6-20cm, có lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên khoảng khơng gian điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng để lá sử dụng ánh sáng tối đa, khắc phục nhược điểm thân bò mặt đất Những giống nhiều nhánh cuống lá to, dài có suất chất xanh cao Màu sắc cuống lá giống qui định Đa số các giống khoai lang có cuống màu xanh, số khác có màu tím nhạt, tím.[1] * Hoa : Hoa khoai lang mọc ở nách lá ngon thân, hoa hình chng có cuống dài Hoa mọc chùm hay riêng rẽ Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớt hồng, bên có nhiều lông tơ tuyến mật hấp dẫn côn trùng Một hoa gồm nhị đực nhụy cái, nhị đực thấp nhụy cái.[1] * Quả hạt : Quả khoai lang thuộc sóc hình trịn màu nâu đen, sau thụ tinh đến hai tháng chín cịn tùy thuộc giống mùa vụ Một có từ 1đến hạt, hạt có vỏ cứng, dễ bị rụng chín.[1] Khoai lang Nhật Beniazuma có đặc điểm thực vật giống các khoai lang khác có số đặc điểm để phân biệt là: 10 Các cơng thức giá thể bố trí : + CT1 : Cát + CT2 : Đất thịt + trấu hun, tỷ lệ 1:1 + CT3 : Cát + đất thịt, tỷ lệ 1:1 - Điều kiện huấn luyện : + Độ ẩm khơng khí : 80-85% + Độ ẩm giá thể : 65-80% + Nhiệt độ : 20-280C + Nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh dưỡng 1/2MS phun lên lá dạng sương mù - Các tiêu theo dõi : Số sống Số theo dõi x 100% - Tăng trưởng chiều cao (cm): Chiều cao đo lần cuối - Chiều cao ban đầu (cm) = Số theo dõi Số lá đếm lần cuối - số lá ban đầu - Số lá mới/cây (lá) = Số theo dõi - Hình thái cây, màu sắc lá - Tỷ lệ sống (%) = - Sự phát triển rễ -Thời gian nghiên cứu giai đoạn tuần 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý toán xác suất thống kê phần mềm microsoft Excel 2007 20 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ NGHIấN CU V THO LUN 3.1 Kết nghiên cứu giai đoạn rễ tạo hoàn chỉnh AA loại Auxin có tác dụng kích thích hình thành rễ bất định Trong giai đoạn này, bố trí công thức thí nghiệm bổ sung thêm vi nồng độ ln lt l: 0,2 (mg/l); 0,4 ( mg/)l; 0,6 (mg/l); 0,8 (mg/l) vào môi tr-ờng (MS + g/l agar +30 g/l saccaroza + 10% n-íc dõa + 10mg/l than ho¹t tÝnh + 100mg/l Myo innositol) Kết thí nghiệm sau tuần đ-ợc thể hiƯn ë b¶ng sau: Bảng 1: Ảnh hưởng IAA đến thời gian rễ khả rễ chồi Khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) Số chồi cấy (Chồi) Ngày bắt đầu rễ (Ngày) Số chồi rễ (Chồi) Tỷ lệ rễ (%) CT ĐC ( 0mg/l IAA ) 60 18 40 66,67 CT1 (0,2mg/l IAA) 60 14 60 100 CT2 (0,4mg/l IAA) 60 10 60 100 CT3 (0,6mg/l IAA) 60 60 100 CT4 (0,8mg/l IAA) 60 60 100 Công thức Biểu đồ 1: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến thời gian rễ chồi khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) 21 Kết nghiên cứu ở bảng đồ thị cho thấy : - Về tiêu tỷ lệ rễ các công thức, kết nghiên cứu cho thấy có CT ĐC cho tỷ lệ rễ thấp sau tuần ni cấy đạt 66,67% Cịn công thức bổ sung IAA tỷ lệ rễ đạt 100% - Về thời gian bắt đầu rễ các cơng thức thí nghiệm, chúng tơi thấy thời gian bắt đầu rễ ở các công thức có sai khác Cụ thể : Cơng thức đối chứng, các chồi khoai lang hình thành rễ sau 18 ngày, chí có chồi sau tuần ni cấy khơng hình thành rễ Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 0,2- 0,8 mg/l IAA thời gian rễ các chồi khoai lang biến động từ 7-14 ngày điều chứng tỏ có mặt IAA có tác động tới thời gian rễ khoai lang invitro, IAA kích thích rễ sớm so với cơng thức đối chứng Qua nghiên cứu thấy bổ sung vào môi trường nồng độ IAA ở các công thức tăng 0,2mg/l : 0,4mg/l : 0,6mg/l : 0,8mg/l số ngày rễ tương ứng 14 : 10 : : (ngày) Đặc biệt tăng nồng độ lên đến 0,8mg/l số ngày rễ không giảm mà tăng lên ngày có 13-14 ngày 22 bắt đầu rễ Điều chứng tỏ nồng độ IAA mơi trương quá cao ức chế khả rễ các chồi khoai lang in vitro Trong các công thức bổ sung IAA, nhận thấy công thức (0,6mg/l IAA) đánh giá tối ưu Như : Môi trường bổ sung 0,6mg/l IAA các chồi khoai lang in vitro rễ sớm tỷ lệ rễ đạt cao Theo dõi khả sinh trưởng rễ chồi khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) thu kết trình bày ở bảng sau: Bảng : Ảnh hưởng IAA đến khả sinh trưởng rễ khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) Công thức CT ĐC (0mg/l IAA) CT (0,2mg/l IAA) CT (0,4mg/l IAA) CT (0,6mg/l IAA) CT (0,8mg/l IAA) Số chồi cấy Số rễ/chồi Chiều dài Hình thái rễ rễ/chồi(cm) 60 0,45 1,32 Trắng đục, rễ tù, rễ bên Yếu 60 2,12 2,67 Trắng đục, rễ tù, rễ bên Yếu 60 4,00 7,48 Trắng, mập, ngắn, rễ bên trung bình 60 5,63 11,02 Trắng, mập, dài, nhiều rễ bên Tốt 60 4,48 8,46 Trắng, mập, ngắn, nhiều rễ bên Khá 23 Chất lượng rễ Trung bình Biểu đồ : Ảnh hưởng IAA lên rễ chiều dài rễ chồi khoai lang in vitro (sau tuần nuôi cấy) Trong công thức có bổ sung , số rễ hình thành từ chồi in vitro nhiều hơn, cứng khoẻ so với công thức đối chứng - Công thức 1: Nồng độ 0,2mg/l IAA: chồi in vitro thấp yếu, rễ có mu trng c, ngắn, yếu, u r tự Xét hình thái, khoai lang in vitro công thức còi cọc, xanh nhạt phớt vàng Điều này, chứng tỏ nồng độ AA môi tr-ờng thấp, ch-a đủ để kÝch thÝch sù rƠ cđa chåi khoai lang in vitro - Công thức 2: Nồng độ mg/l IAA cho cõy khe, lỏ xanh, s l-ợng, chiu di rễ tăng nh-ng đặc điểm hình thái rễ khác nhiều so víi c«ng thức 1; số lượng rễ vấn ít, ngắn, đường kính nhỏ nên cơng thức chưa tối u nht - Công thức 3: Nồng độ mg/l IAA cho hiệu kích thích rễ tốt so với công thức khác công thức này, rễ phát triển t-ơng đối nhanh, in 24 vitro cao khe, xanh đậm, dáng cứng đẹp Tất phát sinh rễ sớm, số l-ợng rễ nhiều, đ-ờng kính rễ to so với công thức lại; đặc biệt rễ bị đứt gÃy trình đ-a v-ờn -ơm §iỊu nµy chøng tá, nång độ 0,6mg/l IAA cã hiƯu qu¶ cao viƯc kÝch thÝch chåi in vitro rễ, tạo hoàn chỉnh - Công thức 4: Sử dụng nồng độ 0,8mg/l IAA cho kết in vitro sinh trưởng chậm, rễ yếu, dễ gãy đưa vườn ươm Số lượng, chiều dài trung bình rễ giảm so với CT3 Nång ®é 0,8mg/l IAA cao đà ức chế khả rễ chồi khoai lang Nh- vËy, theo chóng t«i, bỉ sung 0,6mg/l IAA vào môi tr-ờng nn l thích hợp cho rƠ cđa chåi khoai lang in vitro 25 Hình : Chồi khoai lang in vitro sau tuần rễ Hình : Chồi khoai lang invitro sau tuần rễ 26 CT CT CT3 CT4 Hình 3: Cây khoai lang invitro trước a m 27 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn huấn luyện thích nghi Để nghiên cứu ảnh h-ởng giá thể đến sức sống in vitro, bố trí công thức giá thể khác với điều kiện huấn luyện là: - Độ ẩm không khí 80 - 85% - Độ ẩm giá thể 65 - 80% - Nhiệt độ : 25 ± 20C - Nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh dưỡng 1/2MS phun lên lá dạng sương mự C ngy phun ln Cây đ-ợc chăm sóc theo yêu cầu chặt chẽ nhiệt độ, ánh sáng, gió, Kết giai đoạn huấn luyện thích nghi đ-ợc trình bày bảng Bảng 3: ảnh h-ởng cỏc giá thể đến sức sống c©y khoai lang in vitro giai đoạn vườn ươm (sau tun thớch nghi) Số Công thức gi¸ thĨ Tû lƯ Sè mÉu sèng (%) tăng míi chiu cao/cõy (lá) (cm) Hình thái ex vitro Cây mập, khoẻ, mng, xanh nht Sinh CT1: Cát 60 80,20 3,17 1,67 trưởng nhanh hay bị héo, non CT2:( tht t +tru Cây nhỏ, mỏng, xanh 60 68,00 2,42 2,08 tr-ëng chËm hun)=(1:1) CT3: C©y mp, khe Lỏ to, (Đt tht + cát) nhạt, dễ bị đổ, sinh 60 96,43 dy, xanh, ớt b 3,50 = (1:1) 2,51 héo mạnh 28 Sinh trưởng Biểu đồ 3: Ảnh hưởng giá thể đến sức sống khoai lang in vitro giai đoạn vườn ươm (sau tuần thích nghi) - Gi¸ thĨ t tht +tru hun t l 1:1 không thích hợp ®Ĩ hn lun thÝch,các tiêu đánh giá tương đối thp giá thể ny, khoai lang in vitro nhạy cảm với độ ẩm giá th sau thời gian ngắn cõy bị héo, đổ rạp Tỷ lệ sống đạt 68%, tng chiều cao đạt 2,08cm, trung bình có 2,42 mới/cây, rễ phát triển yếu, sức sống - Đối với giá thể cỏt: Cac ch tiờu anh gia tng i cao Tỷ lệ sống thích nghi với môi tr-ờng đạt 80,20%, tng chiều cao đạt 1,67cm; số mới/cây trung bình 3,17; Cây to, mỏng, sinh tr-ởng t-ơng đối nhanh nh-ng không bóng đẹp, cõy cao nhng d b sp - Đối với giá thể hỗn hợp t tht +cỏt t l 1:1 tiêu nghiên cứu cao hẳn so với giá thể khác, tỷ lệ sống cao 96,43% chiều cao trung bình 2,51cm; số 3,5 lá, rễ thời gian đầu phát 29 triển chậm nh-ng sang tuần thứ phát triển mạnh, đ-ờng kính thân to, dày, đẹp, màu xanh đậm Dáng khoẻ mạnh, đầy sức sống Nh- điều kiện huấn luyện, với độ ẩm không khí 80 85%; độ ẩm giá thể 65 - 80%; nhiệt độ: 23 20C; nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh d-ỡng MS giá thể thích hợp ®Ĩ hn lun thÝch nghi khoai lang in vitro đất thịt + cát tỷ lệ 1:1 Hình : Cây khoai lang in vitro sau tuần huấn luyện thích nghi Hình 5: Cây khoai lang in vitro sau tuần huấn luyện thích nghi 30 Giá thể cát Giá thể đất thịt +trấu hun (1:1) Giá thể đất thịt +cát (1:1) Hình 6: Cây khoai lang in vitro sau tuần huấn luyện thích nghi 3.3 Một số lưu ý trình nhân giống khoai lang Beniazuma phương pháp in vitro 3.3.1 Vô trùng Tất các khâu nuôi cấy trùng: dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) các thao nuôi cấy Sự thành công hay thất bại 31 nuôi cấy mô phụ thuộc vào cơng việc vơ trùng Nếu có khâu khơng vơ trùng mẫu ni cấy bị nhiễm vi sinh vật, nấm chết Khử trùng thực các dụng cụ sau: Nồi hấp, tủ sấy, phiễu lọc vơ trùng, hóa chất khử trùng Trước vào mẫu cần bật đèn UV 20 - 30 phút để khử trùng phịng ni cấy, đồng thời phải vệ sinh tay xà phòng các dụng cụ thí nghiệm phải xử lý cồn đốt 900 3.3.2 Giai đoạn phịng thí nghiệm Nhiễm khuẩn, nấm mốc khó khăn thường gặp quá trình nhân giống in vitro Các môi trường nuôi cấy giai đoạn yêu cầu phải vô trùng, có sơ suất kỹ thuật điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ẩm độ phịng) khơng đảm bảo làm cho bào tử nấm mốc rơi vào bình ni cấy Mơi trường dinh dưỡng bình tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển nhanh chóng, ảnh hưởng xấu đến mơi trường ni cấy Kết giai đoạn rễ tạo hoàn chỉnh phụ thuộc vào các chồi nuôi ống nghiệm các cụm chồi phải chồi khỏe, mập, có từ 2-3 3.3.3 Giai đoạn huấn luyện thích nghi Cây in vitro đưa từ bình ni ni cấy ngồi mơi trường tự nhiên để huấn luyện thường có sức đề kháng yếu (do thay đổi đột ngột từ môi trường nuôi cấy in vitro với đầy đủ chất dinh dưỡng, ẩm độ, nhiệt độ, ánh sáng ổn định điều kiện tự nhiên với nhiều biến động) Vì giai đoạn đầu quá trình huấn luyện, cần tạo điều kiện huấn luyện với chế độ giữ ẩm ánh sáng hợp lý, sau tự điều chỉnh để kịp thích nghi Các in vitro khó huấn luyện thích nghi ngồi tự nhiên, dễ bị gãy đổ thường nhạy cảm với ẩm độ môi trường, ẩm độ môi trường > 80%, bị thối rữa, môi trường quá khô bị héo đổ rạp, cần đảm bảo chặt chẽ việc che chắn chăm sóc Khi tưới nước, thiết phải phun nước dạng sương mù để tránh làm đổ 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, chúng tơi có số kết luận sau: Giai đoạn rễ, tạo hồn chỉnh Mơi trường rễ thích hợp cho chồi khoai lang Beniazuma invitro là: MS +8 g/l Agar + 30 g/l saccaroza + 10% nước dừa + 0,6mg/l IAA + 10mg/l than hoạt tính + 100mg/l Myo innositol Thời gian rễ tạo in vitro hoàn chỉnh tuần Điều kiện nuôi cấy là: 23 ± 20 C, ẩm độ 65 - 70%, cường độ ánh sáng 2000 2500 lux thời gian chiếu sáng 16 h/ngày Giai đoạn huấn luyện thích nghi Giá thể thích hợp để huấn luyện khoai lang in vitro cát + đất thịt tỷ lệ 1:1 Điều kiện huấn luyện thích nghi là: Độ ẩm khơng khí 80 - 85%, độ ẩm giá thể 65 - 80%, nhiệt độ 25 - 300C, nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh dưỡng 1/2 MS phun lên lá dạng sương mù Thời gian huấn luyện thích nghi tuần B Đề nghị Vì thời gian nghiên cứu có hạn, nên chúng tơi có số kiến nghị sau: - Nghiên cứu giai đoạn vào mẫu nhân nhanh để hoàn thiện qui trình nhân giống khoai lang Beniazuma nhân giống vơ tính invitro - Tiếp tục theo dõi khoai lang vườn sản xuất để đánh giá khả sinh trưởng, phát triển, khả hoa, suất, chất lượng, khả chống chịu - Nghiên cứu ảnh hưởng IBA, α-NAA, than hoạt tính đến khả rễ giống khoai lang Beniazuma để từ lựa chọn chất ĐTST thích hợp khả rễ giống khoai lang - Từng bước ứng dụng các kết nghiên cứu đề tài để cung cấp giống cho sản xuất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Đinh Thế Lộc cộng (1997) Giáo trình lương thực, tập (cây khoai lang), NXB Nơng nghiệp Hà Nội 2.Hồng Kim (2009) Bài giảng lương thực (phần 2), Trường Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), CNSH thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội 4.Mai Thạch Hoành (2006), Chọn tạo nhân giống có củ, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 5.Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật –Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội (2000), trang 9-54 Nguyễn Hồng Lộc – Lê Việt Dũng, Ni cấy mô tế bào thực vật, Viện Tài Nguyên Môi Trường Công nghệ Sinh Học, Đại học Huế Nguyễn Văn Uyển cs (2000), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, Trung tâm CNSH 8.Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc (2004), Cây có củ kỹ thuật thâm canh, (cây khoai lang), NXB Lao Động-Xã Hội, Hà Nội 9.Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Nhẫn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Kim Thanh (2007), Sinh lí thực vật ứng dụng, NXB Nơng Nghiệp 10 Vũ Văn Vụ (2003), Sinh lí học thực vật, NXB.Giáo dục Hà Nội 11 http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=334 12 http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1508/ 13.http://vi.southernfood.about.com/cs/sweetpotatoes/a/sweet_potatoes.htm 34 ... nhanh giống khoai lang để có nguồn giống tốt, đảm bảo số lượng chất lượng cho người dân, tiến hành nghi? ?n cứu đề tài: ? ?Nghi? ?n cứu xây dựng kỹ thuật tạo hoàn chỉnh huấn luyện thích nghi giống khoai. .. Kết nghi? ?n cứu thảo luận 21 3.1 Kết nghi? ?n cứu giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh 21 3.2 Kết nghi? ?n cứu giai đoạn huấn luyện thích nghi 28 3.3 Một số lưu ý quá trình nhân giống khoai lang. .. nghi? ?n cứu 17 2.1.1 Đối tượng nghi? ?n cứu 17 2.1.2 Địa điểm nghi? ?n cứu 17 2.1.3 Thời gian nghi? ?n cứu 17 2.2 Nội dung nghi? ?n cứu 17 2.3 Phương pháp nghi? ?n