Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Auxin (IAA) đến quá trình phát sinh hình thái rễ (giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây (giai đoạn huấn luyện thích nghi cây giống ).
- Theo dõi quá trình phát triển của cây giống.
2.3.1 Quy trình nhân giống in vitro
Quy trình nhân giống được chia thành bốn giai đoạn, trong đó giai đoạn đầu tiên, hay còn gọi là giai đoạn vào mẫu, là giai đoạn khó khăn nhất và có ý nghĩa quyết định đến toàn bộ quy trình Giai đoạn này cần phải đảm bảo các yêu cầu nhất định để đạt được hiệu quả cao trong quá trình nhân giống.
- Tỷ lệ chết thấp, tỷ lệ sống cao
- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt.
Trong giai đoạn nhân nhanh của mô thực vật, việc lựa chọn hóa chất như HgCl2, CaOCl2, NaOCl, H2O2 là rất quan trọng Nồng độ, thời gian xử lý và loại hóa chất cần được điều chỉnh phù hợp với từng loại mô thực vật để đạt hiệu quả tối ưu.
Giai đoạn nhân nhanh là giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro, nhằm tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất Để đạt được điều này, cần bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng như Auxin, Xytokinin, và Gibberelin vào môi trường dinh dưỡng, kết hợp với các yếu tố như nhiệt độ và ánh sáng phù hợp Thời gian cho giai đoạn này thường kéo dài từ 4 đến 8 tuần Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn ra rễ, nhằm tạo ra cây hoàn chỉnh.
Môi trường nuôi cấy thường được bổ sung một lượng nhỏ Auxin, nhóm hormone thực vật quan trọng trong việc tạo rễ bất định cho mô nuôi cấy, với các loại phổ biến như IAA, β-IBA, α-NAA, và 2,4-D Giai đoạn này kéo dài từ 2 đến 8 tuần Giai đoạn huấn luyện thích nghi là bước cuối cùng trong quá trình nhân giống in vitro, quyết định khả năng ứng dụng thực tiễn Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong đó cây cần được chăm sóc và bảo vệ khỏi các yếu tố bất lợi như mất nước, nấm, và vi khuẩn Cần có giá thể chăm sóc phù hợp, giữ ẩm cho cây, và khi đưa ra ngoài vườn ươm, cần che chắn để duy trì độ ẩm và tránh ánh sáng mạnh Độ ẩm đất cần đạt từ 76-80% và độ ẩm không khí từ 82-85%.
Vật liệu nghiên cứu bao gồm các chồi nuôi cấy trong ống nghiệm từ cụm chồi khoai lang Nhật Beniazuma, với chiều dài từ 5-7cm và có 2-3 lá đồng đều, được sử dụng để tạo ra cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi.
2.3.3 Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh:
- Để nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến sự ra rễ của chồi invitro chúng tôi sử dụng các công thức như sau:
- Để bổ sung và môi trường nền là (MS +8g/l Agar +30g/l saccaroza +10% nước dừa +10mg/l than hoạt tính +100mg/l Myo innositol).
Trong đó MS là môi trường nuôi cấy cơ bản, được sử dụng là môi trường Murashige – Skoog, 1962 [5]
Công thức đối chứng MS không bổ sung IAA.
-Các chỉ tiêu đánh giá là:
+ Số rễ trung bình/cây (rễ) + Chiều dài trung bình rễ/chồi (cm) - Thời gian nghiên cứu của giai đoạn này là 4 tuần.
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần theo dõi 10 bình, trong đó mỗi bình chứa từ 3 đến 5 chồi, và mỗi chồi có 2 mắt ngủ.
- Điều kiện nuôi cấy cho cả 3 giai đoạn trên là :
+ Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày.
2.3.4 Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Khi cây khoai lang in vitro đạt tiêu chuẩn hình thái với 4-6 rễ và chiều dài trung bình từ 8-11cm, cây khỏe mạnh và mập có thể được chuyển ra vườn ươm.
Trong giai đoạn nghiên cứu này, chúng tôi đã bố trí các cây khoai lang in vitro vào những loại giá thể khác nhau, đồng thời duy trì điều kiện chăm sóc và huấn luyện giống nhau Mục tiêu là để khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống và sức sống của cây khoai lang.
Các công thức giá thể được bố trí là :
Phương pháp nghiên cứu
+ CT2 : Đất thịt + trấu hun, tỷ lệ 1:1
+ CT3 : Cát + đất thịt, tỷ lệ 1:1
+ Nguồn khoáng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng 1/2MS phun lên lá dưới dạng sương mù
- Các chỉ tiêu theo dõi :
- Tăng trưởng chiều cao cây (cm):
- Số lá mới/cây (lá) - Hình thái cây, màu sắc lá.
- Sự phát triển của rễ
-Thời gian nghiên cứu của giai đoạn này là 4 tuần
2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng toán xác suất thống kê trên phần mềm microsoft
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Kết quả nghiên cứu giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
IAA là một loại Auxin quan trọng, giúp kích thích sự hình thành rễ bất định Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thiết lập các công thức thí nghiệm bổ sung để tối ưu hóa hiệu quả của IAA trong việc phát triển rễ.
với các nồng độ lần lượt là: 0,2 (mg/l); 0,4 ( mg/)l; 0,6 (mg/l); 0,8 (mg/l) vào môi trờng (MS + 8 g/l agar +30 g/l saccaroza + 10% nớc dừa + 10mg/l than hoạt tính + 100mg/l Myo innositol)
Kết quả thí nghiệm sau 4 tuần đợc thể hiện ở các bảng sau:
Bảng 1: Ảnh hưởng của IAA đến thời gian ra rễ và khả năng ra rễ của chồi Khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Ngày bắt đầu ra rễ (Ngày)
Số chồi ra rễ (Chồi)
Biểu đồ 1 : Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến thời gian ra rễ của chồi khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Kết quả nghiên cứu ở bảng 1 và đồ thị 1 cho thấy :
Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong các công thức thử nghiệm, chỉ có công thức ĐC có tỷ lệ ra rễ thấp nhất với 66,67% sau 4 tuần nuôi cấy Ngược lại, các công thức được bổ sung IAA đều đạt tỷ lệ ra rễ 100%.
Thời gian bắt đầu ra rễ của các công thức thí nghiệm có sự khác biệt đáng kể, cho thấy sự đa dạng trong quá trình phát triển của từng công thức.
Công thức đối chứng, các chồi khoai lang hình thành rễ đầu tiên sau 18 ngày, thậm chí có những chồi sau 4 tuần nuôi cấy vẫn không hình thành rễ.
Việc bổ sung IAA vào môi trường nuôi cấy với nồng độ từ 0,2-0,8 mg/l đã làm giảm thời gian ra rễ của chồi khoai lang xuống còn 7-14 ngày Điều này chứng tỏ rằng IAA có tác động tích cực đến quá trình ra rễ của cây khoai lang in vitro, kích thích sự ra rễ sớm hơn so với công thức đối chứng.
Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung IAA vào môi trường với các nồng độ 0,2mg/l, 0,4mg/l, 0,6mg/l và 0,8mg/l ảnh hưởng đến số ngày ra rễ, cụ thể là 14 ngày, 10 ngày, 7 ngày và 9 ngày tương ứng.
Nồng độ IAA trong môi trường cao tới 0,8 mg/l sẽ làm tăng thời gian ra rễ của chồi khoai lang in vitro, có thể kéo dài từ 9 đến 14 ngày Điều này cho thấy rằng nồng độ IAA quá cao có tác động ức chế khả năng ra rễ của cây.
Trong các công thức được bổ sung IAA, chúng tôi nhận thấy công thức 3 (0,6mg/l IAA) được đánh giá là tối ưu hơn
Như vậy : Môi trường nền bổ sung 0,6mg/l IAA các chồi khoai lang in vitro sẽ ra rễ sớm và tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất.
Theo dõi khả năng sinh trưởng rễ của chồi khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) chúng tôi thu được kết quả trình bày ở bảng sau:
Bảng 2 : Ảnh hưởng của IAA đến khả năng sinh trưởng của rễ khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức Số chồi cấy
Chiều dài rễ/chồi(cm)
Hình thái rễ Chất lượng rễ
IAA) 60 0,45 1,32 Trắng đục, rễ tù, rất ít rễ bên
IAA) 60 2,12 2,67 Trắng đục, rễ tù, ít rễ bên
IAA) 60 4,00 7,48 Trắng, mập, ngắn, rễ bên trung bình
IAA) 60 5,63 11,02 Trắng, mập, dài, nhiều rễ bên
IAA) 60 4,48 8,46 Trắng, mập, ngắn, nhiều rễ bên
Biểu đồ 2 : Ảnh hưởng của IAA lên sự ra rễ và chiều dài rễ chồi khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Trong các công thức có bổ sung , số rễ hình thành từ chồi in vitro đều nhiều hơn, cứng và khoẻ hơn so với công thức đối chứng.
Công thức 1 với nồng độ 0,2mg/l IAA cho thấy chồi in vitro phát triển thấp và yếu, bộ rễ có màu trắng đục, ngắn và yếu, với đầu rễ tự Hình thái cây khoai lang in vitro ở công thức này còi cọc, lá có màu xanh nhạt hoặc phớt vàng, cho thấy nồng độ này không phù hợp cho sự phát triển tối ưu của cây.
AA trong môi trờng còn thấp, cha đủ để kích thích sự ra rễ của chồi khoai lang in vitro.
Công thức 2 với nồng độ 0,4mg/l IAA giúp cây phát triển khỏe mạnh, lá xanh và tăng số lượng cũng như chiều dài rễ Tuy nhiên, đặc điểm hình thái của rễ lại khác biệt so với công thức 1, với số lượng rễ ít, ngắn và đường kính nhỏ, cho thấy công thức 2 vẫn chưa đạt hiệu quả tối ưu nhất.
Nồng độ 0,6mg/l IAA cho hiệu quả kích thích ra rễ tốt nhất so với các công thức khác, với rễ phát triển nhanh, cây in vitro cao khỏe, lá xanh đậm, và dáng cây cứng cáp Tất cả cây đều ra rễ sớm, số lượng rễ nhiều, đường kính rễ lớn hơn, đặc biệt là rễ ít bị đứt gãy trong quá trình đa cây ra vườn ươm Điều này chứng tỏ rằng nồng độ 0,6mg/l IAA rất hiệu quả trong việc kích thích chồi in vitro ra rễ, tạo ra cây hoàn chỉnh.
Sử dụng nồng độ 0,8mg/l IAA trong công thức 4 dẫn đến sự phát triển chậm của cây in vitro, với rễ yếu và dễ gãy khi chuyển ra vườn ươm So với công thức 3, số lượng và chiều dài trung bình của rễ giảm rõ rệt, cho thấy nồng độ IAA cao đã ức chế khả năng ra rễ của chồi khoai lang.
Nh vậy, theo chúng tôi, bổ sung 0,6mg/l IAA vào môi trờng nền là thích hợp nhất cho sự ra rễ của chồi khoai lang in vitro.
Hình 1 : Ch ồi khoai lang in vitro sau 2 tuần ra rễ
Hình 2 : Chồi cây khoai lang invitro sau 4 tuần ra rễ
Hình 3: Cây khoai lang invitro trước khi đưa ra vườn ươm
Kết quả nghiên cứu giai đoạn huấn luyện thích nghi
Để khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sống còn của cây in vitro, chúng tôi đã thiết lập ba công thức giá thể khác nhau, tất cả đều được nuôi dưỡng trong cùng một điều kiện.
- Nguồn khoáng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng 1/2MS phun lên lá dưới dạng sương mù Cứ 3 ngày phun 1 lần.
Cây con được chăm sóc theo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt về nhiệt độ, ánh sáng và gió Kết quả của giai đoạn huấn luyện thích nghi được thể hiện rõ trong bảng 5.
Bảng 3 : ả nh hởng của cỏc giá thể đến sức sống của cây khoai lang in vitro ở giai đoạn vườn ươm ( sau 4 tuần thích nghi)
Công thức giá thể Số mẫu
(lá) Độ tăng chiều cao/cây
Hình thái cây ex vitro
Cây mập, khoẻ, lá mỏng, xanh nhạt Sinh trưởng nhanh nhưng hay bị héo, đổ non CT2:( Đất thịt +trấu hun)=(1:1)
Cây nhỏ, lá mỏng, xanh nhạt, dễ bị đổ, sinh tr- ởng chậm.
C©y mập, khỏe Lá to, d y, xanh,à ít bị đổ và héo Sinh trưởng mạnh.
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của các giá thể đến sức sống của cây khoai lang in vitro giai đoạn vườn ươm (sau 4 tuần thích nghi)
Giá thể đất thịt và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 không phù hợp cho việc huấn luyện cây khoai lang in vitro, với các chỉ tiêu đánh giá tương đối thấp Cây khoai lang in vitro rất nhạy cảm với độ ẩm của giá thể, dẫn đến tình trạng héo và đổ rạp chỉ sau một thời gian ngắn Tỷ lệ cây sống chỉ đạt 68%, chiều cao trung bình chỉ tăng 2,08cm, và trung bình có 2,42 lá mới/cây, trong khi bộ rễ phát triển yếu và sức sống của cây kém.
Giá thể cỏt cho thấy các chỉ tiêu đánh giá cao, với tỷ lệ cây sống và thích nghi đạt 80,20% Độ tăng chiều cao cây trung bình là 1,67cm, số lá mới/cây trung bình đạt 3,17 Cây phát triển nhanh, có kích thước lớn và lá mỏng, nhưng lá không bóng đẹp và cây dễ bị đổ sụp.
Giá thể hỗn hợp đất thịt và cỏ với tỷ lệ 1:1 mang lại kết quả vượt trội cho cây con, với tỷ lệ sống đạt 96,43% và chiều cao trung bình 2,51 cm Mặc dù số lá mới chỉ đạt khoảng 3,5 lá, nhưng bộ rễ phát triển chậm trong giai đoạn đầu, sau đó tăng trưởng mạnh mẽ từ tuần thứ hai Cây có đường kính thân lớn, lá dày, đẹp và màu xanh đậm, thể hiện dáng cây khỏe mạnh, đầy sức sống.
Trong điều kiện huấn luyện cây khoai lang in vitro, với độ ẩm không khí từ 80-85%, độ ẩm giá thể từ 65-80%, nhiệt độ ổn định 23 ± 2°C, và nguồn khoáng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng MS, giá thể tối ưu nhất là hỗn hợp đất thịt và cát theo tỷ lệ 1:1.
Hình 4 : Cây khoai lang in vitro sau 1 tuần huấn luyện thích nghi
Hình 5: Cây khoai lang in vitro sau 2 tuần huấn luyện thích nghi
Giá thể cát Giá thể đất thịt +trấu hun (1:1)
Một số lưu ý trong quá trình nhân giống khoai lang Nhật Beniazuma
Giá thể đất thịt +cát (1:1)
Hình 6: Cây khoai lang in vitro sau 4 tuần huấn luyện thích nghi
3.3 Một số lưu ý trong quá trình nhân giống khoai lang Beniazuma bằng phương pháp in vitro.
Tất cả các khâu trong quá trình nuôi cấy mô đều phải được thanh trùng, bao gồm dụng cụ, mẫu và môi trường nuôi cấy Thành công của nuôi cấy mô phụ thuộc vào việc đảm bảo vô trùng Nếu bất kỳ khâu nào không được thực hiện đúng cách, mẫu nuôi cấy sẽ dễ dàng bị nhiễm vi sinh vật và nấm, dẫn đến thất bại trong quá trình nuôi cấy.
Khử trùng được thực hiện bằng các dụng cụ sau: Nồi hấp, tủ sấy, phiễu lọc vô trùng, hóa chất khử trùng.
Trước khi bắt đầu mẫu, hãy bật đèn UV trong 20 - 30 phút để khử trùng phòng nuôi cấy Đồng thời, cần vệ sinh tay sạch sẽ bằng xà phòng và xử lý các dụng cụ thí nghiệm bằng cồn đốt 90 độ.
3.3.2 Giai đoạn ở phòng thí nghiệm
Nhiễm khuẩn và nấm mốc là những thách thức phổ biến trong quá trình nhân giống in vitro Để đảm bảo thành công, các môi trường nuôi cấy cần phải được vô trùng hoàn toàn Mọi sơ suất trong kỹ thuật hoặc điều kiện môi trường không đạt yêu cầu như nhiệt độ và độ ẩm có thể dẫn đến sự xâm nhập của bào tử nấm mốc vào bình nuôi cấy.
Môi trường dinh dưỡng trong bình sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển nhanh chóng, ảnh hưởng xấu đến môi trường nuôi cấy.
Kết quả của quá trình ra rễ để tạo ra cây hoàn chỉnh phụ thuộc vào việc các chồi nuôi trong ống nghiệm phải là những chồi khỏe mạnh, mập mạp và có từ 2-3 lá.
3.3.3 Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Cây in vitro khi được chuyển từ môi trường nuôi cấy ra ngoài tự nhiên thường có sức đề kháng yếu do sự thay đổi đột ngột về điều kiện sống Để giúp cây thích nghi, giai đoạn đầu cần tạo ra môi trường huấn luyện với độ ẩm và ánh sáng hợp lý, sau đó dần dần điều chỉnh để cây con có thể tự thích nghi với môi trường tự nhiên.
Cây in vitro thường khó thích nghi với môi trường tự nhiên, dễ bị gãy đổ và nhạy cảm với độ ẩm Khi độ ẩm vượt quá 80%, cây có nguy cơ thối rữa, trong khi môi trường quá khô sẽ khiến cây héo và đổ rạp Do đó, việc che chắn và chăm sóc cây là rất quan trọng Khi tưới nước, cần phun nước dưới dạng sương mù để tránh làm đổ cây con.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi có một số kết luận sau:
1 Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
Môi trường ra rễ thích hợp cho chồi khoai lang Beniazuma invitro là:
MS +8 g/l Agar + 30 g/l saccaroza + 10% nước dừa + 0,6mg/l IAA + 10mg/l than hoạt tính + 100mg/l Myo innositol.
Thời gian ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh là 4 tuần. Điều kiện nuôi cấy là: 23 ± 2 0 C, ẩm độ 65 - 70%, cường độ ánh sáng 2000 -
2500 lux và thời gian chiếu sáng là 16 h/ngày.
2 Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Giá thể lý tưởng cho việc huấn luyện cây khoai lang in vitro là hỗn hợp cát và đất thịt theo tỷ lệ 1:1 Để đạt hiệu quả cao, điều kiện huấn luyện cần duy trì độ ẩm không khí từ 80 đến 85% và đảm bảo độ ẩm của giá thể phù hợp.
65 - 80%, nhiệt độ 25 - 30 0 C, nguồn khoáng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng 1/2 MS phun lên lá dưới dạng sương mù.
Thời gian huấn luyện thích nghi là 4 tuần.
Đề nghị
Vì thời gian nghiên cứu có hạn, nên chúng tôi có một số kiến nghị sau:
- Nghiên cứu giai đoạn vào mẫu và nhân nhanh để hoàn thiện qui trình nhân giống khoai lang Beniazuma bằng nhân giống vô tính invitro
Tiếp tục theo dõi sự phát triển của cây khoai lang ngoài vườn để đánh giá khả năng sinh trưởng, khả năng ra hoa, năng suất và chất lượng sản phẩm, cũng như khả năng chống chịu của cây.
Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA, α-NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của giống khoai lang Beniazuma nhằm tìm ra chất điều tiết sinh trưởng (ĐTST) phù hợp nhất cho việc kích thích ra rễ của giống khoai lang này.
- Từng bước ứng dụng các kết quả nghiên cứu của đề tài để cung cấp cây giống cho sản xuất.