GIỚI THIỆU
Lý do chọn đề tài
Enzyme xanthine oxidase (XO) là một metallo-flavoenzyme quan trọng, đóng vai trò trong quá trình phân giải purine bằng cách chuyển đổi hypoxanthine thành xanthine và sau đó xanthine thành acid uric Nồng độ acid uric cao trong máu có thể dẫn đến nhiều bệnh lý, trong đó bệnh gout (thống phong) là biểu hiện lâm sàng điển hình của tình trạng tăng acid uric máu, gây ra sự hình thành các tinh thể acid uric, đặc biệt là ở các khớp.
Tăng acid uric trong máu không chỉ làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa khác mà còn liên quan đến hoạt động của enzyme XO, dẫn đến sự hình thành nhiều gốc tự do có hại cho cơ thể Những bệnh lý liên quan đến tình trạng này đang trở nên phổ biến và có xu hướng gia tăng trên toàn cầu.
Việc ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) là mục tiêu quan trọng trong điều trị tăng acid uric trong máu Các thảo dược và hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme này ngày càng được chú ý nhờ tính an toàn và hiệu quả Nhiều nghiên cứu quốc tế đã tìm kiếm các thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO, trong khi Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu tương tự Tuy nhiên, với nguồn thảo dược phong phú, nhiều loại vẫn chưa được khảo sát về khả năng ức chế enzyme XO Do đó, đề tài "Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric" được thực hiện nhằm xác định thêm các thảo dược tiềm năng trong việc này.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:
- Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được
- Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO
- Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược
Nghiên cứu đánh giá tác dụng của thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) đối với nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO ở gan chuột thực nghiệm Kết quả cho thấy thảo dược này có thể giúp giảm nồng độ acid uric, từ đó hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric trong cơ thể.
Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau:
(1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò
(2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại thảo dược
(3) Nội dung 3: Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược
(4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.), kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl.), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày (Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước (Achyranthes aspera L.); động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO; khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược; phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh-Hoá thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng với các phòng thí nghiệm Sinh học và Hóa học của Khoa Khoa học.
Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã có một số đóng góp mới như sau:
Enzyme XO đã được phân lập thành công từ sữa bò địa phương, cho thấy hoạt tính tương đương với enzyme thương mại Đồng thời, các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme XO cũng đã được xác định.
Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết từ 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy cao chiết ethanol cỏ xước có tác dụng đáng kể trong việc ức chế enzyme này Nghiên cứu đã chứng minh rằng cao chiết cỏ xước có khả năng làm giảm nồng độ acid uric trong máu chuột, đưa mức acid uric về trạng thái bình thường.
3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước Trong đó, quercitrin cú hoạt tớnh ức chế khỏ mạnh enzyme XO (IC50 = 37,7 àg/mL).
Ý nghĩa của luận án
Luận án đã cung cấp cơ sở khoa học về khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược, bao gồm húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước Đặc biệt, nghiên cứu chứng minh cao ethanol cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh, giúp giảm nồng độ acid uric trong máu chuột về mức bình thường Từ đó, luận án gợi ý ứng dụng cây cỏ xước trong phòng và trị tăng acid uric trong máu.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
Sữa bò tươi được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ
The plants collected for this study include Vietnamese balm (Plectranthus amboinicus) from Ben Tre, cat's whiskers (Orthosiphon stamineus) from Can Tho, Chinese mesona (Mesona chinensis) from Vinh Long, spiny amaranth (Amaranthus spinosus), globe amaranth (Gomphrena globosa), and red gomphrena (Gomphrena celosiodes) from Soc Trang All samples were harvested at maturity during their flowering stage, specifically in the mornings of sunny seasons.
The study focuses on isolating chemicals and investigating optimal conditions for enzyme activity, specifically xanthine oxidase (XO) Key reagents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), salicylate, cysteine hydrochloride, phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), sodium bicarbonate, pancreatin, ammonium sulfate, and 1-butanol Additionally, a 0.1 M phosphate buffer, sodium chloride, bovine serum albumin, Folin's reagent, sodium dodecyl sulfate, beta-mercaptoethanol, acrylamide, xanthine, uric acid, allopurinol, and a protein marker ranging from 40 to 300 kDa are utilized These compounds are sourced from reputable suppliers, including Sigma-Aldrich, Merck, and Thermo Scientific, to ensure quality and reliability in enzyme activity assays.
Hóa chất được sử dụng để phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ cao tổng của thảo dược bao gồm ethanol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và Na2SO4 (Trung Quốc) Quá trình này sử dụng silica gel 60 (0,063-0,2 mm) từ Merck, Đức, cùng với bản mỏng tráng sẵn silica gel F254.
Hóa chất pha dung dịch đệm: NaH 2 PO 4 2H 2 O, Na 2 HPO 4 12H 2 O (Trung Quốc)
Hóa chất tăng acid uric chuột: kali oxonate (Sigma-Aldrich)
Nước cất và các hóa chất cần thiết khác.
Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án như sau:
42 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập các hợp chất có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) từ thảo dược Đồng thời, chúng tôi đánh giá tác động của các cao chiết này đối với nồng độ acid uric trong máu của chuột bình thường Kết quả có thể cung cấp thông tin quý giá về tiềm năng ứng dụng của thảo dược trong việc kiểm soát nồng độ acid uric, góp phần vào việc phòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric.
Xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của XO
So sánh khả năng ức chế enzyme XO trích được và XO thương mại của AP
8 loại thảo dược Trích cao
Cao ethanol thảo dược ức chế XO mạnh nhất
Nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm trên chuột có nồng độ acid uric cao để đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đến mức acid uric trong máu Đồng thời, nghiên cứu cũng xem xét tác động của cao chiết đến hoạt tính enzyme XO trong gan của chuột thí nghiệm.
Khảo sát khả năng ức chế XO in vitro của cao tổng ethanol 8 loại thảo dược
3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase
3.2.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò
Sữa bò được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ (Hình 3.2)
Hình 3.3: Sữa bò dùng để phân lập enzyme XO
Enzyme XO từ sữa bò được phân lập theo phương pháp của Massey et al
Vào năm 1969, sữa bò tươi vừa vắt được đưa vào thùng lạnh và nhanh chóng chuyển đến phòng thí nghiệm để phân lập enzyme ở nhiệt độ 4°C Đầu tiên, 3 L sữa bò tươi được bổ sung các chất như 7,5 mL EDTA 0,3 M (pH 7,0), 3 mL salicylate 1 M (pH 7,0), 3,6 g cysteineãHCl, và 3 mL phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 M được pha trong ethanol, cùng với 47,4 g các thành phần khác.
Na2CO3; 4,74 g pancreatin Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút, sau đó để yên qua đêm ở 4°C
Sau 24 giờ, hỗn hợp được thêm 0,6 kg (NH4)2SO4 và khuấy trong thời gian
1 giờ Tiếp theo, hỗn hợp được thêm 0,5 L 1-butanol lạnh (-20°C), khuấy 30 phút và tiếp tục để yên hỗn hợp qua đêm ở 4°C
Sau 24 giờ, hỗn hợp tách thành 2 lớp: lớp phía trên màu trắng chứa lipid, lớp dưới có dạng dung dịch màu vàng đậm chứa enzyme XO Lớp màu trắng chứa lipid được bỏ đi, lớp dung dịch màu vàng đậm phía dưới được sử dụng để tiếp tục phân lập enzyme XO Ba trăm sáu mươi gram (NH4)2SO4 được thêm vào 2,25 L dung dịch màu vàng đậm Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút và để yên
Enzyme XO thô được đông lại và nổi lên bề mặt trong vòng 44 phút Sau đó, lớp chất lỏng phía dưới sẽ được loại bỏ, và phần enzyme XO thô sẽ tiếp tục được ly tâm ở tốc độ 5.000 vòng/phút.
Sau 20 phút ly tâm, hỗn hợp sẽ được phân chia thành ba lớp: lớp chất lỏng phía trên, lớp chất rắn ở giữa và lớp chất lỏng phía dưới Lớp chất lỏng phía trên và phía dưới sẽ được loại bỏ, trong khi lớp chất rắn ở giữa được giữ lại để tiếp tục quá trình tinh sạch enzyme.
Sau khi ly tâm, chất rắn được hòa tan trong 45 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M, ethylenediaminetetraacetic acid 0,3 mM, salicylate 1 mM, phenylmethylsulfonyl fluoride 10 µM với pH 6,0 và được thẩm tách trong 72 giờ Sản phẩm thu được sau thẩm tách được đông khô chân không và bảo quản ở -20°C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4: Thẩm tích Quy trình phân lập enzyme XO từ sữa bò được tóm tắt bằng sơ đồ Hình 3.4
Hình 3.5: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập enzyme XO
3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO trích được theo phương pháp Folin-Lowry
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào phản ứng màu giữa protein và thuốc thử Folin-phenol, tạo ra phức chất màu xanh dương có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 750 nm Cường độ màu của dung dịch sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ protein có trong mẫu.
Để tiến hành thí nghiệm, chúng tôi xây dựng dung dịch protein chuẩn từ bovine serum albumin (BSA) với nồng độ 1 mg/mL trong NaCl 0,9% Các nồng độ cụ thể của BSA được chuẩn bị bao gồm: 0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 và 0,4 mg/mL, như được trình bày trong Bảng 3.1 Các thuốc thử sẽ được sử dụng trong quá trình thí nghiệm.
20 phút Ly tâm 5.000 vòng/phút
Na 2 CO 3 , pancreatin Để qua đêm (NH 4 ) 2 SO 4
Lấy lớp dung dịch phía dưới
Lấy phần nổi phía trên
Thẩm tích 72 giờ Đông khô chân không
Folin cho thấy mối liên hệ giữa màu sắc của dung dịch và hàm lượng protein, với dung dịch có màu đậm hơn tương ứng với nồng độ protein cao hơn Để xác định độ hấp thu, các dung dịch được đo trên máy quang phổ, từ đó vẽ đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thu A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn.
Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, lấy 0,5 mL dung dịch protein (1 mg/mL trong NaOH 0,01 N) cho vào ống nghiệm, thêm 5,5 mL dung dịch kiềm C và lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Sau đó, thêm 0,5 mL thuốc thử Folin 0,5 N, lắc đều và để yên trong 30 phút, quan sát sự chuyển màu từ vàng sang xanh nước biển Cuối cùng, đo độ hấp thu ở bước sóng 750 nm và dựa vào đường chuẩn để xác định nồng độ protein trong mẫu (Lowry et al., 1951).
3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Phõn tớch điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương phỏp của ệzer et al (1999) với gel polyacrylamide 6%
Điện di SDS-PAGE là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide sử dụng Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) để làm biến tính protein SDS mang điện tích âm, tương tác và bám dọc theo chiều dài của phân tử protein, khiến chúng hoàn toàn tích điện âm Khi được đặt trong điện trường, protein sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Ngoài ra, beta-mercaptoethanol được sử dụng để khử cầu nối disulfide trong phân tử protein.
Các tiểu đơn vị enzyme trong hỗn hợp có cùng mật độ điện tích và di chuyển đồng thời trong điện trường Tốc độ di chuyển của enzyme trong điện trường chủ yếu phụ thuộc vào kích thước phân tử và độ tinh sạch của sản phẩm.
Gel điện di gồm 2 lớp:
Lớp gel tập trung nằm ở trên cùng, có chức năng tập trung protein để tạo thành một băng Với kích thước lỗ lớn (acrylamide 4%), lớp gel này cho phép protein di chuyển nhanh chóng và tập trung dưới tác động của điện trường.
- Lớp gel phân tích: Nằm ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử
3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập
Hoạt tính của enzyme XO được xác định bằng phương pháp quang phổ của Bergmeyer (1974)
Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme XO phân lập từ sữa bò được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:
Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1,9 mL dung dịch đệm phosphate (pH 7,5), 1 mL xanthine nồng độ 0,15 mM và 0,1 mL enzyme XO nồng độ 1 mg/mL Mẫu trắng được thực hiện mà không có enzyme, thay thế dung dịch enzyme bằng dung dịch đệm cùng thể tích Phản ứng diễn ra trong cuvette thạch anh dày 1 cm và được ủ ở nhiệt độ 25°C Thời gian phản ứng (T) được tính từ khi enzyme được thêm vào hỗn hợp mẫu thử cho đến khi giá trị hấp thu tia đạt được.
UV bắt đầu không tăng thêm nữa Độ hấp thu tia UV được đo trên máy Jasco V-
Hoạt tính của enzyme được tính bằng công thức:
Hoạt tính riêng của enzyme được tính theo công thức:
Hoạt tính của enzyme có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn được tính theo công thức:
A: độ hấp thu quang phổ lớn nhất của mẫu trong thời gian phản ứng
12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM -1 cm -1 ) 3: thể tích hỗn hợp phản ứng (mL)
0,1: thể tích enzyme cho vào (mL)
C: hoạt tính của enzyme (U/mL enzyme)
S: hoạt tính riêng của enzyme (U/mg protein)
P: khối lượng protein có trong 1 mL dung dịch enzyme (mg protein/mL enzyme)
R: Số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn (U/mg enzyme thô)
D: Khối lượng enzyme thô ở thể rắn đã hòa tan trong 1 mL dung dịch enzyme (mg enzyme thô/mL enzyme)
3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích được
Phương pháp xử lí thống kê
Dùng phần mềm phân tích thống kê spss version 20 và Microsoft Exel để phân tích phương sai và kiểm định bằng Duncan, independent–sample T-Test với khoảng tin cậy 95%