GIỚI THIỆU
Lý do chọn đề tài
Enzyme xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metallo-flavoenzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải purine, chuyển đổi hypoxanthine thành xanthine và sau đó thành acid uric Nồng độ acid uric cao trong máu có thể gây ra nhiều bệnh lý, trong đó bệnh gout (Thống phong) là một biểu hiện điển hình, liên quan đến sự hình thành tinh thể acid uric tại các khớp.
Tăng acid uric trong máu không chỉ làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường mà còn liên quan đến các hội chứng chuyển hóa khác Enzyme xanthine oxidase (XO) đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các gốc tự do có hại, và việc ức chế enzyme này là mục tiêu chính trong điều trị tình trạng tăng acid uric Các thảo dược và hợp chất tự nhiên với khả năng ức chế enzyme XO đang được nghiên cứu rộng rãi do tính an toàn và hiệu quả của chúng Mặc dù có nhiều nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về các thảo dược này, nhiều loại thảo dược tiềm năng vẫn chưa được khai thác Do đó, đề tài “Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric” được thực hiện nhằm khám phá thêm các thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:
- Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được.
- Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.
- Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược.
Nghiên cứu đánh giá tác dụng của thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) đối với nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO trong gan chuột thực nghiệm Kết quả cho thấy thảo dược này có hiệu quả trong việc giảm nồng độ acid uric, đồng thời làm giảm hoạt tính của enzyme XO, từ đó hỗ trợ trong việc điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric trong cơ thể.
Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau:
(1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò.
(2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại thảo dược.
(3) Nội dung 3: Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược.
(4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.), kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl.), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày (Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước (Achyranthes aspera L.); động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino.
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO; khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược; phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018
Nghiên cứu này được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh-Hoá thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng với các phòng thí nghiệm Sinh học và Hóa học của Khoa Khoa học.
Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã có một số đóng góp mới như sau:
Enzyme XO đã được phân lập thành công từ sữa bò địa phương, cho thấy hoạt tính tương đương với enzyme thương mại Nghiên cứu cũng đã xác định các điều kiện tối ưu để enzyme XO hoạt động hiệu quả.
Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) của cao chiết từ 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy cao chiết ethanol từ cỏ xước có tác dụng đáng kể Nghiên cứu đã chứng minh rằng cao chiết này không chỉ ức chế enzyme XO mà còn giúp giảm nồng độ acid uric trong máu chuột, đưa mức acid uric về mức bình thường.
3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước Trong đó, quercitrin cú hoạt tớnh ức chế khỏ mạnh enzyme XO (IC 50 = 37,7 àg/mL).
Ý nghĩa của luận án
Luận án đã cung cấp cơ sở khoa học về khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược, bao gồm húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước Đặc biệt, nghiên cứu chứng minh cao ethanol từ cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh mẽ, giúp giảm nồng độ acid uric trong máu chuột về mức bình thường Từ đó, luận án mở ra hướng ứng dụng cây cỏ xước trong việc phòng ngừa và điều trị tình trạng tăng acid uric trong máu.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
Sữa bò tươi được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ.
The plants Plectranthus amboinicus, Orthosiphon stamineus, and Achyranthes aspera were collected in Ben Tre, while Elsholtzia ciliate was sourced from Can Tho Mesona chinensis was gathered in Vinh Long, and Amaranthus spinosus, Gomphrena globosa, and Gomphrena celosiodes were harvested in Soc Trang All samples were collected in their mature, flowering stage during sunny mornings.
The study focuses on the isolation and investigation of optimal conditions for enzyme activity, utilizing various chemical agents including Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), salicylate, cysteine hydrochloride, and phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) Additional reagents such as sodium bicarbonate, pancreatin, ammonium sulfate, and 1-butanol are employed alongside a 0.1 M phosphate buffer and NaCl sourced from China Key materials include bovine serum albumin from Sigma-Aldrich, the Folin reagent, sodium dodecyl sulfate from Merck, beta-mercaptoethanol, acrylamide, and xanthine, along with xanthine oxidase, uric acid, and allopurinol, all obtained from Sigma-Aldrich A standard protein marker ranging from 40 to 300 kDa from Thermo Scientific is also utilized in the research.
Hóa chất được sử dụng để phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ cao tổng của thảo dược bao gồm ethanol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và Na2SO4 (Trung Quốc) Quá trình này sử dụng silica gel 60 (0,063-0,2 mm) từ Merck, Đức, cùng với bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 cũng từ Merck, Đức.
Hóa chất pha dung dịch đệm: NaH 2 PO 4 2H 2 O, Na 2 HPO 4 12H 2 O (Trung Quốc).
Hóa chất tăng acid uric chuột: kali oxonate (Sigma-Aldrich).
Nước cất và các hóa chất cần thiết khác.
Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án như sau:
Cao ethanol thảo dược ức chế XO mạnh nhất
So sánh khả năng ức chế enzyme XO trích được và XO thương mại của AP
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập các hợp chất có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) từ các loại thảo dược Đồng thời, chúng tôi đánh giá tác động của cao chiết thảo dược đối với nồng độ acid uric trong máu của chuột bình thường Ngoài ra, nghiên cứu cũng xem xét ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu của chuột có tình trạng tăng acid uric.
Thử nghiệm trên chuột bị tăng acid uric Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đến hoạt tính enzyme XO gan chuột thí nghiệm
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án
3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase
3.2.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò
Sữa bò được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ (Hình 3.2).
Hình 3.3: Sữa bò dùng để phân lập enzyme XO
Enzyme XO từ sữa bò được phân lập theo phương pháp của Massey et al.
Vào năm 1969, sữa bò tươi vừa được vắt đã được đưa vào thùng lạnh và nhanh chóng mang về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập enzyme ở nhiệt độ 4°C Đầu tiên, 3 L sữa bò tươi được bổ sung các chất như 7,5 mL EDTA 0,3 M (pH 7,0), 3 mL salicylate 1 M (pH 7,0), 3,6 g cysteine HCl, và 3 mL phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 M pha trong ethanol, cùng với 47,4 g các thành phần khác.
Na 2 CO 3 ; 4,74 g pancreatin Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút, sau đó để yên qua đêm ở 4°C.
Sau 24 giờ, hỗn hợp được thêm 0,6 kg (NH 4 ) 2 SO 4 và khuấy trong thời gian
1 giờ Tiếp theo, hỗn hợp được thêm 0,5 L 1-butanol lạnh (-20°C), khuấy 30 phút và tiếp tục để yên hỗn hợp qua đêm ở 4°C.
Sau 24 giờ, hỗn hợp tách thành 2 lớp: lớp phía trên màu trắng chứa lipid, lớp dưới có dạng dung dịch màu vàng đậm chứa enzyme XO Lớp màu trắng chứa lipid được bỏ đi, lớp dung dịch màu vàng đậm phía dưới được sử dụng để tiếp tục phân lập enzyme XO Ba trăm sáu mươi gram (NH 4 ) 2 SO 4 được thêm vào 2,25 L dung dịch màu vàng đậm Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút và để yên
Trong quy trình tinh chế enzyme XO, sau 43 phút, enzyme thô sẽ đông lại và nổi lên bề mặt, trong khi lớp chất lỏng phía dưới được loại bỏ Tiếp theo, phần enzyme thô này được ly tâm ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong 20 phút Kết quả ly tâm sẽ tạo ra ba lớp: lớp chất lỏng phía trên, lớp chất rắn ở giữa và lớp chất lỏng phía dưới Lớp chất lỏng trên và dưới sẽ được loại bỏ, trong khi lớp chất rắn ở giữa được giữ lại để tiếp tục quá trình tinh sạch enzyme.
Sau khi ly tâm, chất rắn được hòa tan trong 45 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M, cùng với ethylenediaminetetraacetic acid 0,3 mM, salicylate 1 mM và phenylmethylsulfonyl fluoride 10 µM, với pH 6,0 Sau 72 giờ thẩm thấu (Hình 3.3), sản phẩm thu được được đông khô chân không và lưu trữ ở -20°C để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4: Thẩm tích Quy trình phân lập enzyme XO từ sữa bò được tóm tắt bằng sơ đồ Hình 3.4.
Na 2 CO 3 , pancreatin Để qua đêm (NH 4 ) 2 SO 4
Lấy lớp dung dịch phía dưới
Lấy phần nổi phía trên
20 phút Ly tâm 5.000 vòng/phút
Thẩm tích 72 giờ Đông khô chân không
Hình 3.5: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập enzyme XO
3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO trích được theo phương pháp Folin-Lowry
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin-phenol, tạo ra phức chất màu xanh dương có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 750 nm Cường độ màu của dung dịch sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ protein có trong mẫu.
Phương pháp thực hiện bao gồm việc xây dựng dung dịch protein chuẩn từ bovine serum albumin (BSA) với các nồng độ khác nhau trong dung dịch NaCl 0,9% Các nồng độ BSA được chuẩn bị là 0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 và 0,4 mg/mL, như được trình bày trong Bảng 3.1 Sử dụng thuốc thử phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Folin cho thấy mối liên hệ giữa màu sắc của dung dịch và hàm lượng protein; dung dịch có màu sắc đậm hơn tương ứng với hàm lượng protein cao hơn Để xác định độ hấp thu của từng dung dịch, sử dụng máy quang phổ và xây dựng đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thu A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn.
Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry Ống nghiệm
Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, lấy 0,5 mL dung dịch protein (1 mg/mL trong NaOH 0,01 N) cho vào ống nghiệm và thêm 5,5 mL dung dịch kiềm C Sau khi lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, cho thêm 0,5 mL thuốc thử Folin 0,5 N và lắc đều lần nữa Dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh nước biển; để yên trong 30 phút rồi đo độ hấp thu ở bước sóng 750 nm Dựa vào đường chuẩn, có thể suy ra nồng độ protein trong mẫu (Lowry et al., 1951).
3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Phõn tớch điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương phỏp của ệzer et al (1999) với gel polyacrylamide 6%.
Điện di SDS-PAGE là một kỹ thuật điện di sử dụng gel polyacrylamide với sự hiện diện của Sodium Dodecyl Sulphate (SDS), giúp biến tính protein Các phân tử SDS mang điện tích âm tương tác với protein, làm cho chúng hoàn toàn tích điện âm và di chuyển từ cực âm sang cực dương trong điện trường Để đảm bảo phân tử protein không có cầu nối disulfite, chất khử beta-mercaptoethanol được sử dụng để phá vỡ các liên kết này.
Các tiểu đơn vị trong hỗn hợp enzyme có cùng mật độ điện tích và di chuyển đồng nhất trong điện trường Tốc độ di chuyển của enzyme trong điện trường chủ yếu phụ thuộc vào kích thước phân tử và độ tinh sạch của sản phẩm.
Gel điện di gồm 2 lớp:
Lớp gel tập trung nằm ở trên cùng, giúp tập trung protein để tạo thành băng Với kích thước lỗ lớn (acrylamide 4%), lớp gel này cho phép protein di chuyển nhanh chóng và tập trung lại dưới tác động của điện trường.
- Lớp gel phân tích: Nằm ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử.
3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập
Hoạt tính của enzyme XO được xác định bằng phương pháp quang phổ của Bergmeyer (1974).
Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme XO phân lập từ sữa bò được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:
Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1,9 mL dung dịch đệm phosphate (pH 7,5), 1 mL xanthine nồng độ 0,15 mM và 0,1 mL enzyme XO nồng độ 1 mg/mL Để thực hiện mẫu trắng, enzyme được thay thế bằng dung dịch đệm cùng thể tích Phản ứng diễn ra trong cuvette thạch anh dày 1 cm và được ủ ở nhiệt độ 25°C.
(T) được tính từ lúc cho enzyme vào hỗn hợp mẫu thử đến khi giá trị hấp thu tia
UV bắt đầu không tăng thêm nữa Độ hấp thu tia UV được đo trên máy Jasco V-
Hoạt tính của enzyme được tính bằng công thức:
Hoạt tính riêng của enzyme được tính theo công thức:
Hoạt tính của enzyme có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn được tính theo công thức:
A: độ hấp thu quang phổ lớn nhất của mẫu trong thời gian phản ứng.
12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM -1 cm -1 ) 3: thể tích hỗn hợp phản ứng
(mL) 0,1: thể tích enzyme cho vào (mL) T: thời gian phản ứng
C: hoạt tính của enzyme (U/mL enzyme)
S: hoạt tính riêng của enzyme (U/mg protein)
P: khối lượng protein có trong 1 mL dung dịch enzyme (mg protein/mL enzyme)
R: Số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn (U/mg enzyme thô)
D: Khối lượng enzyme thô ở thể rắn đã hòa tan trong 1 mL dung dịch enzyme (mg enzyme thô/mL enzyme)
3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích được
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt động của enzyme XO được thực hiện theo phương pháp của Bergmeyer (1974) Thí nghiệm bao gồm hai yếu tố: pH với các mức 6,5; 7; 7,5 và 8,0, cùng với nhiệt độ ở các mức 20, 25, 30 và 35°C.
3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng Costar 3635 theo phương pháp của Nguyen et al (2004), nhằm xác định nồng độ xanthine và enzyme XO tối ưu để tạo thành acid uric Các điều kiện thí nghiệm được thiết lập ở nhiệt độ 25°C và pH 7,5 Mỗi giếng thử nghiệm chứa 85 µL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5), 60 µL xanthine và 30 µL enzyme XO, sau đó thêm 25 µL HCl 1 N sau 30 phút Dung dịch xanthine được sử dụng với các nồng độ 0; 0,075; 0,15; 0,3 và 0,6 mM, trong khi dung dịch enzyme XO có nồng độ 0.
Phương pháp xử lí thống kê
Dùng phần mềm phân tích thống kê spss version 20 và Microsoft Exel để phân tích phương sai và kiểm định bằng Duncan, independent–sample T-Test với khoảng tin cậy 95%.