GIỚI THIỆU
Lý do chọn đề tài
Enzyme xanthine oxidase (XO) là một metallo-flavoenzyme quan trọng, xúc tác quá trình phân giải purine bằng cách chuyển đổi hypoxanthine thành xanthine và sau đó xanthine thành acid uric Nồng độ acid uric cao trong máu có thể dẫn đến nhiều bệnh lý, trong đó bệnh gout là một biểu hiện lâm sàng phổ biến, liên quan đến sự hình thành các tinh thể acid uric tại các khớp.
Tăng acid uric trong máu không chỉ gia tăng nguy cơ mắc các bệnh như tim mạch, sỏi thận và đái tháo đường, mà còn liên quan đến sự hoạt động của enzyme xanthine oxidase (XO), tạo ra nhiều gốc tự do có hại cho cơ thể Việc ức chế enzyme XO là mục tiêu quan trọng trong điều trị tình trạng này Các thảo dược và hợp chất tự nhiên với khả năng ức chế enzyme XO ngày càng được chú ý do tính an toàn và hiệu quả trong phòng ngừa và điều trị tăng acid uric Nhiều nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã tìm kiếm các thảo dược có khả năng ức chế enzyme này, nhưng vẫn còn nhiều nguồn thảo dược tiềm năng chưa được khảo sát Do đó, đề tài “Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric” được thực hiện nhằm phát hiện thêm những thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:
- Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được.
- Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.
- Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược.
Nghiên cứu đánh giá tác dụng của thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) đối với nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO ở gan chuột thực nghiệm Kết quả cho thấy thảo dược này có hiệu quả trong việc giảm nồng độ acid uric, góp phần hỗ trợ điều trị bệnh gout và các rối loạn liên quan đến chuyển hóa purin.
Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau:
(1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò.
(2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại thảo dược.
(3) Nội dung 3: Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược.
(4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.), kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl.), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày (Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước (Achyranthes aspera L.); động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino.
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO; khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược; phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh-Hoá thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng với các phòng thí nghiệm Sinh học và Hóa học của Khoa Khoa học.
Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã có một số đóng góp mới như sau:
Enzyme XO đã được phân lập thành công từ sữa bò địa phương, cho thấy hoạt tính tương đương với enzyme thương mại Nghiên cứu cũng đã xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme này.
Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết từ 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy cao chiết ethanol cỏ xước có hiệu quả trong việc giảm nồng độ acid uric trong máu chuột, đưa mức acid uric về mức bình thường Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập các hoạt chất có tác dụng này.
3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước Trong đó, quercitrin cú hoạt tớnh ức chế khỏ mạnh enzyme XO (IC 50 = 37,7 àg/mL).
Ý nghĩa của luận án
Luận án đã tạo ra cơ sở khoa học về khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược, bao gồm húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước Đặc biệt, nghiên cứu chứng minh cao ethanol cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh, giúp giảm nồng độ acid uric trong máu chuột về mức bình thường Từ đó, luận án gợi ý ứng dụng cây cỏ xước trong việc phòng và trị tăng acid uric trong máu.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
Sữa bò tươi được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ.
The plants Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Orthosiphon stamineus Benth., and Achyranthes aspera L were harvested in Ben Tre, while Elsholtzia ciliate (Thunb.) Hyl was collected in Can Tho Additionally, Mesona chinensis Benth was gathered in Vinh Long, and Amaranthus spinosus L., Gomphrena globosa L., and Gomphrena celosiodes Mart were sourced from Soc Trang All samples were collected at mature flowering stages during sunny mornings.
The study involves the isolation of enzymes using various chemicals, including Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), salicylate, cysteine hydrochloride, phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), sodium bicarbonate, and pancreatin Additionally, ammonium sulfate, 1-butanol, and a 0.1 M phosphate buffer are utilized, along with NaCl from China and bovine serum albumin from Sigma-Aldrich, USA The research also employs Folin's reagent, sodium dodecyl sulfate, beta-mercaptoethanol, and acrylamide from Merck, Germany, as well as xanthine, xanthine oxidase, uric acid, and allopurinol sourced from Sigma-Aldrich, USA Furthermore, a standard protein marker ranging from 40 to 300 kDa from Thermo Scientific, Finland, is included for analysis.
Hóa chất được sử dụng để phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ cao tổng của thảo dược bao gồm ethanol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và Na2SO4 (Trung Quốc) Quá trình này sử dụng silica gel 60 (0,063-0,2 mm) từ Merck, Đức, cùng với bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 cũng từ Merck, Đức.
Hóa chất pha dung dịch đệm: NaH 2 PO 4 2H 2 O, Na 2 HPO 4 12H 2 O (Trung Quốc).
Hóa chất tăng acid uric chuột: kali oxonate (Sigma-Aldrich).
Nước cất và các hóa chất cần thiết khác.
Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án như sau:
Cao ethanol thảo dược ức chế XO mạnh nhất
So sánh khả năng ức chế enzyme XO trích được và XO thương mại của AP
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập các hợp chất có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) từ thảo dược Chúng tôi tiến hành đánh giá tác động của cao chiết từ thảo dược lên nồng độ acid uric trong máu của chuột bình thường cũng như chuột có nồng độ acid uric cao Kết quả sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc về khả năng điều chỉnh nồng độ acid uric của các hợp chất tự nhiên này.
Thử nghiệm trên chuột bị tăng acid uric Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đến hoạt tính enzyme XO gan chuột thí nghiệm
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu chung của toàn luận án
3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase
3.2.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò
Sữa bò được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ (Hình 3.2).
Hình 3.3: Sữa bò dùng để phân lập enzyme XO
Enzyme XO từ sữa bò được phân lập theo phương pháp của Massey et al.
Vào năm 1969, sữa bò tươi vừa vắt được cho vào thùng lạnh và nhanh chóng mang về phòng thí nghiệm để phân lập enzyme ở nhiệt độ 4°C Đầu tiên, 3 lít sữa bò tươi được bổ sung các chất như 7,5 mL EDTA 0,3 M (pH 7,0), 3 mL salicylate 1 M (pH 7,0), 3,6 g cysteine·HCl, và 3 mL phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 M hòa tan trong ethanol, cùng với 47,4 g chất cần thiết khác.
Na 2 CO 3 ; 4,74 g pancreatin Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút, sau đó để yên qua đêm ở 4°C.
Sau 24 giờ, hỗn hợp được thêm 0,6 kg (NH 4 ) 2 SO 4 và khuấy trong thời gian
1 giờ Tiếp theo, hỗn hợp được thêm 0,5 L 1-butanol lạnh (-20°C), khuấy 30 phút và tiếp tục để yên hỗn hợp qua đêm ở 4°C.
Sau 24 giờ, hỗn hợp tách thành 2 lớp: lớp phía trên màu trắng chứa lipid, lớp dưới có dạng dung dịch màu vàng đậm chứa enzyme XO Lớp màu trắng chứa lipid được bỏ đi, lớp dung dịch màu vàng đậm phía dưới được sử dụng để tiếp tục phân lập enzyme XO Ba trăm sáu mươi gram (NH 4 ) 2 SO 4 được thêm vào 2,25 L dung dịch màu vàng đậm Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút và để yên
Trong quá trình xử lý enzyme XO, sau 1 giờ, enzyme thô đông lại và nổi lên bề mặt, trong khi lớp chất lỏng phía dưới được loại bỏ Tiếp theo, phần enzyme thô này được ly tâm ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong 20 phút Kết quả ly tâm tạo ra 3 lớp: lớp chất lỏng phía trên, lớp chất rắn ở giữa và lớp chất lỏng khác ở phía dưới Lớp chất lỏng trên và dưới sẽ được loại bỏ, trong khi lớp chất rắn ở giữa được giữ lại để tiếp tục quá trình tinh sạch enzyme.
Sau khi ly tâm, chất rắn được hòa trộn với 45 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M, ethylenediaminetetraacetic acid 0,3 mM, salicylate 1 mM, phenylmethylsulfonyl fluoride 10 µM, pH 6,0 và tiến hành thẩm tách trong 72 giờ Sản phẩm sau thẩm tách được đông khô chân không và bảo quản ở -20°C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4: Thẩm tích Quy trình phân lập enzyme XO từ sữa bò được tóm tắt bằng sơ đồ Hình 3.4.
Na 2 CO 3 , pancreatin Để qua đêm (NH 4 ) 2 SO 4
Lấy lớp dung dịch phía dưới
Lấy phần nổi phía trên
20 phút Ly tâm 5.000 vòng/phút
Thẩm tích 72 giờ Đông khô chân không
Hình 3.5: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập enzyme XO
3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO trích được theo phương pháp Folin-Lowry
Nguyên tắc xác định nồng độ protein dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Folin-phenol, tạo ra phức chất màu xanh dương hấp thu ánh sáng ở bước sóng 750 nm Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu.
Phương pháp tiến hành bao gồm việc xây dựng dung dịch protein chuẩn với dãy nồng độ dung dịch bovine serum albumin (BSA) trong NaCl 0,9%, cụ thể là các nồng độ 0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 và 0,4 mg/mL (theo Bảng 3.1) Sử dụng thuốc thử phù hợp để tiến hành thí nghiệm.
Folin cho thấy rằng màu sắc của dung dịch liên quan trực tiếp đến hàm lượng protein; dung dịch có màu đậm hơn thường chứa nhiều protein hơn Để xác định điều này, cần đo độ hấp thu của từng dung dịch bằng máy quang phổ và lập đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thu A và nồng độ của dung dịch protein chuẩn.
Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry Ống nghiệm
Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, cho 0,5 mL dung dịch protein (1 mg/mL trong NaOH 0,01 N) vào ống nghiệm và thêm 5,5 mL dung dịch kiềm C Sau khi lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, thêm 0,5 mL thuốc thử Folin 0,5 N và lắc đều Dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh nước biển; để yên trong 30 phút và đo độ hấp thu ở bước sóng 750 nm Dựa vào đường chuẩn, xác định nồng độ protein trong mẫu (Lowry et al., 1951).
3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Phõn tớch điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương phỏp của ệzer et al (1999) với gel polyacrylamide 6%.
Điện di SDS-PAGE là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS) để biến tính protein SDS, với điện tích âm, tương tác và bám vào protein, làm cho các phân tử protein hoàn toàn mang điện tích âm Khi được đặt trong điện trường, các protein này sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Ngoài ra, chất khử beta-mercaptoethanol cũng được sử dụng để phá vỡ các cầu nối disulfide trong protein.
Các tiểu đơn vị trong hỗn hợp enzyme có cùng mật độ điện tích và di chuyển đồng nhất trong điện trường Tốc độ di chuyển của enzyme trong điện trường chủ yếu phụ thuộc vào kích thước phân tử và độ tinh sạch của sản phẩm.
Gel điện di gồm 2 lớp:
Lớp gel tập trung nằm ở trên cùng, giúp tập trung protein thành một băng Với kích thước lỗ lớn (acrylamide 4%), lớp gel này cho phép protein di chuyển nhanh chóng và tụ lại dưới tác động của điện trường.
- Lớp gel phân tích: Nằm ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử.
3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập
Hoạt tính của enzyme XO được xác định bằng phương pháp quang phổ của Bergmeyer (1974).
Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme XO phân lập từ sữa bò được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:
Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1,9 mL dung dịch đệm phosphate pH 7,5, 1 mL xanthine với nồng độ 0,15 mM và 0,1 mL enzyme XO nồng độ 1 mg/mL Mẫu trắng được thực hiện mà không có enzyme, thay thế enzyme bằng dung dịch đệm cùng thể tích Phản ứng diễn ra trong cuvette thạch anh dày 1 cm và được ủ ở nhiệt độ 25°C.
(T) được tính từ lúc cho enzyme vào hỗn hợp mẫu thử đến khi giá trị hấp thu tia
UV bắt đầu không tăng thêm nữa Độ hấp thu tia UV được đo trên máy Jasco V-
Hoạt tính của enzyme được tính bằng công thức:
Hoạt tính riêng của enzyme được tính theo công thức:
Hoạt tính của enzyme có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn được tính theo công thức:
A: độ hấp thu quang phổ lớn nhất của mẫu trong thời gian phản ứng.
12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM -1 cm -1 ) 3: thể tích hỗn hợp phản ứng
(mL) 0,1: thể tích enzyme cho vào (mL) T: thời gian phản ứng
C: hoạt tính của enzyme (U/mL enzyme)
S: hoạt tính riêng của enzyme (U/mg protein)
P: khối lượng protein có trong 1 mL dung dịch enzyme (mg protein/mL enzyme)
R: Số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn (U/mg enzyme thô)
D: Khối lượng enzyme thô ở thể rắn đã hòa tan trong 1 mL dung dịch enzyme (mg enzyme thô/mL enzyme)
3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích được
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của enzyme XO được thực hiện theo phương pháp của Bergmeyer (1974), với hai yếu tố chính: pH ở các mức 6,5; 7; 7,5 và 8,0, cùng với nhiệt độ ở các mức 20, 25, 30 và 35°C.
3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng Costar 3635 theo phương pháp của Nguyen et al (2004), nhằm xác định nồng độ xanthine và enzyme XO tối ưu cho phản ứng tạo acid uric Các điều kiện thí nghiệm được thiết lập ở nhiệt độ 25°C và pH 7,5 Hỗn hợp trong mỗi giếng bao gồm 85 µL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5), 60 µL xanthine, 30 µL enzyme XO, và sau 30 phút thêm 25 µL HCl 1 N Nồng độ xanthine được thử nghiệm là 0; 0,075; 0,15; 0,3 và 0,6 mM, trong khi enzyme XO được sử dụng với các nồng độ tương ứng.
Phương pháp xử lí thống kê
Dùng phần mềm phân tích thống kê spss version 20 và Microsoft Exel để phân tích phương sai và kiểm định bằng Duncan, independent–sample T-Test với khoảng tin cậy 95%.