Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Trong giai đoạn từ 2016 đến 2018, các địa phương đã báo cáo tình hình bệnh LMLM trên toàn quốc, đồng thời một số khu vực đã thực hiện tiêm phòng vắc xin LMLM cho gia súc vào năm 2018.
Các hoạt động nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại các đơn vị thuộc Cục Thú y, với Phòng thí nghiệm của Cơ quan Thú y vùng VI là phòng thí nghiệm chủ đạo quốc gia Sau đó, các mẫu vi rút LMLM được gửi và phân tích tại Phòng thí nghiệm tham chiếu của FAO và OIE tại Pirbright, Anh và Senasa, Argentina.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 12/2018 đến tháng 09/2019.
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
- Các ổ dịch và loài gia súc mắc bệnh LMLM tại các địa phương trong thời gian từ 2016 - 2018
- Các chủng vi rút LMLM phân lập được tại các địa phương trong phạm vi cả nước trong giai đoạn 2016 - 2018
- Gia súc (trâu, bò) được tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018 tại một số địa phương
- Số liệu dịch bệnh LMLM chi tiết đến cấp xã do Chi cục Thú y/Chăn nuôi và Thú y các tỉnh, thành phố báo cáo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018
- Kết quả xét nghiệm, xác định serotype và topotype LMLM do các Chi cục Thú y vùng tổng hợp và báo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018
Dữ liệu địa lý kết hợp với phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ và phân tích thống kê R là công cụ quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ học, với các gói phân tích như epiR (Stevenson, 2012a) và Spatstat (Baddeley và Turner, 2005) hỗ trợ cho việc phân tích dữ liệu hiệu quả.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018
- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh trong năm 2018.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study)
Phương pháp phân tích theo đối tượng mắc bệnh
Tỷ lệ mắc bệnh LMLM ở các loài gia súc như trâu, bò, lợn, dê và cừu được tổng hợp theo từng tỉnh nghiên cứu Bên cạnh đó, tỷ lệ tử vong của các loài gia súc trong các ổ dịch LMLM cũng được ghi nhận.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo thời gian
Phương pháp xây dựng biểu đồ dịch tễ bao gồm việc đếm tổng số ổ dịch, tức là các xã có gia súc mắc bệnh và chết do LMLM, theo từng ngày kể từ khi xuất hiện ca bệnh đầu tiên Dữ liệu này sau đó được thể hiện dưới dạng biểu đồ dịch tễ để dễ dàng theo dõi và phân tích sự bùng phát của dịch bệnh.
Tỷ số lây lan ước tính (Estimated Dissemination Ratio, EDR) là chỉ số phản ánh sự phát triển của dịch bệnh LMLM, được tính bằng cách chia số ổ dịch đếm được trong một giai đoạn (ví dụ: 05 ngày) cho số ổ dịch trong khoảng thời gian tương tự trước đó Cụ thể, nếu số ổ dịch từ ngày 11-15/1/2016 là 17 và từ ngày 06-10/1/2016 là 3, thì EDR = 17/3 > 1 cho thấy dịch đang lây lan mạnh Ngược lại, EDR < 1 cho thấy dịch giảm dần, trong khi EDR = 1 cho thấy tình hình dịch bệnh ổn định.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo không gian
Nguy cơ mới mắc (Incidence Risk) được định nghĩa là tỷ lệ số xã có dịch bệnh LMLM trên tổng số xã có nguy cơ tại mỗi tỉnh, được tính cho từng năm và trong giai đoạn 2016 - 2018.
Các ổ dịch bệnh LMLM được ghi chép với tọa độ địa lý X và Y cho từng xã Do sự lặp lại và số lượng lớn của các ổ dịch này, bản đồ Kernel (theo Pfeiffer et al., 2008; Stevenson, 2012b; Nguyễn Văn Long và cộng sự, 2012) được áp dụng để thể hiện dữ liệu dạng điểm thông qua chỉ số ước tính mật độ điểm dịch, hay còn gọi là ước tính mật độ Kernel.
Nguyên tắc ước tính mật độ Kernel bao gồm hai bước chính: đầu tiên, các vùng dịch được chia thành nhiều ô vuông có kích thước bằng nhau, ví dụ như 200 200m², và mỗi ô vuông sẽ tạo ra một vùng Kernel xung quanh các điểm dịch; thứ hai, tổng số điểm dịch (y1, y2, …, yn) sẽ được đếm trong mỗi ô vuông để tính mật độ điểm dịch tại mỗi điểm y theo Công thức 1.
K là ước tính mật độ Kernel đối xứng tại mỗi điểm y, trong khi h là bandwidth hay thông số smoothing, đại diện cho bán kính của vùng Kernel xung quanh mỗi điểm dịch Số lượng điểm dịch trong mỗi vùng dịch được ký hiệu là n.
Phân bố không gian của dịch bệnh LMLM được xác định qua tỷ lệ nguy cơ, tính bằng số xã có dịch chia cho tổng số xã có nguy cơ trong mỗi km² Trong từng giai đoạn dịch, tổng số xã có nguy cơ là tổng số xã của mỗi tỉnh Bệnh LMLM có khả năng lây lan mạnh mẽ, và việc kiểm dịch vẫn gặp nhiều khó khăn, do đó, khả năng lây lan từ một xã có dịch sang các xã khác trong cùng tỉnh là rất cao.
3.5.2 Phương pháp giải trình tự gien
Cục Thú y hàng năm chỉ đạo tổ chức lấy mẫu gia súc từ các ổ dịch và chương trình giám sát để chẩn đoán, xét nghiệm và phân lập virus LMLM Các mẫu virus đại diện sẽ được gửi đến phòng thí nghiệm OIE tại Pirbright, Vương Quốc Anh để giải trình tự gene, xác định chủng virus và phân tích cây phả hệ.
Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright đã giải trình tự gien vi rút LMLM với quy trình được tóm tắt như sau:
- Mẫu được tách chiết thu hoạch RNA/DNA
- Thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn gien chứa vùng VP1 với kích thước sản phẩm 1300 bp bằng cặp mồi đặc hiệu
- Tinh sạch sản phẩm DNA bằng kít chuyên dụng
- Đưa vào máy giải trình gien để bắt đầu chạy theo chương trình cài đặt của từng loại máy nhằm thu được kết quả trình tự cuối cùng
- Kết quả là những chuỗi nucleotic, các trình tự nucleotic được xuất ra máy vi tính
Kết quả giải mã gen sẽ được đối chiếu với các trình tự gen của các nhóm vi rút khác đã được công bố trên Ngân hàng gen NCBI, nhằm tìm kiếm mối liên hệ với các chủng vi rút toàn cầu Đồng thời, các chủng trong nước sẽ được so sánh với những kết quả trước đó bằng phần mềm MEGA để xây dựng cây phả hệ sinh dòng.
3.5.3 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa kháng nguyên của vắc xin và kháng nguyên của vi rút thực địa
Dựa trên kết quả giải trình tự và phân tích gen các chủng vi rút LMLM tại Việt Nam từ năm 2016 đến 2018, Phòng thí nghiệm OIE tại Pirbright, Vương Quốc Anh, cùng với Senasa của Argentina, đã tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa vi rút vắc xin và vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam Nghiên cứu này tập trung vào giá trị r1 - mối quan hệ kháng nguyên, nhằm xác định sự phù hợp của các loại vắc xin LMLM đã được OIE khuyến cáo và được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trong nhiều năm qua.
Theo khuyến cáo của Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE cho thấy, mức tương đồng kháng nguyên được đánh giá dựa trên giá trị r1, cụ thể như sau:
Khi chỉ số r1 ≥ 0,3, điều này cho thấy sự tương đồng cao giữa chủng vi rút thực địa và chủng vi rút vắc xin đang được sử dụng tại Việt Nam, cho thấy vắc xin có khả năng bảo vệ gia súc khỏi sự nhiễm trùng do chủng vi rút thực địa này.
Khi chỉ số r1 < 0,3, điều này cho thấy sự tương đồng thấp giữa chủng vi rút thực địa và chủng vi rút vắc xin đang sử dụng tại Việt Nam Điều này có nghĩa là vắc xin không đủ khả năng bảo vệ gia súc khỏi sự nhiễm trùng do chủng vi rút thực địa này.
3.5.4 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh
Dựa trên phân tích dịch tễ học không gian, nghiên cứu đã xem xét sự phân bố của các chủng vi rút LMLM và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa vi rút vắc xin và vi rút lưu hành tại Việt Nam từ năm 2016 đến 2018 Nghiên cứu cũng lựa chọn một số địa phương thuộc vùng khống chế và vùng đệm theo Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020, nhằm đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018.
3.5.3.1 Thời gian và tần suất lấy mẫu
Lấy 01 (một) lần duy nhất sau khi kết thúc tiêm phòng mũi tiêm cuối cùng từ 04 tuần trở lên kể từ ngày tiêm phòng
Huyết thanh từ trâu, bò đã được tiêm phòng vắc xin LMLM, loại vắc xin được Bộ NN&PTNT và Bộ Tài chính cấp phát cho các địa phương Các cơ quan chuyên môn thú y địa phương được hướng dẫn kỹ thuật để mua và sử dụng vắc xin này, nhằm đảm bảo thống nhất với Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020.
Quản lý và phân tích số liệu
Sử dụng các phương pháp thống kê sinh học và phần mềm phân tích dịch tễ như ArcGIS 10.3, R, BioEdit và MEGA để xử lý và phân tích dữ liệu, đồng thời vẽ bản đồ dịch tễ và xây dựng cây phả hệ sinh dòng.
- Kết quả xét nghiệm và dữ liệu thu từ thực địa được nhập vào file MS Excel 2010
Phân tích dịch tễ học mô tả bao gồm việc nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi rút theo không gian, thời gian và đối tượng Các phương pháp dịch tễ và thống kê thường quy, cùng với các bộ công cụ phân tích dịch tễ, được áp dụng trong phần mềm R để thực hiện phân tích này (Stevenson, 2012a).
Tỷ lệ gia súc mắc bệnh và tử vong do bệnh LMLM đang gia tăng, cùng với nguy cơ dịch bùng phát Đặc biệt, tỷ lệ dương tính với kháng thể của vắc xin được xác định theo phương pháp Fleiss (Fleiss, 1981) nhằm đánh giá hiệu quả của công tác tiêm phòng.