Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Trong giai đoạn từ 2016 đến 2018, nhiều địa phương trên toàn quốc đã báo cáo về bệnh LMLM Đặc biệt, vào năm 2018, một số khu vực đã triển khai tiêm phòng vắc xin LMLM cho gia súc nhằm phòng ngừa bệnh này.
Các hoạt động nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại các đơn vị thuộc Cục Thú y, trong đó Phòng thí nghiệm của Cơ quan Thú y vùng VI là phòng thí nghiệm chủ đạo quốc gia Các mẫu vi rút LMLM sau đó được gửi đi phân tích tại Phòng thí nghiệm tham chiếu của FAO và OIE tại Pirbright, Anh và Senasa, Argentina.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 12/2018 đến tháng 09/2019.
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
- Các ổ dịch và loài gia súc mắc bệnh LMLM tại các địa phương trong thời gian từ 2016 - 2018.
- Các chủng vi rút LMLM phân lập được tại các địa phương trong phạm vi cả nước trong giai đoạn 2016 - 2018.
- Gia súc (trâu, bò) được tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018 tại một số địa phương.
- Số liệu dịch bệnh LMLM chi tiết đến cấp xã do Chi cục Thú y/Chăn nuôi và Thú y các tỉnh, thành phố báo cáo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018.
- Kết quả xét nghiệm, xác định serotype và topotype LMLM do các Chi cục Thú y vùng tổng hợp và báo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018.
Dữ liệu địa lý và phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ là những công cụ quan trọng trong phân tích thống kê, với R và các gói phân tích như epiR (Stevenson, 2012a) và Spatstat (Baddeley và Turner, 2005) đóng vai trò chủ chốt trong việc xử lý và phân tích dữ liệu dịch tễ học.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018.
- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh trong năm 2018.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study)
Phương pháp phân tích theo đối tượng mắc bệnh
Tỷ lệ mắc bệnh LMLM ở các loài gia súc như trâu, bò, lợn, dê và cừu đã được tổng hợp theo từng tỉnh nghiên cứu Bên cạnh đó, tỷ lệ chết của các loài gia súc trong các ổ dịch LMLM cũng được ghi nhận.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo thời gian
Phương pháp xây dựng biểu đồ dịch tễ bao gồm việc đếm tổng số ổ dịch, cụ thể là các xã có gia súc mắc bệnh và chết do LMLM Số liệu này được ghi nhận mỗi ngày kể từ khi ca bệnh đầu tiên xuất hiện trong ổ dịch và được trình bày dưới dạng biểu đồ dịch tễ để dễ dàng theo dõi diễn biến dịch bệnh.
Tỷ số lây lan ước tính (Estimated Dissemination Ratio, EDR) là chỉ số quan trọng để đánh giá sự phát triển của dịch bệnh LMLM EDR được tính bằng cách chia số ổ dịch bệnh LMLM trong một giai đoạn nhất định (ví dụ: 05 ngày) cho số ổ dịch trong giai đoạn liền kề trước đó Chẳng hạn, nếu từ ngày 11-15/1/2016 có 17 ổ dịch, trong khi từ 06-10/1/2016 chỉ có 3 ổ dịch, thì EDR sẽ là 17/3 > 1, cho thấy dịch đang có xu hướng lây lan mạnh Ngược lại, nếu EDR < 1, điều này cho thấy dịch đang giảm dần, và khi EDR = 1, dịch bệnh ổn định, không có sự tăng hay giảm.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo không gian
Nguy cơ mới mắc (Incidence Risk) được tính bằng số xã có dịch bệnh LMLM chia cho tổng số xã có nguy cơ trong mỗi tỉnh, áp dụng cho từng năm và cho toàn bộ giai đoạn từ 2016 đến 2018.
Tọa độ địa lý X và Y được ghi chép cho từng ổ dịch bệnh LMLM tại các xã Do các ổ dịch này thường xảy ra nhiều lần và với số lượng lớn, bản đồ Kernel được sử dụng để thể hiện dữ liệu điểm thông qua chỉ số ước tính mật độ dịch, giúp phân tích và theo dõi sự lặp lại của dịch bệnh LMLM.
Nguyên tắc ước tính mật độ Kernel bao gồm hai bước chính: đầu tiên, các vùng dịch được chia thành nhiều ô vuông có kích thước đồng nhất, chẳng hạn như 200 × 200m², và một vùng xung quanh mỗi điểm dịch, gọi là vùng Kernel, sẽ được tạo ra Tiếp theo, số lượng điểm dịch (y1, y2, …, yn) sẽ được đếm trong mỗi ô vuông, từ đó tính tổng số điểm dịch trong vùng Kernel Ví dụ, nếu y' đại diện cho một điểm chung, thì các điểm y1, y2, …, yn là những điểm dịch mà chúng ta quan sát được, và điều này giúp xác định mật độ điểm dịch trong khu vực nghiên cứu.
) được ước tính tại mỗi điểm y theo Công thức 1.
K là ước tính mật độ Kernel đối xứng tại mỗi điểm y, trong khi h đại diện cho bandwidth (thông số smoothing), tức là bán kính của vùng Kernel xung quanh mỗi điểm dịch Số lượng điểm dịch trong mỗi vùng này được ký hiệu là n.
Phân bố không gian dịch bệnh LMLM được xác định qua tỷ số nguy cơ, tính bằng số xã có dịch chia cho tổng số xã có nguy cơ trên mỗi km² Trong mỗi giai đoạn dịch, tổng số xã có nguy cơ là tổng số xã của từng tỉnh, do bệnh LMLM có khả năng lây lan mạnh mẽ Việc kiểm dịch tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn, dẫn đến khả năng dịch bệnh lây lan từ xã này sang xã khác trong cùng tỉnh là hoàn toàn có thể xảy ra.
3.5.2 Phương pháp giải trình tự gien
Cục Thú y hàng năm tổ chức lấy mẫu gia súc từ các ổ dịch và chương trình giám sát để chẩn đoán, xét nghiệm và phân lập vi rút LMLM Các mẫu vi rút đại diện được gửi đến phòng thí nghiệm OIE tại Pirbright, Vương Quốc Anh để giải trình tự gien, xác định chủng vi rút và phân tích cây phả hệ.
Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright đã giải trình tự gien vi rút LMLM với quy trình được tóm tắt như sau:
- Mẫu được tách chiết thu hoạch RNA/DNA.
- Thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn gien chứa vùng VP1 với kích thước sản phẩm 1300 bp bằng cặp mồi đặc hiệu.
- Tinh sạch sản phẩm DNA bằng kít chuyên dụng.
- Đưa vào máy giải trình gien để bắt đầu chạy theo chương trình cài đặt của từng loại máy nhằm thu được kết quả trình tự cuối cùng.
- Kết quả là những chuỗi nucleotic, các trình tự nucleotic được xuất ra máy vi tính.
Kết quả giải mã gen sẽ được so sánh với các trình tự gen của các nhóm vi rút khác đã được công bố trên Ngân hàng gen NCBI Việc này nhằm tìm mối liên hệ với các chủng vi rút trên thế giới hoặc so sánh với các chủng trong nước đã có kết quả trước đó Phân tích sẽ được thực hiện bằng phần mềm MEGA để xây dựng cây phả hệ sinh dòng.
3.5.3 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa kháng nguyên của vắc xin và kháng nguyên của vi rút thực địa
Dựa trên kết quả giải trình tự và phân tích gen các chủng vi rút LMLM tại Việt Nam từ năm 2016 đến 2018, Phòng thí nghiệm OIE tại Pirbright, Vương Quốc Anh, cùng với Senasa của Argentina đã tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa vi rút vắc xin và vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam, thông qua giá trị r1 - mối quan hệ kháng nguyên Các loại vắc xin LMLM này đã được OIE khuyến cáo và được nhiều quốc gia sử dụng trong nhiều năm qua.
Theo khuyến cáo của Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE cho thấy, mức tương đồng kháng nguyên được đánh giá dựa trên giá trị r1, cụ thể như sau:
Chỉ số r1 ≥ 0,3 cho thấy sự tương đồng cao giữa chủng vi rút thực địa và chủng vi rút vắc xin đang được sử dụng tại Việt Nam, điều này chứng tỏ vắc xin có khả năng bảo vệ gia súc khỏi nhiễm bệnh do chủng vi rút thực địa này.
Khi chỉ số r1 nhỏ hơn 0,3, điều này cho thấy sự tương đồng thấp giữa chủng vi rút thực địa và chủng vi rút vắc xin đang được sử dụng tại Việt Nam Điều này có nghĩa là vắc xin hiện tại không đủ khả năng bảo vệ gia súc khỏi sự nhiễm trùng do chủng vi rút thực địa này.
3.5.4 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh
Dựa trên phân tích dịch tễ học không gian, bài viết khảo sát sự phân bố của các chủng vi rút LMLM và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa vi rút vắc xin và vi rút lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2016 - 2018 Nghiên cứu chọn một số địa phương thuộc vùng khống chế và vùng đệm theo Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020 nhằm đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018.
3.5.3.1 Thời gian và tần suất lấy mẫu
Lấy 01 (một) lần duy nhất sau khi kết thúc tiêm phòng mũi tiêm cuối cùng từ 04 tuần trở lên kể từ ngày tiêm phòng.
Huyết thanh của trâu, bò đã được tiêm phòng vắc xin LMLM, loại vắc xin được Bộ NN&PTNT và Bộ Tài chính cấp phát cho các địa phương Vắc xin này được sử dụng theo hướng dẫn kỹ thuật của cơ quan thú y địa phương, nhằm đảm bảo sự thống nhất với Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020.
Quản lý và phân tích số liệu
Sử dụng các phương pháp thống kê sinh học và chương trình phân tích dịch tễ như ArcGIS 10.3, R, BioEdit và MEGA để xử lý và phân tích dữ liệu Những công cụ này hỗ trợ trong việc vẽ bản đồ dịch tễ và xây dựng cây phả hệ sinh dòng.
- Kết quả xét nghiệm và dữ liệu thu từ thực địa được nhập vào file MS Excel 2010.
Phân tích dịch tễ học mô tả bao gồm việc nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi rút theo không gian, thời gian và đối tượng Các phương pháp dịch tễ, thống kê thường quy và các bộ công cụ phân tích dịch tễ được áp dụng trong phần mềm R để thực hiện phân tích này (Stevenson, 2012a).
Tỷ lệ gia súc mắc bệnh và tử vong do bệnh LMLM đang được theo dõi chặt chẽ, cùng với nguy cơ bùng phát dịch bệnh Đặc biệt, tỷ lệ dương tính với kháng thể của vắc xin được tính toán dựa trên phương pháp của Fleiss (Fleiss, 1981), giúp đánh giá hiệu quả của vắc xin trong việc bảo vệ đàn gia súc.