Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành tại:
- Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1 Địa chỉ: Phường Phương Mai – Đống Đa – Hà Nội
- Công ty TNHH Kyoto Biken Hanoi Laboratories Địa chỉ: Khu công nghiệp Thăng Long II – Yên Mỹ – Hưng Yên.
Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4/2016 đến tháng 4/2017.
Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
Vắc-xin Kyoto Biken chống lại virus Parvovirus ở lợn, được sản xuất từ chủng 90HS-SK, được nhập khẩu từ Nhật Bản và được phát triển trên tế bào SK-H tại công ty Kyoto Biken Laboratories Inc.
Mỗi liều vắc xin chứa ít nhất 2x10 7 TCID 50 Porcine Parvovirus
- Động vật thí nghiệm: lợn cái ở độ tuổi 150 ngày, là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire), không có kháng thể chống Porcine Parvovirus.
Nội dung nghiên cứu
- Kiểm tra tính vô trùng, tính an toàn và hiệu lực của vacxin
- Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Kiểm tra tính vô trùng của vacxin
Để đảm bảo tính vô trùng của vacxin cho động vật, vacxin phải không bị nhiễm các vi sinh vật khác, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh Thử nghiệm vô trùng có thể thực hiện bằng hai phương pháp: phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp Phương pháp màng lọc sử dụng bơm chân không để hút vacxin qua màng lọc có kích thước lỗ nhỏ hơn hoặc bằng 0.45µm, giữ lại vi khuẩn và nấm trên màng, sau đó rửa màng để loại bỏ các chất ức chế và nuôi cấy trong môi trường thích hợp Trong nghiên cứu này, phương pháp cấy trực tiếp được áp dụng, sử dụng hai loại môi trường là Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein Digest (SCD) để kiểm tra tính vô trùng của vacxin.
- Môi trường TGC được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
- Môi trường SCD được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp thử vô trùng của vacxin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y quy định trong TCVN 8684:2011
3.5.1.1 Dụng cụ, thiết bị, nguyên vật liệu a Dụng cụ, thiết bị
- Thìa cân, cốc cân/ giấy cân;
- Chai thủy tinh có chia vạch;
- Ống nghiệm có đường kính 23x150mm;
- Pipet thủy tinh vô khuẩn 10ml;
- Máy khuấy từ gia nhiệt;
- Lò hấp tiệt trùng b Nguyên vật liệu
- Nước tinh khiết Bulk Purified Water;
- Bột Thioglycolat (TGC) (Hãng Merck);
- Bột Soybean Casein Digest (SCD) (Hãng Merck)
3.5.1.2 Tiến hành a Pha môi trường thử vô trùng
- Tính lượng môi trường cần pha;
- Cân bột TGC và SCD theo tỷ lệ: 30g/1000ml;
- Chuẩn bị chai đựng, dán nhãn, ghi ngày pha;
- Cho 1/2 - 1/3 lượng nước vào từng chai
TGC: sử dụng nước nóng khoảng 70 o C
SCD: sử dụng nước ở nhiệt độ thường
- Thêm lượng bột TGC và SCD đã cân vào từng chai đó
Thêm lượng nước còn lại vào chai để đạt đủ thể tích cần pha, nghiêng chai để rót nước từ miệng chai xuống, giúp hòa tan hoàn toàn bột còn dính trên thành chai.
- Cho nam châm vào, sử dụng máy khuấy từ thực hiện khuấy cho tan hoàn toàn
- Dùng pipet hút 15ml TGC, SCD môi trường cho vào ống nghiệm, xếp ống nghiệm lên giá Đạy nút silicon xốp sâu tới 2/3 nút
Ghi nhãn đầy đủ các thông tin: Tên môi trường, ngày pha, hạn sử dụng
- Hấp tiệt trùng môi trường đã chia trong các ống nghiệm ở 121 o C trong
- Sau khi kết thúc quá trình tiệt trùng, để nguội môi trường ở nhiệt độ phòng
Môi trường đã pha có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 - 25 o C) và sử dụng trong 3 tuần b Quy trình thử vô trùng
Thử nghiệm vô trùng cần được tiến hành trong Biosafety Cabinet class II cấp độ A, tại phòng sạch cấp độ B Phòng sạch phải được kiểm soát về áp suất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí và có giám sát vi sinh Người thực hiện cần sử dụng phương tiện bảo hộ vô trùng và tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình ra vào khu vực sạch.
- Lấy mẫu vacxin ra khỏi nơi bảo quản, lau cồn ngoài vỏ lọ vacxin trước khi chuyển vào Clean Bench
- Thể tích mẫu vacxin được lấy để cấy:
Môi trường TGC: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử;
0.5ml mẫu/ ống x 2 ống thử
Môi trường SCD: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử;
0.5ml mẫu/ ống x 2 ống thử
- Lắc đều mẫu vacxin, mở nắp lọ và dùng pipet thủy tinh hút mẫu vacxin vào ống môi trường Lắc đều
- Sử dụng 2 ống thử của mỗi loại môi trường TGC và SCD, cấy 1ml nước cất/ ống để làm đối chứng
- Các ống môi trường TGC sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ 36 – 38 o C, các ống môi trường SCD được nuôi ở nhiệt độ 20 – 25 o C trong 14 ngày c Đánh giá
Sau khi nuôi cấy, cần đọc kết quả tại các thời điểm 3-5 ngày, 7-9 ngày và 14 ngày sau khi cấy Việc này được thực hiện bằng cách so sánh màu sắc và độ đục giữa ống mẫu vaccine và ống đối chứng cùng loại.
- Kết quả dương tính khi môi trường tạo váng, đục hoặc lắng cặn;
- Kết quả âm tính khi môi trường không có sự thay đổi về màu sắc và độ đục, giống ống đối chứng
Vacxin được coi là vô trùng khi tất cả các ống thử đều âm tính sau 14 ngày nuôi cấy
Trong trường hợp ống thử dương tính, làm tiêu bản nhuộm Gram, soi kính hiển vi để phát hiện loại vi sinh vật tiến hành nhắc lại thử nghiệm
Sản phẩm được coi là vô trùng nếu không bị nhiễm trong lần kiểm tra thứ hai Nếu phát hiện cùng loại vi sinh vật ở lần kiểm tra thứ hai như lần đầu, sản phẩm không đạt tiêu chuẩn vô trùng Trong trường hợp phát hiện vi sinh vật khác ở lần kiểm tra thứ hai, cần thực hiện thử nghiệm lần ba để xác định tính vô trùng của sản phẩm.
Sản phẩm được coi là vô trùng nếu kết quả kiểm tra lần thứ ba không có nhiễm Ngược lại, nếu có bất kỳ ống nào bị nhiễm vi sinh vật trong lần kiểm tra này, sản phẩm sẽ không đảm bảo tính vô trùng.
3.5.2 Kiểm tra tính an toàn của vacxin
An toàn là tiêu chí quan trọng hàng đầu của một vacxin Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus là loại vacxin vô hoạt, và độ an toàn của nó được đánh giá thông qua các thử nghiệm với liều gấp đôi so với chỉ định.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp được quy định trong 31VR- 10/KN1 tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1
Sử dụng 6 lợn cái là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire) ở độ tuổi 150 ngày, khỏe mạnh
Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Lô đối chứng (03 con): không tiêm vacxin;
- Lô thí nghiệm (03 con): mỗi lợn được tiêm dưới da với 02 liều vacxin ghi trên nhãn
STT Lô Số con Liều và đường đưa vacxin Phương pháp đánh giá
1 Đối chứng 03 Không dùng vacxin - Theo dõi triệu chứng lâm sàng
2 Thí nghiệm 03 Tiêm 4ml/con, tiêm dưới da - Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lợn được theo dõi các triệu chứng lâm sàng toàn thân và các phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vacxin
Phản ứng toàn thân bao gồm: Sốc phản vệ, sốt, kém ăn, bỏ ăn, thở khó bất thường, chảy nước bọt, …
Phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm: Sưng, áp xe, viêm
Nếu có lợn chết sẽ tiến hành mổ khám và kiểm tra bệnh tích
Ghi chép chi tiết số lợn ốm, chết Mô tả chi tiết triệu chứng lâm sàng và bệnh tích nếu động vật chết
- Thể trọng: Thể trọng của từng lợn trong thí nghiệm được cân ngay trước khi tiêm vacxin và ngay sau khi quá trình thí nghiệm kết thúc
Sau khi tiêm vacxin, nếu lợn khỏe mạnh, sinh trưởng và phát triển bình thường mà không có phản ứng bất thường trong vòng 21 ngày, điều này chứng tỏ vacxin đảm bảo an toàn.
- Nếu lợn xuất hiện các triệu chứng bất thường liên quan đến vacxin thì vacxin không đảm bảo tính an toàn
3.5.3 Kiểm tra hiệu lực của vacxin
Kiểm tra hiệu lực của vacxin là cần thiết để đảm bảo vacxin bảo vệ hiệu quả cho động vật trước tác nhân gây bệnh Có nhiều phương pháp kiểm tra hiệu lực, bao gồm công cường độc, định lượng kháng nguyên, định lượng kháng thể trong huyết thanh, và thử hiệu lực lâm sàng Để kiểm tra hiệu lực của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus, phương pháp định lượng kháng thể trong huyết thanh được sử dụng, với phản ứng HI được thực hiện tại thời điểm có miễn dịch chắc chắn sau khi tiêm vacxin Hiệu giá của phản ứng HI sẽ được dùng để đánh giá hiệu lực của vacxin.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp được quy định trong 31VR-10/KN1 tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1
Sử dụng 6 lợn cái lai giữa lợn đực Duroc và nái F1 (Landrace x Yorkshire) ở độ tuổi 150 ngày, tiến hành kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu bằng phản ứng HI Các lợn đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm cần có hiệu giá kháng thể dưới 10, tức là âm tính với kháng thể chống Porcine Parvovirus.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Lô đối chứng (03 con): không tiêm vacxin;
- Lô miễn dịch (03 con): mỗi lợn được tiêm dưới da với 01 liều vacxin ghi trên nhãn
STT Lô thí nghiệm Số con Liều và đường đưa vacxin Phương pháp đánh giá
1 Lô đối chứng 03 Không dùng vacxin
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
Tiêm 2ml/con, tiêm dưới da
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
- Hai lô thí nghiệm được theo dõi triệu chứng lâm sàng liên tục 49 ngày sau khi tiêm vacxin
Vào thời điểm 28 ngày sau khi tiêm mũi 1 và 21 ngày sau khi tiêm mũi 2, tiến hành lấy máu toàn bộ lợn ở lô miễn dịch và lô đối chứng Sau đó, chắt lấy huyết thanh và kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng HI.
3.5.3.2 Phản ứng HI a Dụng cụ, thiết bị Ống nghiệm nhỏ, pipet man, pipet đa kênh, pipet thủy tinh, đầu tip, chai thủy tinh, phiến 96 giếng, ống ly tâm 50mL, mixer, máy ly tâm, cân phân tích, cối, khăn lau tẩm cồn b Nguyên vật liệu
- PBS 1x, chất chống đông Alserve, bột Kaolin;
- Kháng nguyên Porcine Parvovirus c, Phương pháp tiến hành
- Cân 25g bột Kaolin Đổ toàn bộ bột Kaolin ra cối;
- Dùng pipet thủy tinh hút 20mL PBS1x nhả vào bột Kaolin trong cối;
- Chà Kaolin trong cối cho đến khi tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất;
- Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin trong cối vào ống Falcol;
- Tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
- Hòa cặn Kaolin với 10mL PBS1x, mix đều để tạo hỗn dịch;
- Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào cối (đã rửa sạch);
- Tráng lại ống Falcol bằng 10mL PBS1x rồi đổ vào cối;
- Chà hỗn dịch Kaolin trong cối cho đến khi tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất
- Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào ống Falcol;
- Tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm, giữ lại cặn Kaolin;
- Cho khoảng 50mL PBS1x vào chai thủy tinh;
- Hút 10 mL PBS1x vào ống Falcol chứa cặn Kaolin, mix đều để tạo hỗn dịch;
- Hút toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào chai thủy tinh chứa PBS1x;
- Tráng lại ống Falcol bằng 10mL PBS1x rồi đổ vào chai thủy tinh;
- Bổ sung PBS1x vừa đủ 100mL được dung dịch Kaolin 25%
* Rửa và pha hồng cầu gà 0.5%
- Ly tâm máu gà đựng trong ống Falcol có chứa Alserver với tốc độ 2500 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
- Thêm PBS1x vừa đủ 40mL vào ống Falcol, lắc nhẹ và đều rồi đem ly tâm với tốc độ 2500 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
Thêm 40mL PBS1x và thực hiện lặp lại quy trình ly tâm, hút, rửa cho đến khi dịch nổi sau ly tâm trở nên trong suốt, thường khoảng 3 đến 4 lần.
- Ở lần cuối cùng hút dịch nổi sau ly tâm, hút bỏ hoàn toàn PBS1x, phần còn lại là hồng cầu đặc 100%;
- Pha hồng cầu 0.5% bằng PBS1X từ hồng cầu đặc 100% với lượng vừa đủ cho thử nghiệm
* Xử lý huyết thanh lợn
- Cho 0.4ml PBS vào ống nghiệm;
- Thêm 0.1ml huyết thanh mẫu vào ống nghiệm;
- Thêm 0.5ml dung dịch Kaolin 25% vào ống nghiệm và nút ống nghiệm lại; Như vậy, huyết thanh đã được pha loãng 1/10
- Trộn đều bằng mixer Ủ ở nhiệt độ phòng trên 20 phút Trong thời gian đó, cứ 5 phút mix lại 1 lần;
- Ly tâm trong 20 phút với tốc độ 2500 vòng/phút;
Để thực hiện thí nghiệm, hãy chuyển dịch nổi vào một ống nghiệm khác Tiếp theo, thêm 0.03ml hồng cầu gà vào ống nghiệm và lắc nhẹ Sau đó, ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút, và lắc lại mỗi 5 phút một lần.
Tiến hành ly tâm trong 10 phút với tốc độ 2500 vòng/phút để thu lấy dịch nổi, sau đó pha loãng huyết thanh 10 lần và chuyển sang ống nghiệm khác mà không cần bất hoạt.
* Kiểm định kháng nguyên lần thứ 1
- Ghi các độ pha loãng và PBS (đối chứng) lên phiến 96 giếng;
- Dựng pipet chia 50àL PBS vào cỏc giếng từ 1 đến 10;
- Cho 50àL khỏng nguyờn vào giếng 1 Dựng pipet hỳt lờn hỳt xuống vài lần Sau đú hỳt 50àL từ giếng 1 sang giếng 2;
- Tiếp tục pha loãng bậc 2 cho đến hết giếng 9 (hằng số pha loãng 512) Cuối cựng, hỳt bỏ 50àL khỏng nguyờn đó pha loóng ở giếng 9;
- Bổ sung 50àL PBS vào tất cả cỏc giếng;
- Bổ sung 50àL hồng cầu gà 0.5%, lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng Sau 60 phút, tiến hành đánh giá;
- Sau khi đánh giá, xác định được giá trị HA và độ pha loãng kháng nguyên dùng cho thử nghiệm HI
- Ghi số huyết thanh tương ứng với số lợn được đánh dấu, độ pha loãng và đối chứng huyết thanh (SC) lên phiến 96 giếng;
- Dựng pipet đa kờnh chia 50àL PBS vào tất cả cỏc giếng trừ giếng 1;
- Dựng pipet man chia 50àL huyết thanh đó xử lý (huyết thanh đó được pha loãng 10 lần) vào giếng 1 và giếng 2;
- Dựng pipet hỳt lờn hỳt xuống vài lần ở giếng 2.Sau đú hỳt 50àL từ giếng
- Tiếp tục pha loãng bậc 2 cho đến hết giếng 9 (hằng số pha loãng) Cuối cựng, hỳt bỏ 50àL huyết thanh đó pha loóng ở giếng 9;
- Bổ sung 50àL khỏng nguyờn (là khỏng nguyờn đó được pha loóng bằng PBS sau kết quả kiểm định kháng nguyên lần 1) vào các giếng từ 1 đến
- Hấp phụ kháng nguyên ở tủ lạnh từ 2 – 8 o C trong 18 giờ;
- Bổ sung hồng cầu gà 0.5% vào toàn bộ các giếng, sau đó lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng Sau 60 phút, tiến hành đánh giá
* Kiểm định kháng nguyên lần 2 (8HA đơn vị kháng nguyên)
- Ghi độ pha loãng và PBS (đối chứng) lên phiến 96 giếng;
- Dựng pipet chia 50àL PBS vào cỏc giếng từ 2 đến 8;
- Cho 50àL khỏng nguyờn (là khỏng nguyờn đó được pha loóng bằng PBS sau kết quả kiểm định kháng nguyên lần 1) vào giếng 1 và giếng 2;
- Pha loãng kháng nguyên bậc 2 từ giếng 2 đến giếng 7 (hằng số pha loãng 64)
Cuối cựng, hỳt bỏ 50àL khỏng nguyờn đó pha loóng ở giếng 7
- Bổ sung 50àL PBS vào toàn bộ cỏc giếng;
- Bổ sung 50àL hồng cầu gà 0.5%, lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng Sau 60 phút, tiến hành đánh giá d, Đánh giá kết quả của phản ứng HI
- Hiệu giá kháng thể trong phản ứng HI là nồng độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh mà ở đó không xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu;
- Nếu hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn lấy tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm mũi 2 ≥ 80 thì vacxin đạt hiệu quả bảo hộ;
- Nếu hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn lấy tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm mũi 2 < 80 thì vacxin không đạt hiệu quả bảo hộ
3.5.4 Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin
ngày sau khi tiêm vacxin
Thân nhiệt của lợn thí nghiệm trong 21 ngày sau khi tiêm vacxin
Sau khi tiêm vacxin, gia súc thường có dấu hiệu sốt với thân nhiệt tăng, nhưng sau vài ngày sẽ trở lại bình thường và không kèm theo triệu chứng hô hấp hay bỏ ăn Để theo dõi sự biến động thân nhiệt của lợn sau tiêm vacxin, cần đo thân nhiệt hàng ngày vào khoảng 7 – 8 giờ sáng trước khi cho ăn Kết quả theo dõi thân nhiệt này sẽ được thể hiện qua bảng theo dõi.
Bảng 4.4 Bảng theo dõi nhiệt độ của lợn trong 21 ngày sau khi tiêm vacxin
Ngày sau tiêm Nhiệt độ trung bình ( o C)
Lô đối chứng Lô thử nghiệm
Diễn biến nhiệt độ cơ thể của lợn dùng trong thí nghiệm trong 21 ngày theo dõi được thể hiện ở hình 4.1
Hình 4.1 Diễn biến nhiệt độ cơ thể của lợn dùng trong thí nghiệm
Diễn biến nhiệt độ cơ thể của lợn dùng trong thí nghiệm
Thời điểm theo dõi nhiệt độ sau khi tiêm vacxin (ngày)
Kết quả theo dõi thân nhiệt của lợn cho thấy, ở lô lợn đối chứng, nhiệt độ trung bình ổn định từ 38,4 o C đến 38,9 o C, không có dấu hiệu sốt hay giảm thân nhiệt bất thường Trong khi đó, ở lô lợn thí nghiệm, trong 2 ngày đầu sau khi tiêm vacxin, thân nhiệt cao hơn từ 1,0 o C đến 1,5 o C Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 21, thân nhiệt dần ổn định ở mức bình thường từ 38,5 o C đến 39,0 o C, cho thấy hiện tượng sốt nhẹ sau khi tiêm vacxin là phổ biến, nhưng không ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý bình thường và thân nhiệt sẽ trở lại mức bình thường sau đó.
Như vậy, vacxin được đánh giá là không gây tác động xấu đến thân nhiệt của lợn sau khi sử dụng.
Theo dõi sự tăng trọng của lợn thí nghiệm trong 21 ngày sau khi tiêm
Để đánh giá khả năng sinh trưởng của lợn sau khi tiêm vacxin, lợn được cân trước khi tiêm và ngay sau khi thí nghiệm kết thúc (sau 21 ngày) Lợn tham gia thí nghiệm có nguồn gốc rõ ràng, với lịch sử lai ghép được ghi chép và tình trạng sức khỏe cũng như cân nặng được theo dõi trước khi đưa vào thí nghiệm Khối lượng của các lợn tương đối đồng đều, dao động từ 79,9kg đến 82,5kg Trong suốt quá trình thử nghiệm, lợn được nuôi dưỡng và theo dõi trong hệ thống chuồng nuôi đạt tiêu chuẩn.
Kết quả theo dõi thể trọng của lợn được mô tả ở bảng sau:
Bảng 4.5 Tăng trọng của lợn trước khi tiêm vacxin và ngay sau quá trình thí nghiệm kết thúc
Trước khi tiêm vacxin (kg)
Sau khi tiêm vacxin 21 ngày (kg)
Kết quả theo dõi thể trọng lợn sau khi tiêm vacxin cho thấy, ở lô đối chứng, lợn sinh trưởng bình thường với mức tăng trọng lần lượt là 13,2kg, 13,8kg và 14,5kg, đạt tốc độ tăng trọng trung bình từ 0,63kg – 0,69kg/ngày, phù hợp với giống lợn thử nghiệm Trong khi đó, ở lô thử nghiệm, trong 21 ngày theo dõi, lợn số 4 tăng 13,2kg, lợn số 5 tăng 14,3kg và lợn số 6 tăng 12,7kg, với tốc độ tăng trọng trung bình từ 0,6kg – 0,68kg.
Tăng trọng của lợn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn gốc, sức khỏe và điều kiện môi trường Kết quả phân tích cho thấy lợn ở hai lô có tốc độ tăng trọng tương đương (0.6kg – 0.69kg), phù hợp với chỉ số sinh trưởng của giống lợn thử nghiệm Điều này chứng tỏ vacxin không ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của lợn.
Kết quả theo dõi các triệu chứng lâm sàng, thân nhiệt và khả năng tăng trọng của lợn trong 21 ngày sau khi tiêm vaccine cho thấy vaccine này đảm bảo tính an toàn khi sử dụng cho lợn.
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin
Hiệu lực của vắc xin là một chỉ tiêu quan trọng, phản ánh khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể đặc hiệu và bảo vệ động vật khỏi tác động của tác nhân gây bệnh Việc kiểm tra hiệu lực của vắc xin là yêu cầu cần thiết đối với mỗi lô sản xuất.
Có nhiều phương pháp kiểm tra hiệu lực vacxin, nhưng trong thú y, phương pháp công cường độc trên động vật ở lứa tuổi mẫn cảm thường được khuyến cáo Phương pháp này cần thực hiện trong điều kiện tiêu chuẩn và trên động vật có huyết thanh âm tính Tuy nhiên, nếu có các phương pháp thử thay thế đáng tin cậy, việc sử dụng phương pháp công cường độc có thể được hạn chế.
Hiệu lực của vacxin có thể được xác định thông qua việc đo lường kháng thể trong huyết thanh sau khi tiêm cho động vật thí nghiệm Để kiểm tra hiệu quả của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus, chúng tôi đã áp dụng phương pháp định lượng kháng thể trong huyết thanh sau khi tiêm cho lợn.
Lượng kháng thể trong máu lợn sau tiêm vaccine phụ thuộc vào lần xâm nhập kháng nguyên, do đó, để đánh giá chính xác hiệu lực vaccine, cần sử dụng lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng lâm sàng bất thường và có huyết thanh âm tính với kháng thể chống lại mầm bệnh trong vaccine.
Trước khi tiến hành thử nghiệm với lợn, cần chọn những con lợn khỏe mạnh và kiểm tra kháng thể chống PPV trong huyết thanh bằng phản ứng HI Nếu hiệu giá phản ứng HI dưới 10, tức là huyết thanh âm tính với kháng thể PPV, thì lợn đủ tiêu chuẩn cho thử nghiệm Ngược lại, nếu hiệu giá trên 10, lợn sẽ không đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thử nghiệm.
Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của 6 lợn được chọn cho thử nghiệm như sau:
Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra kháng thể chống PPV trong huyết thanh của lợn trước khi tiêm vacxin
Trước khi tiêm vacxin Đánh giá
1 < 10 Đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thử nghiệm
2 < 10 Đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thử nghiệm
3 < 10 Đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thử nghiệm
4 < 10 Đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thử nghiệm
5 < 10 Đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thử nghiệm
Kết quả kiểm tra huyết thanh cho thấy tất cả 6 lợn đều âm tính với kháng thể chống PPV, xác nhận rằng chúng đủ tiêu chuẩn để sử dụng trong thử nghiệm.
Trong nghiên cứu này, các lợn được chia thành hai lô thí nghiệm: lô đối chứng không tiêm vaccine gồm lợn 1, 2 và 3, và lô thử nghiệm gồm lợn 4, 5 và 6, được tiêm hai mũi vaccine cách nhau 28 ngày Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu của các lợn đã được ghi nhận để đánh giá hiệu quả của vaccine.
Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra kháng thể chống PPV trong huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin
28 ngày sau khi tiêm vacxin mũi 1
21 ngày sau khi tiêm vacxin mũi 2
Kết quả kiểm tra kháng thể của lợn sau khi tiêm vacxin cho thấy, 28 ngày sau liều tiêm đầu tiên, lô đối chứng không có kháng thể chống PPV, trong khi lô thử nghiệm cho kết quả huyết thanh dương tính với PPV, chứng tỏ đã có đáp ứng miễn dịch nhưng hiệu giá kháng thể còn thấp Để đảm bảo khả năng bảo hộ chắc chắn với mầm bệnh, hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cần đạt 80 đơn vị HI.
Lợn số 4 và số 5 chỉ đạt hiệu giá kháng thể từ 20 – 40 đơn vị HI, không đủ bảo vệ khỏi mầm bệnh, trong khi lợn số 6 có hiệu giá kháng thể 80 đơn vị HI, đủ khả năng bảo vệ Sự khác biệt về hiệu giá kháng thể giữa các lợn là do cơ địa riêng biệt của từng cá thể, dẫn đến khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau.
Sau khi tiêm vacxin mũi thứ nhất, cơ thể chỉ sản sinh một lượng kháng thể chống PPV thấp, chưa đủ bảo vệ nếu mầm bệnh xâm nhập Tuy nhiên, 21 ngày sau khi tiêm vacxin mũi thứ hai, lô đối chứng không có kháng thể, trong khi lô thử nghiệm cho thấy hiệu giá kháng thể cao hơn (từ 80 – 160 đơn vị HI) Điều này chứng tỏ rằng vacxin mũi thứ hai đã kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh hơn, đủ để bảo vệ con vật trước sự xâm nhập của mầm bệnh Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi tiêm vacxin hoàn toàn phù hợp với quy luật hình thành kháng thể.
Khi vacxin được đưa vào cơ thể, kháng thể không được sinh ra ngay lập tức mà trải qua một thời gian tiềm tàng, phụ thuộc vào lần xâm nhập của kháng nguyên vacxin Sau khoảng 2 – 3 tuần, lượng kháng thể đạt mức cao nhất trước khi giảm dần và có thể mất đi sau vài tháng hoặc vài năm Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, sản lượng kháng thể tăng lên và xuất hiện sớm hơn.
Sự khác biệt giữa đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp chủ yếu do vai trò của các tế bào nhớ miễn dịch Trong đáp ứng miễn dịch thứ cấp, các tế bào này phát triển nhanh chóng và mạnh mẽ, dẫn đến việc sản xuất kháng thể diễn ra sớm và với lượng lớn hơn Khi tiêm vaccine lần thứ hai sau lần đầu từ 3 đến 4 tuần, đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn, mạnh hơn và thời gian miễn dịch kéo dài hơn Điều này là cơ sở khoa học cho việc tiêm phòng vaccine nhắc lại, nhằm nâng cao mức độ miễn dịch cho cơ thể.
Nghiên cứu cho thấy, sự hiện diện của kháng thể trong máu không đồng nghĩa với việc con vật được bảo vệ hoàn toàn khỏi mầm bệnh cường độc Để cơ thể có mức độ miễn dịch bảo vệ, lượng kháng thể cần đạt đến một trị số nhất định, được gọi là ngưỡng bảo hộ Hàm lượng kháng thể cao hơn ngưỡng bảo hộ tương ứng với mức độ miễn dịch cao hơn, và ngược lại.
Qua thử nghiệm hiệu lực của vaccine, có thể đánh giá rằng vaccine tạo ra một đáp ứng miễn dịch tốt cho động vật Kháng thể bắt đầu xuất hiện trong máu sau mũi tiêm đầu tiên và tăng dần sau mũi tiêm thứ hai Lượng kháng thể trong máu sau mũi tiêm thứ hai, sau 21 ngày, đủ để bảo vệ động vật khỏi sự xâm nhập của mầm bệnh.
Như vậy, vacxin được đánh giá là đạt tiêu chuẩn về hiệu lực.
Kết quả đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin
Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus là một loại vacxin vô hoạt, cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 – 8 độ C Để xác định thời gian bảo quản, các chỉ tiêu như đặc tính vật lý, tính vô trùng, tính an toàn, tính hiệu lực và độ ổn định pH của vacxin cần được kiểm tra định kỳ Hạn sử dụng của vacxin được xác định là khoảng thời gian mà vacxin duy trì tính ổn định và đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm khi được bảo quản đúng cách, đảm bảo an toàn và hiệu quả trong phòng bệnh.
Trong quá trình bảo quản, định kỳ lấy mẫu vacxin ở các thời điểm 0, 6, 12,
Thời gian kiểm tra vacxin được thực hiện vào các mốc 18, 24 và 30 tháng sau khi kết thúc quá trình sản xuất Số lượng mẫu vacxin được kiểm tra tại mỗi thời điểm sẽ phụ thuộc vào từng tiêu chí kiểm tra cụ thể.
4.4.1 Kết quả kiểm tra đặc tính của vacxin trong thời gian bảo quản
Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus được cung cấp dưới dạng dung dịch 20ml trong mỗi lọ Trước khi sử dụng, dung dịch vacxin cần được lắc đều, đảm bảo rằng sau khi lắc, dung dịch có màu đỏ cam đồng nhất và không chứa dị vật.
Chất lượng vacxin sau thời gian bảo quản được đánh giá qua các đặc tính vật lý như màu sắc, kết cấu và sự đồng nhất của dung dịch Nếu vacxin có dấu hiệu biến đổi như thay đổi màu sắc, xuất hiện dị vật hay vón cục, thì không đảm bảo chất lượng cho vật nuôi Để giữ chất lượng, vacxin cần được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 oC, tránh ánh sáng mặt trời và duy trì tính ổn định về màu sắc và độ trong suốt Việc kiểm tra đặc tính vacxin được thực hiện bằng cách lấy mẫu từ các lô 74, 75, 76 với 10 lọ ngẫu nhiên mỗi lô, tại các thời điểm 0, 6, 12, 18, 24 và 30 tháng Tất cả thông tin và kết quả kiểm tra được ghi chép đầy đủ.
Kết quả kiểm tra đặc tính của vacxin tại các thời điểm theo dõi như sau:
Bảng 4.8 Kết quả đánh giá đặc tính của vacxin trong thời gian bảo quản
(tháng) Đặc tính vật lý Màu sắc Độ trong suốt Dị vật Độ đồng nhất
0 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
6 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
12 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
18 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
24 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
30 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
0 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
6 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
12 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
18 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
24 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
30 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
0 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
6 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
12 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
18 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
24 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
30 Đỏ cam Trong suốt Không có Đồng nhất
Kết quả kiểm tra đặc tính của vacxin ở bảng 4.8 cho thấy:
Tất cả các lọ vaccine đều được kiểm tra kỹ lưỡng để đảm bảo đáp ứng các tiêu chuẩn về đặc tính vật lý Sau khi lắc đều, dung dịch vaccine có màu đỏ cam, trong suốt, đồng nhất và hoàn toàn không chứa dị vật.
Vaccine có khả năng duy trì các đặc tính vật lý nguyên bản và đáp ứng tiêu chuẩn bảo quản trong thời gian lên đến 30 tháng.
Trong quá trình sử dụng vacxin cho vật nuôi, việc bảo quản vacxin ở nhiệt độ thích hợp và tránh ánh nắng mặt trời là rất quan trọng Chú ý đến các đặc tính vật lý của lọ vacxin trước khi sử dụng giúp kiểm soát chất lượng vacxin, từ đó tăng hiệu quả phòng bệnh trong chăn nuôi và giảm thiểu rủi ro do vacxin không đảm bảo chất lượng.
Một số thông tin và đặc điểm của lọ vacxin cần phải kiểm tra trước khi sử dụng bao gồm:
Thông tin trên nhãn: Tên vacxin, số lô, số liều sử dụng, ngày sản xuất, số kiểm nghiệm xuất xưởng, thời hạn sử dụng, quy cách bảo quản
Những hư hỏng trong lọ vacxin: nút chặt hay lỏng, nguyên vẹn hay bị rách, tình trạng lớp sáp phủ bên ngoài, tình trạng rạn nứt của lọ vacxin
Tình trạng vacxin bên trong lọ: màu sắc, kết cấu, độ đồng nhất, có bị vón cục hoặc có dị vật không
4.4.2 Kết quả kiểm tra tính vô trùng của vacxin trong thời gian bảo quản
Vô trùng là yêu cầu cơ bản nhất của một vacxin, và việc bảo quản vacxin trong thời gian dài cũng phải đảm bảo tính vô trùng Để đánh giá tính vô trùng của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus trong quá trình bảo quản, các mẫu vacxin đã được lấy từ các lô 74, 75, 76, với mỗi lô lấy ngẫu nhiên 2 lọ vacxin tại các thời điểm 0, 12, 24 và 30 tháng để tiến hành kiểm tra.
Phương pháp kiểm tra vô trùng được tiến hành trong buồng cấy vô trùng cấp độ A, nằm trong phòng sạch cấp độ B Phòng này duy trì áp lực dương và được giám sát liên tục về các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và áp suất.
Mỗi lọ vacxin được cấy vào hai loại môi trường là TGC và SCD, với mỗi loại môi trường được cấy trên bốn ống thử: hai ống thử cấy 1ml vacxin và hai ống thử cấy 0.5ml vacxin Các ống môi trường TGC được nuôi ở nhiệt độ 36 – 38 độ C trong 14 ngày, trong khi các ống môi trường SCD cũng được nuôi ở nhiệt độ tương tự.
Sau khi nuôi cấy, cần đọc kết quả ở các thời điểm 3-5 ngày, 7-9 ngày và 14 ngày sau khi cấy Việc này được thực hiện bằng cách so sánh màu sắc và độ đục giữa ống chứa mẫu vaccine và ống đối chứng cùng loại.
Kết quả dương tính khi môi trường tạo váng, đục hoặc lắng cặn
Kết quả âm tính khi môi trường không có sự thay đổi về màu sắc và độ đục, giống ống đối chứng
Vacxin được đánh giá là vô trùng khi tất cả các ống thử đều cho kết quả âm tính sau 14 ngày nuôi cấy
Kết quả theo dõi thử nghiệm tính vô trùng của vacxin tại các thời điểm được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.9 Kết quả đánh giá tính vô trùng của vacxin trong thời gian bảo quản
* : Số ống thử nghiệm dương tính đối với vi khuẩn và nấm/số ống thử nghiệm được cấy mẫu vacxin/ số lọ vacxin thử nghiệm
Bảng 4.9 cho thấy rằng tại tất cả các thời điểm kiểm tra trên ba lô vacxin, không có ống thử nào cho kết quả dương tính trên hai loại môi trường TGC và SCD, đồng nghĩa với việc không có hiện tượng nổi váng, lắng cặn hay đục môi trường Tất cả các ống thử đều giữ được độ trong suốt và không thay đổi màu sắc so với trước khi cấy mẫu, tương tự như ống đối chứng Kết luận cho thấy các mẫu vacxin thử nghiệm không bị nhiễm tạp khuẩn và nấm, đảm bảo yêu cầu vô trùng trong thời gian bảo quản lên đến 30 tháng.
4.4.3 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản Tính an toàn của vacxin thường được đánh giá thông qua việc thử nghiệm vacxin trên bản động vật hoặc động vật thí nghiệm Ngoài ra, vì Kyoto Biken Porcine Parvovirus là một vacxin vô hoạt, nên để đảm bảo tính an toàn cho động vật sử dụng vacxin và môi trường sau một khoảng thời gian bảo quản, vacxin cần duy trì được tính bất hoạt
4.4.3.1 Kiểm tra tính an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản trên động vật thí nghiệm
Trong nghiên cứu đánh giá an toàn vacxin, chúng tôi đã sử dụng chuột lang và chuột nhắt trắng thay cho lợn Tại các thời điểm 0, 12, 24 và 30 tháng, mẫu vacxin từ 3 lô được thu thập, với 2 mẫu tiêm cho 2 chuột lang và 2 mẫu tiêm cho 10 chuột nhắt trắng (mỗi mẫu tiêm cho 5 chuột) Liều tiêm là 1ml/con Chúng tôi đã theo dõi triệu chứng lâm sàng hàng ngày của chuột, ghi nhận các biểu hiện bất thường như giảm hoạt động, rụng lông, tiêu chảy, chảy nước mũi, và đo khối lượng chuột trước và sau tiêm vacxin sau 7 ngày.
Trong nghiên cứu này, hai chuột lang và hai chuột nhắt trắng không được tiêm vắc xin được sử dụng làm đối chứng, nuôi trong cùng điều kiện với nhóm chuột tiêm vắc xin Quá trình thử nghiệm bao gồm việc theo dõi và ghi chép khối lượng cũng như các triệu chứng lâm sàng của các đối tượng trong suốt thời gian thực hiện.
Đánh giá về vacxin kyoto biken porcine parvovirus
cách đây hàng chục năm Khi nhập khẩu về Việt Nam, vacxin được kiểm nghiệm
Trước khi tiến hành khảo nghiệm để được cấp phép lưu hành, cần đảm bảo 3 chỉ tiêu quan trọng: vô trùng, an toàn và hiệu lực Kết quả kiểm nghiệm cho thấy Vacxin Kyoto Biken đáp ứng đầy đủ các tiêu chí này.
Porcine Parvovirus được đánh giá là vô trùng trên các môi trường nuôi cấy
Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein Digest (SCD), an toàn đối với đối tượng lợn được chỉ định sử dụng vacxin, hiệu giá kháng thể đạt từ 80 đến 160 đơn vị
Để đảm bảo hiệu lực bảo hộ cho động vật khỏi các tác nhân gây bệnh, kết quả kiểm nghiệm ban đầu của vaccine cho thấy các chỉ tiêu đạt yêu cầu và phù hợp với tiêu chuẩn quy định Điều này cho phép vaccine đủ điều kiện tiến hành khảo nghiệm trên quy mô lớn hơn nhằm đánh giá hiệu quả và chất lượng khi sử dụng.
Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus đã được kiểm tra qua nhiều thử nghiệm và cho thấy khả năng ổn định tốt về đặc tính vật lý Sản phẩm này cũng đạt tiêu chuẩn về tính vô trùng khi được thử nghiệm trên các môi trường nuôi cấy Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein.
Vacxin Digest (SCD) an toàn cho động vật thí nghiệm như chuột lang và chuột nhắt trắng, không chứa virus sống, với hiệu giá kháng thể trung bình từ 80 – 160 đơn vị HI, giúp bảo vệ động vật khỏi tác nhân gây bệnh Vacxin duy trì pH ổn định sau 30 tháng bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 độ C, tránh ánh sáng mặt trời Để đảm bảo chất lượng tối ưu, thời hạn bảo quản vacxin được xác định là 27 tháng.
