Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện trên lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội dương tính với virus PEDV.
Nội dung nghiên cứu
- Xác định các mẫu lợn Yorkshine dương tính với virus PEDV
- Phân lập các chủng PEDV trên môi trường tế bào
- Xác định hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập
- Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng PEDV phân lập trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero
- Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
- Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
- Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus ).
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian: Từ ngày 6/7/2015 đến ngày 31/08/2016.
Nguyên liệu, hóa chất, máy móc
- Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi ở một số trang trại tại vùng phụ cận Hà Nội
- Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trên khay nuôi tế bào hoặc đĩa lồng
- Hóa chất sử dụng trong làm tiêu bản vi thể: dung dịch focmon 10%, xylem, thuốc nhuộm HE, Baume Canada, NaHCO3 1%, focmon10%, cồn, Xylen, Ethanol (96-100°), paraffin, PBS, DAB…
Cell culture relies on specific chemicals, including Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) as the growth medium, Fetal Bovine Serum (FBS) for nutrient supplementation, and antibiotics such as penicillin (100 UI/ml) and streptomycin (100 µg/ml) to prevent contamination.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và thí nghiệm, các thiết bị như kính hiển vi, máy ly tâm, máy vortex, máy chạy điện di, máy PCR, máy đục khuôn mẫu, máy cắt tiêu bản (Microtom), máy chụp gel, cân điện, lò vi sóng, box vô trùng, tủ ấm 37 °C/5% CO2, tủ sấy và tủ lạnh đóng vai trò quan trọng Những máy móc này hỗ trợ tối đa cho quá trình phân tích, nghiên cứu và bảo quản mẫu vật, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong các thí nghiệm khoa học.
20 ° C, tủ lạnh -80 ° C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,…
Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, các dụng cụ cần thiết bao gồm dao, kéo, panh kẹp, khay, ống eppendorf, bông cồn, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống nghiệm, lọ đựng formol 10%, bình nuôi cấy tế bào và khay 96 giếng Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo tính chính xác và an toàn cho các thao tác trong phòng thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Phương pháp quan sát triệu chứng lâm sàng ở lợn Yorkshire nghi mắc PEDV cần được thực hiện ngay khi xuất hiện dấu hiệu đầu tiên Việc kết hợp đặc điểm dịch tễ địa phương với thông tin từ chủ gia súc và cán bộ thú y sẽ giúp tăng độ tin cậy trong chẩn đoán bệnh.
Quan sát biến đổi đại thể thông qua việc mổ khám những lợn Yorkshire có triệu chứng lâm sàng của PEDV
3.5.2 Phương pháp mổ khám Để xác định đƣợc các biến đổi đại thể của các cơ quan ở lợn Yorkshire nghi mắc PEDV cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng đặc trƣng của bệnh Quá trình mổ khám tuân theo quy trình mổ khám TCVN-TC16-2005
3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu cần được lấy theo quy định của ngành, đảm bảo đúng cơ quan, tổ chức và vùng tổn thương điển hình Đồng thời, cần lấy đủ thành phần cấu tạo để phục vụ nghiên cứu và đảm bảo đủ lượng mẫu cần thiết.
Bệnh phẩm sau khi lấy cần cố định ngay trong dung dịch formol 10%
3.5.4 Phương pháp tiến hành phản ứng RT- PCR a Chuẩn bị mẫu cho phản ứng RT-PCR
Lấy bệnh phẩm từ tủ âm sâu để cho tan đá
Để nghiền bệnh phẩm, cắt nhỏ mẫu và cho vào ống Eppendorf 1,5ml Tiến hành nghiền nát bệnh phẩm với môi trường DMEM cho đến khi tạo thành huyễn dịch đồng nhất Sau đó, ly tâm để loại bỏ phần cặn và bảo quản dung dịch thu được ở -80°C cho đến khi sử dụng.
Tất cả các thao tác trong buồng cấy vô trùng cần được thực hiện cẩn thận, đảm bảo rằng các hóa chất và dụng cụ sử dụng đều phải được khử trùng trước và sau khi sử dụng Để tách chiết RNA virus, chúng ta sử dụng KIT QIAgen, một phương pháp hiệu quả và an toàn.
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit
1 Hỳt 560 àl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml
2 Thờm 140 àl dung dịch mẫu đó xử lý là hỗn dịch (chứa virut và dung dịch PBS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó lắc đều nhanh trong 15 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
3 Thờm 560 àl dung dich Ethanol (96-100°), lắc đều nhanh trong 15 giõy
4 Chuyển 630 àl huyễn dịch trờn sang cột QIAamp spin Ly tõm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nước dưới
6 Thờm 750 àl dung dịch AW1, ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phỳt rồi giữ cột, bỏ nước dưới
7 Thờm 750 àl dung dịch AW2, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 3 phỳt, giữ cột, bỏ nước dưới Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000 vòng/phút trong 1 phút
8 Chuyển cột sang một ống Eppendorf mới Thờm 60 àl dung dịch AVE, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 rồi bỏ cột, giữ nước dưới, dung dich ở dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số
Kí hiệu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -70°C c Cách tiến hành chạy RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ đƣợc hỗn hợp với các thành phần đƣợc trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)
Nước khử ion (DEPC – treated) 6
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng này phát hiện đoạn gen S của virus PED
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thước
Mồi xuôi PS1 TTCTGAGTCACGAACAGCCA 651bp
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 60 giây
4 Giữ sản phẩm 4 ∞ d Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel đƣợc chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 100°C trong 5 phút, để nguội 45-50°C bổ sung
Ethidium bromide với nồng độ 10µg/10µl được sử dụng để chuẩn bị gel Sau khi đổ vào khuôn đã cài sẵn, chờ cho gel đông cứng Khi gel đã đông, đặt vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TBE cho ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thờm 2 àl loading dye vào 8 àl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 àl DNA marker
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA đƣợc phát hiện bằng máy phát tia
UV Sau đó chụp ảnh và lưu kết quả
- Mẫu dương tính với virus khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên
- Mẫu âm tính khi không xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại
3.5.5 Phương pháp xử lý mẫu cho phân lập virus
Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng, sau đó hòa trộn đồng nhất trong dung dịch DMEM Sau khi ly tâm tốc độ cao, thu hồi hỗn dịch và lọc qua màng lọc để tạo ra hỗn dịch đồng nhất, sẵn sàng gây nhiễm vào tế bào Vero.
3.5.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào Để chuẩn bị các bước nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lượng tế bào Vero cần thiết a “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FBS làm ấm trong tủ 37°C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM bổ sung 5% FBS, chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM bổ sung 5% FBS
Để bảo quản tế bào, hãy giữ chúng trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 và theo dõi sự phát triển hàng ngày Khi tế bào mọc dày và kín bề mặt đáy bình, có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển sang bình nuôi cấy mới.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lƣợng tế bào lên một lƣợng nhất định để phục vụ nghiên cứu
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi dưỡng, rửa tế bào bằng dung dịch PBS (không chứa Ca 2+ hoặc Mg 2+ )
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trysin-EDTA.Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Sau đó, pha loãng tế bào với tỷ lệ 1:100 (1ml tế bào trong 99ml môi trường không đầy đủ) và sử dụng buồng đếm trên kính hiển vi để xác định số lượng tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào bằng cách pha loãng tế bào đến nồng độ 2.10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, sau đó chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi cấy mới với thể tích 6 ml cho bình T25 và 15 ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37°C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào c Thu tế bào
Sau khi thu thập đủ số lượng tế bào cần thiết, chúng sẽ được bảo quản để sử dụng trong tương lai Mỗi tế bào có giới hạn về số lần nuôi cấy, tương ứng với số lần phân chia, ngoại trừ tế bào ung thư có khả năng phân chia vô hạn Do đó, việc ghi chép hồ sơ theo dõi tế bào trong quá trình cấy chuyển và thu hoạch là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng tế bào cho nghiên cứu.
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bước 5 và bước 6