Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Ethyl acetat. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn Ethyl acetat. Mời các bạn cùng tham khảo!

TỔNG QUAN

Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)

Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae) là họ thực vật lớn nhất với hơn 1.600 chi và 23.000 loài, chủ yếu tập trung ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi Họ Cúc ít gặp hơn trong các vùng rừng nhiệt đới ẩm ở độ cao thấp Đây là họ thực vật nổi bật trong các nền văn hóa bản địa trên toàn thế giới, đặc biệt được sử dụng cho các mục đích y học.

Các loài thuộc họ Cúc có đặc điểm nổi bật như cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, và chùm lông trên quả Quả của chúng là loại quả bế, được hình thành từ một lá noãn và không nứt ra khi chín.

Họ Cúc chứa nhiều chất chuyển hóa thứ cấp phong phú, đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của chúng Thông tin về các hợp chất này có giá trị cao trong việc phân loại, vì sự hiện diện hoặc vắng mặt của các hợp chất hóa học cụ thể thường chỉ ra mối quan hệ phân loại ở cấp phân họ và thấp hơn.

Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là Eclipta alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae) [1], [2]

Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có vị trí phân loại như sau:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.2.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba ) [2]

Cây thảo mọc hằng năm, cao từ 10-60 cm, có thân phân nhánh màu lục hoặc hơi đỏ tía, phủ lông cứng Lá mọc đối, hình ngọn giáo đến bầu dục, dài 3-10 cm và rộng 0,5-2,5 cm, với mép nguyên hoặc khía răng, có lông tơ dày ở cả hai mặt Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, nằm ở nách lá hoặc ngọn cành, có cuống dài 1,5 mm và tổng bao gồm một hàng lá bắc hình bầu dục có lông tơ ở mặt lưng Đế hoa lồi, rộng 1 cm, với hoa cái ở mép có tràng dạng lưỡi nhỏ màu trắng và hoa lưỡng tính ở giữa hình ống có 4-5 thùy Quả bế dẹt, có 3 cạnh màu đen.

Hình 1.1 Cây cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba ) [12]

Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô

Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11, loài cây này mọc hoang ở những khu vực ẩm mát ven làng và đồng ruộng, có thể phát triển từ vùng thấp lên đến độ cao 1800m Nó phân bố rộng rãi khắp các tỉnh thành từ Bắc vào Nam và còn có mặt tại nhiều quốc gia nhiệt đới khác ở châu Á và châu Phi.

Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn Quy kinh vào can và thận

Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc

Cây thuốc này thường được sử dụng để điều trị các vấn đề như nôn ra máu, chảy máu cam, và xuất huyết tử cung Nó cũng hiệu quả trong việc hỗ trợ các bệnh lý như viêm gan mạn, viêm ruột, và lỵ, đặc biệt ở trẻ em bị suy dinh dưỡng Ngoài ra, cây còn giúp giảm triệu chứng ù tai, rụng tóc do đẻ non, và suy nhược thần kinh Các ứng dụng khác bao gồm điều trị nấm da, vết loét, viêm da, cũng như các triệu chứng viêm họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, và đau dạ dày do nấm ngoài da gây ra.

1.2.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba )

Various studies on the chemical composition of Eclipta prostrata have revealed that it contains numerous chemical compounds, including coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids, triterpenoids, saponins, lipids, polyacetylenes, steroids, and phytosterols The leaves are particularly rich in wedelolactone, demethylwedelolactone, demethylwedelolactone-7-glucoside, stigmasterol, and β-terthienylmethanol The roots contain hentriacontanol and heptacosanol, while the aerial parts include phytosterols, β-amyrin in n-hexane extracts, luteolin-7-glucoside, β-glucoside of phytosterols, triterpenic acid glucosides, and wedelolactone.

Nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta alba cho thấy sự hiện diện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, cùng với các alkaloid steroid có hoạt tính sinh học như verazine, dehydroverazine và ecliptalbine Vào năm 1998, M S Kader và cộng sự từ Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ, đã phân lập được tám hợp chất alkaloid có khung steroid từ dịch chiết methanol của Eclipta alba, trong đó alkaloid chính được xác định là

(20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)-verazine

(2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25β-hydroxyverazine

Hình 1.2 Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid b Coumestan

Coumestan is a derivative of coumarin found in various plants Key coumestans isolated from the herb Eclipta prostrata include wedelolactone, demethylwedelolactone, and demethylwedelolactone-7-glucoside.

Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất Coumestan

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU c Flavonoid và Sterol

Flavonoids found in the plant Eclipta prostrata include apigenin, luteolin, luteolin-7-glucoside, and quercetin Additionally, the sterols present in this plant comprise phytosterol, phytosterol glucoside, daucosterol, β-sitosterol, stigmasterol, and stigmasterol-3-O-glycoside.

Hình 1.4 Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid

Hình 1.5 Cấu trúc của các hợp chất Sterol

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU d Saponin triterpen

Triterpene saponins, including eclalbatin, α-amyrin, ursolic acid, and oleanolic acid, have been isolated from Eclipta alba In 1997, S Yahara and colleagues from Kumamoto University in Japan successfully isolated eclalbasaponins VII-X.

24) [55] Năm 2008, M K Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III (26-28) và eclalbasaponin V (29) [40]

Hình 1.6 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1

Hình 1.7 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 e Dẫn xuất thiophen và polyacetylen

Năm 1966, F Bolhman và cộng sự từ Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức, đã phân lập hai dẫn xuất thiophen và polyacetylen từ lá khô của cỏ nhọ nồi Cùng năm, N R Krishnaswamy và nhóm nghiên cứu tại Đại học Delhi, Ấn Độ, đã xác định cấu trúc của α-terthienyl methanol từ Eclipta alba Năm 1985,

P Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34)

34 Hình 1.8 Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU f Tinh dầu

The main components of essential oils include heptadecane, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone, n-hexadecanoic acid, pentadecane, eudesma-4(14),11-diene, phytol, diisooctyl ester of octadec-9-enoic acid, (Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid, (Z)-7,11-dimethyl-3-methylene-1,6,10-dodecatriene, and (Z,Z,Z)-1,5,9,9-tetramethyl-1,4,7-cycloundecatriene Additional compounds include D-dithienylacetylene ester, ecliptal or α-terthienyl aldehyde, α-terthienyl-methanol, and α-formylterthienyl.

1.2.4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba ) a Tác dụng giảm đau, chống viêm

Dữ liệu thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid toàn phần của Eclipta alba có hiệu quả giảm đau đáng kể khi sử dụng liều 150mg/kg.

250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống Tác dụng giảm đau này có hiệu quả như nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47]

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết methanolic từ lá cỏ nhọ nồi có khả năng chống viêm hiệu quả, được thử nghiệm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng.

Liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol từ cỏ nhọ nồi khi dùng qua đường uống cho thấy hiệu quả chống viêm rõ rệt trong mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng, so sánh với indomethacin (10 mg/kg) và cyproheptadine (8 mg/kg) Ngoài ra, cỏ nhọ nồi cũng có tác dụng kháng khuẩn và chống nấm.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Eclipta alba có tiềm năng kháng khuẩn mạnh mẽ Các hợp chất chiết xuất từ Eclipta alba cho thấy hiệu quả tốt trong việc chống lại các vi khuẩn như Staphylococcus aureus, E coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng

Dược liệu nghiên cứu là cây cỏ nhọ nồi Eclipta alba, được thu hái từ tỉnh Thanh Hóa vào tháng 06/2018 Sau khi thu hoạch, dược liệu được sấy khô ở nhiệt độ 50-60 độ C để đạt độ ẩm khoảng 5%, sau đó được thái nhỏ hoặc xay nhỏ và bảo quản trong túi polymer ở nơi khô ráo, tránh ẩm.

2.2 Hóa chất, thiết bị 2.2.1 Hóa chất

- Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, n-hexan, ethyl acetat, dicloromethan, aceton

- Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol đốt nóng để phát hiện viết chất trên bản mỏng

- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

- Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck)

- Chất chuẩn wedelolacton, quercetin, methyl gallat đạt tinh khiết 98%

- Máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi)

- Máy cất quay Buchi dung tích bình cất 250ml, 500ml, 1000ml

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Bếp điện, bếp cách thủy Memmert

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đo hàm ẩm

- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

Dụng cụ thủy tinh bao gồm bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu với các dung tích 250ml, 500ml và 1000ml, cột sắc ký đa dạng, phễu thủy tinh, ống đong và ống nghiệm với nhiều kích thước khác nhau.

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập

Cỏ nhọ nồi được chiết xuất qua phương pháp chiết nóng bằng methanol, sau đó loại bỏ bã dược liệu và gộp dịch chiết Cuối cùng, dung môi được cất thu hồi dưới áp suất giảm để thu được cao đặc toàn phần.

Cao toàn phần được phân tán trong nước và được chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan và ethyl acetat, từ đó thu được các phân đoạn tương ứng.

Phân lập các hợp chất có thể thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột sử dụng silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong dung môi Quá trình sắc ký cột được tiến hành để tách biệt các thành phần hiệu quả.

Khảo sát cao tổng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau giúp lựa chọn hệ dung môi tối ưu, có khả năng tách tốt, từ đó làm dung môi rửa giải hiệu quả.

Để chuẩn bị cột sắc ký, cần đảm bảo cột khô, sạch và lắp thẳng đứng trên giá cố định Bắt đầu bằng cách nhồi một lớp bông xuống đáy cột, sau đó cân một lượng chất nhồi cột thích hợp và cho vào cốc có mỏ Thêm dung môi phù hợp và khuấy đều để loại bỏ bọt khí Từ từ đổ hỗn hợp chất nhồi lên cột, gõ nhẹ để tránh tạo bọt khí, rồi cho dung môi chảy liên tục qua cột cho đến khi cột ổn định.

Để nạp mẫu, cần trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, sau đó bay hơi dung môi cho đến khi thu được bột tơi mịn Tiếp theo, đưa mẫu lên cột và rải thành một lớp đều trên bề mặt cột Cuối cùng, đặt một miếng bông lên trên để bảo vệ bề mặt cột.

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải

Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck) và RP-18 (Merck) Việc phát hiện chất được tiến hành bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, kết hợp với thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.

Thu thập các phân đoạn có sắc ký đồ tương đồng và tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các chất đã phân lập bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sử dụng các hệ dung môi phù hợp.

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định nhờ sự kết hợp giữa các phương pháp phổ hiện đại và các đặc trưng hóa lý như điểm nóng chảy Trong đó, phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là hai phương pháp phổ phổ biến được sử dụng để xác định cấu trúc.

Phổ khối lượng cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử, với sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ tuân theo những định luật nhất định trong cùng một điều kiện ion hóa Các chất có cấu trúc tương tự sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau, cho phép xác định cấu trúc của chất chưa biết thông qua khối lượng các phân mảnh và các phương pháp phổ khác So sánh phổ khối của chất chưa biết với phổ khối của chất đã biết giúp định danh chất đó một cách dễ dàng và chính xác.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là hiện tượng xảy ra khi một chất có hạt nhân với số spin lẻ (như 1H, 13C) được đặt trong từ trường ngoài (B0) Trong điều kiện này, các spin hạt nhân sẽ sắp xếp theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường, đạt trạng thái cân bằng với tỉ lệ xác định giữa hai trạng thái Khi chiếu xạ bức xạ điện từ với tần số phù hợp lên chất, các spin sẽ hấp thu năng lượng và chuyển lên mức năng lượng cao, tức là sắp xếp ngược chiều với từ trường.

Khi ngừng chiếu xạ, các spin hạt nhân giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Năng lượng mà các hạt nhân cùng loại nguyên tố trong phân tử hấp thụ hoặc giải phóng được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó.

Tùy thuộc vào mục đích và độ phức tạp của cấu trúc, có thể đo nhiều loại phổ khác nhau Việc xác định phổ cho cùng một loại hạt nhân như 1H hoặc 13C có thể thực hiện qua các phương pháp phổ một chiều như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, hoặc thông qua các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong phổ hai chiều như COSY.

Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cỏ nhọ nồi là:

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi

Lấy 2 kg cỏ nhọ nồi được xay mịn chiết nóng với MeOH, chiết 3 lần ở 70 0 C, mỗi lần 3 giờ, với tỉ lệ DL/DM: 1/8 Sau đó, lọc lấy dịch chiết và cô dưới áp suất giảm thu được cao tổng NTP (288,3 g)

Phân tán 280g NTP vào 2 lít nước và lắc với hệ dung môi n-hexan và EtOAc theo thứ tự tăng dần độ phân cực, thực hiện 3 lần với mỗi dung môi Sau khi gộp dịch chiết, tiến hành cô dưới áp suất giảm để thu được các phân đoạn tương ứng, bao gồm phân đoạn n-hexan (NH).

20,6g), phân đoạn EtOAc (NE: 60,9g) và phân đoạn nước (NW: 197,3 g) được biểu diễn như Hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi

1 Phân tán cao trong nước

2 Lắc phân đoạn lần lượt với n-hexan (x3), EtOAc (x3)

Cao EtOAc (NE) (60,9g) Cao n-hexan (NH)

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi

Sử dụng 60g cao phân đoạn NE, tiến hành sắc ký cột pha thường với silica gel và hệ dung môi gradient DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) đã thu được 7 phân đoạn, được ký hiệu là NE1-7.

Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với dung môi DCM-MeOH (10/1) cho các phân đoạn NE4.1-4.4 Phân đoạn NE4.1 (1,9g) được tinh chế bằng sắc ký cột pha thường với dung môi DCM-MeOH (8/1), thu được hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg) Tương tự, phân đoạn NE4.2 (1,1g) cũng trải qua sắc ký cột pha thường với dung môi DCM-MeOH (8/1), dẫn đến việc thu được hợp chất N03 (48mg).

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của cỏ nhọ nồi

CC: pha thường DCM/MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1)

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (10/1)

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (8/1)

CC: pha thườngDM: DCM/MeOH (8/1)

UV 254nm UV 366nm TT H 2 SO 4 10%/Ethanol

Hình 3.3 SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc

Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi

Hợp chất N01: chất bột màu trắng

Phân tích ESI-MS cho thấy m/z 314 [M + ] tương ứng với công thức phân tử C16H10O7 Các dữ liệu từ phổ 13C-NMR, 1H-NMR và DEPT (Bảng 3.1) hoàn toàn khớp với cấu trúc phân tử của wedelolacton (Hình 3.3).

Phổ 1 H-NMR cho tín hiệu proton của nhóm methoxy ở δ H 3,88 (3H, s, H-15)

Hai tín hiệu proton ở vị trí para của vòng thơm ở δ H 7,35 (1H, s, H-13), 7,16 (1H, s, H-10); Hai tín hiệu ở δ H 6,44 (1H, d, J=2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8) là tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta

Phổ 13 C-NMR của N01 có 16 tín hiệu carbon, trong đó: tín hiệu cacbon cacbonyl của vòng lacton ở δ C 164,0; 4 tín hiệu ở δ C 99,5; 94,5; 99,6 và 106,0 là tín hiệu của 4 nhóm CH kề nối đôi (CH=), 10 tín hiệu ở 103,3; 161,4, 98,4, 156,3, 164,4, 157,0, 151,2, 146,7, 115,7 là tín hiệu của 10 carbon bậc 4 kề nối đôi Tín hiệu ở 56,3 là cacbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene Phổ HMBC cho thấy nhóm OCH3 này tương tác với C7 (δ = 164,4)

Tương tác H→C trên phổ HMBC đã giúp xác định chính xác vị trí của các proton và carbon trong phân tử N01 Dựa vào kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố, cấu trúc của N01 được xác định là 5,11,12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan, hay còn gọi là Wedelolactone.

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton)

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton

Hợp chất N02: Chất rắn màu vàng, điểm nóng chảy 313-314 o C

R f = 0,35 (TLC, silica gel, CH2Cl2 /MeOH 9/1,v/v), Hiện màu vàng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin

Phân tích phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT của chất N02 cho thấy các tín hiệu đặc trưng của flavonol Trong phổ 1 H-NMR, có 5 tín hiệu proton vòng thơm, trong đó 3 tín hiệu tương tác ABX xuất hiện ở δ H 7,82 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,69 (1H, dd, J 8,5; 2,0 Hz, H-6'), và 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5') thuộc vòng thơm B Hai tín hiệu proton tương tác meta ở δ H 6,51 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,26 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) thuộc vòng thơm A.

Phổ 13 C-NMR và DEPT chỉ ra chất N02 gồm 15 cacbon với 5 CH nhân thơm ở δ C 99,1 (C-6), 94,4 (C-8), 115,7 (C-2'), 116,2 (C-5') và 121,4 (C-6'), 10 C trong đó tín hiệu δ C 176,5 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl, bốn cacbon có độ chuyển dịch δ C 145,8, 148,3, 162,3, 164,9 ppm đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm OH của các cacbon C-3', C-4', C-5, C-7 Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δ C

136,7 (C-3) đặc trưng cho cacbon của nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl

Dựa trên dữ liệu phổ và so sánh với các điểm nóng chảy cùng với thông tin từ các nghiên cứu trước đây [5], cấu trúc của chất N02 đã được xác định là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone, hay còn gọi là quercetin.

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin) 3.2.3 Biện luận cấu trúc N03

Hợp chất N03: Chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy là 201-202°C

Mẫu hiện màu nâu khi chiếu sáng bằng UV 254 nm, nhưng không hiện màu ở UV 365 nm Sau khi xử lý bằng thuốc thử H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng, mẫu sẽ hiện màu đen khi tiếp xúc với dung dịch FeCl3/etanol 5%.

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat

Phổ 1 H-NMR của chất N03 cho một tín hiệu singlet của hai proton trong vòng thơm δ H 7,07 (2H, s, H-2 & H-6) Sự có mặt của một metyl este thể hiện qua tín hiệu singlet của proton metyl δ H 3,83 (3H, s, H-OCH3)

Phổ 13 C-NMR của N03 cho tín hiệu của 8 cacbon trong đó tín hiệu của cacbon cacbonyl ở δ C 169,0 (C-7), cacbon metyl este δ C 52,3 Sáu cacbon thuộc về vòng thơm xuất hiện trong khoảng chuyển dịch δ C 110,1-146,4, trong đó C-1 và C-4 cho tín hiệu tương ứng ở δ C 121,5; 139,7 Tín hiệu chồng chập của hai cacbon methin C-2 và C-6 ở δ C 110,1 với cường độ mạnh Tương tự vậy, hai cacbon vòng thơm còn lại C-3 và C-5 xuất hiện ở δ C 146,4 Các dữ kiện phổ trên gợi ý cho ta về cấu trúc một phenolic thế tetra ở các vị trí 1,3,4,5 của hợp chất N03 trong đó có một metyl este và ba nhóm còn lại là hydroxy Các tương tác HMBC cho phép xác định cụ thể từng vị trí của các nhóm chức vào nhân thơm Từ nhận định trên, kết hợp với tài liệu tham khảo [43] cho phép kết luận cấu trúc của hợp chất N03 là methyl 3,4,5-trihydroxybenzoate hay methyl gallat

Bàn luận

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dung môi MeOH, lựa chọn này do tính đơn giản, dễ thực hiện và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm Mặc dù MeOH có khả năng chiết xuất nhiều nhóm hoạt chất và dễ kiếm, nhưng cần lưu ý rằng đây là một dung môi độc Sau đó, cao chiết sẽ được phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan và EtOAc, nhằm thuận lợi cho quá trình phân tách tiếp theo.

3.3.2 Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

Quá trình phân lập các chất hóa học bằng phương pháp sắc ký cột là một kỹ thuật dễ thực hiện, chi phí thấp và hiệu quả cao, phù hợp cho quy mô phòng thí nghiệm Để lựa chọn phân đoạn và thăm dò hệ dung môi rửa giải, cũng như định tính và theo dõi các chất trong quá trình phân lập, phương pháp sắc ký lớp mỏng được áp dụng.

Bằng phương pháp sắc ký và hệ dung môi rửa giải phù hợp, ba hợp chất N01, N02, N03 đã được phân lập thành công Dựa trên dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và đối chiếu với tài liệu đã công bố, cấu trúc của các hợp chất này lần lượt được xác định là wedelolacton, quercetin và methyl gallat.

Wedelolacton là một coumestan quan trọng có trong cây cỏ nhọ nồi, đóng vai trò lớn trong các tác dụng dược lý Nghiên cứu đã chỉ ra rằng wedelolacton có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm khả năng ức chế phospholipase A2, RNA-polymerase của virus viêm gan C và các hoạt động của Na +, K + -ATPase.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU được sử dụng như thuốc để kháng lại nọc độc rắn và có khả năng chống oxy hóa [19],

Tác dụng chống viêm đã được chứng minh qua việc ức chế hoạt động của IKK, cho thấy tiềm năng trong việc giảm nồng độ IL-1β trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, hen suyễn và sốc nhiễm trùng.

Wedelolactone đã được chứng minh có tác dụng chống ung thư hiệu quả, bao gồm việc ức chế sự phát triển của carcinosarcoma và tế bào adenoma tuyến yên in vitro Ngoài ra, hợp chất này cũng ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt cả in vitro và in vivo Đặc biệt, wedelolactone ức chế sự tăng trưởng và gây ra hiện tượng apoptosis trong các tế bào ung thư vú MDA-MB-231, nhờ vào khả năng liên kết với DSDNA, ức chế topoisomerase IIa và ngăn chặn sự tổng hợp DNA.

Wedelolacton đã được nghiên cứu và chứng minh khả năng chống viêm, cũng như phòng và chữa bệnh nhiễm trùng nặng Nghiên cứu tại Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội cho thấy wedelolactone có tác dụng làm giảm các phản ứng viêm do zymosan gây ra.

Quercetin, một flavonoid nổi tiếng, đã được sử dụng trong chế độ ăn uống của con người từ lâu và mang lại nhiều lợi ích sức khỏe Các tác dụng nổi bật của quercetin bao gồm khả năng chống oxy hóa, hỗ trợ giảm béo phì, chống viêm, kháng vi-rút, kháng khuẩn và phòng ngừa ung thư.

Quercetin có tiềm năng điều trị ung thư mạnh mẽ, ức chế sự tăng sinh của nhiều loại tế bào ung thư như tế bào ung thư đại trực tràng, tuyến tiền liệt, gan, tụy và phổi Hoạt động này diễn ra thông qua việc tác động đến chu trình tế bào và ngăn chặn sự phát triển của chúng Chức năng chống ung thư của quercetin được cho là liên quan đến khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ của nó.

Nghiên cứu cho thấy quercetin có tác dụng tích cực trong việc ức chế bệnh tim mạch, đặc biệt ở bệnh nhân tăng huyết áp Việc sử dụng quercetin với liều 730 mg/ngày trong 4 tuần đã giúp giảm huyết áp tâm thu (giảm 7 mm Hg), huyết áp tâm trương (giảm 5 mm Hg) và áp lực động mạch trung bình (giảm 5 mm Hg) Ngoài ra, một nghiên cứu khác cho thấy ở những người béo phì mắc hội chứng chuyển hóa, việc sử dụng 150 mg quercetin/ngày trong 42 ngày cũng đã làm giảm huyết áp tâm thu và mức LDL do xơ vữa.

Homer et al (1990) đã nghiên cứu khả năng ngăn chặn hoạt động phân giải protein của một số vi khuẩn như Bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius và Treponema denticola Methyl gallat có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của E coli mà không ảnh hưởng đến vi khuẩn sản xuất axit lactic, đồng thời kết hợp hiệp đồng với ciprofloxacin để chống lại Salmonella.

Methyl gallat được biết đến như một trong những chất chống oxy hóa [24]

Ngoài ra, methyl gallat còn có tác dụng kháng tiểu cầu [41], bảo vệ DNA khỏi tổn thương do stress oxy [28], giảm stress oxy hóa trong tiểu đường [13]

Tiêu đề	Chiết Xuất, Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Một Số Hợp Chất Trong Cây Cỏ Nhọ Nồi (Eclipta alba)
Tác giả	Đinh Thị Nguyệt Ánh
Người hướng dẫn	Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh, PGS.TS. Dương Thị Ly Hương
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	2,54 MB