Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm chiết xuất, phân lập được một số hợp chất từ cây Chua me đất hoa vàng. Xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ở trên. Mời các bạn cùng tham khảo!
TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Oxalis
1.1.1 Vị trí phân loại chi Oxalis
Theo hệ thống phân loại thực vật APG III (2009) [37], vị trí phân loại chi Oxalis là:
Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae)
Bộ Chua me đất (Oxalidales)
Họ Chua me đất (Oxalidaceae)
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Oxalis
Chi Oxalis thuộc họ Chua me đất (Oxalidaceae) chủ yếu là cây thân thảo sống hai năm hoặc nhiều năm, có thể gần hóa gỗ Cây có thể có củ hoặc hành và chứa nhiều acid oxalic Lá mọc so le, thường gồm 3-4 lá chét, đôi khi có từ 5 đến 20 lá chét, và có thể thực hiện cử động thức ngủ Hoa của cây thường xuất hiện ở nách lá hoặc từ gốc, với cấu trúc gồm 5 lá đài và 5 cánh hoa.
Nhị hoa có 10, trong đó 5 nhị ngắn và 5 nhị dài, với phần hướng vào trong Hoa có 5 ô và 5 vòi nhụy Quả nang mở theo ô, vỏ quả bên ngoài có đỉnh đàn hồi, giúp hạt được phát tán khi chín Hạt chứa nội nhũ.
Chi Oxalis, thuộc họ Chua me đất, là chi lớn nhất với khoảng 950 loài, chủ yếu phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam Mỹ, Nam Phi, Madagascar và Châu Á Một số loài cũng xuất hiện ở các khu vực ôn đới ẩm.
Chi Oxalis ở Việt Nam có 04 loài, trong đó có 03 loài được dùng để làm thuốc [3, 4]
Oxalis acetosella L., hay còn gọi là chua me đất, là một loại cây thấp, cao từ 5-8 cm, với gốc mảnh và thân rễ bò lan Lá cây có cuống dài, gồm ba lá chét hình tim và phiến lá lõm Hoa của cây mọc đơn lẻ trên cuống dài, có lá bắc con, tràng hoa màu trắng với vân hồng Quả nang của cây có chiều cao lên đến 6 mm, khi chín sẽ tách ra và phát tán hạt Thời gian ra hoa thường vào tháng 8 Tại Việt Nam, loài cây này chủ yếu phân bố ven các thác nước và trong rừng thưa ở độ cao 1500 m tại Sapa, tỉnh Lào Cai.
Oxalis corniculata L (hay còn gọi là Chua me đất hoa vàng) là một loại cây thảo sống lâu năm, có đặc điểm thân bò sát mặt đất, thân mảnh màu đỏ nhạt và có lông Lá cây có cuống dài, gồm 3 lá chét mỏng hình tim ngược Hoa của cây thường mọc thành tán, có từ 2 đến 4 hoa màu vàng Quả của cây là dạng nang thuôn dài, khi chín sẽ mở ra.
Cây 5 van, tung hạt đi xa, có hạt hình trứng màu nâu thẫm, dẹt và có bướu Hoa nở từ tháng 3 đến tháng 7, cây mọc phổ biến ở khắp nơi tại Việt Nam, thường tìm thấy ở những nơi đất ẩm mát, có đủ ánh sáng như trong các vườn, bờ ruộng và các bãi đất hoang.
Oxalis corymbosa DC (O martiana Zucc.) – Chua me đất hoa hồng:
Cây thảo có rễ đứng, nạc và trắng, được bao phủ bởi một vòng các hành nhỏ Lá cây có cuống chung nạc với các tuyến, mang ba lá chét hình xoan, dài khoảng 2 cm và rộng.
3 cm, lõm sâu ở giữa, có lông mi Tán đơn hoặc kép, thân có hoa dài 10-12 cm, mang 4-12 hoa màu hồng, có sọc, hơi cong xuống [4]
Oxalis deppei Lodd (O tetraphylla Cav.), hay còn gọi là Chua me đất hoa đỏ, là loại cỏ có củ lớn, đường kính lên đến 2 cm và những củ non với vẩy bao rộng khoảng 2,5 cm Lá của cây có cuống đứng, chiều cao có thể đạt đến mức tối đa.
40 cm, thường mang 4 lá chét dài đến 6 cm, đầu lõm ít, không lông hay có lông
Trục cụm hoa cao 50 cm với lá bắc dài 2-3 mm và cuống hoa cao 3 cm Lá đài có kích thước từ 5-7 mm, trong khi cánh hoa dài 2,5 cm và có màu đỏ đậm Bầu hoa không có lông Loài cây này có nguồn gốc từ Mexico và được nhập khẩu để trồng làm cây cảnh.
1.1.4 Thành phần hóa học chi Oxalis
The chemical composition of the Oxalis genus primarily includes oxalic acid, potassium oxalate, calcium oxalate, ascorbic acid, alkaloids, phenols, tannins, flavonoids, saponins, steroids, glycosides, carbohydrates, phytosterols, terpenoids, tocopherol, phylloquinone, chlorophyll, various amino acids, proteins, tartaric acid, citric acid, malic acid, palmitic acid, and a mixture of stearic, oleic, linoleic, and linolenic acids Additionally, Oxalis contains carotenoids, anthocyanins, betaxanthins, betacyanins, vanillic acid, cinnamic acid, and caffeic acid.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tổng quan về loài Oxalis corniculata L
Tên khoa học: Oxalis corniculata L [1]
Tên đồng nghĩa: Oxalis repens Thunb., Oxalis javanica Blume [1, 6]
Tên tiếng Việt: Chua me đất hoa vàng, Toan tương thảo, Tạc tương thảo, Toan vị vị, Tam diệp toan, Chua me ba chìa, Sỏm hém (Tày) [1, 6]
Tên nước ngoài: Yellow Oxalis, Yellow Creeping Lady’s Sorrel, India sorrel, Pimson weed, Procumbent Oxalis, Procumbent yellow sorrel (Anh),
Surrele jaune, Acétoscelle à fleurs jaunes, Trèfle jaune (Pháp) [1]
Họ: Chua me đất (Oxalidaceae) [1]
Cây thân thảo sống lâu năm, bò sát đất với thân màu đỏ, hình trụ và hơi có lông Lá cây có 3 lá chét, hơi có lông hoặc gần nhẵn, mỏng và hình tim ngược, với cuống lá mảnh có lông và hai chỗ lồi ở gốc thuộc về lá kèm Cụm hoa mảnh, hơi có lông, tạo thành tán thưa với 2-4 hoa, lá bắc hẹp và nhọn có lông, cuống hoa rất nhỏ Hoa có màu vàng, với 5 lá đài rời nhau, thuôn mũi mác và tù ở ngọn.
Hoa có 5 cánh dài hơn lá đài, trải ra, tù ở ngọn, nhẵn, mỏng và màu vàng, có khả năng khai vận Có 10 nhị rời nhau, chỉ nhị đứng mọc rất mảnh, 5 cái đối diện với cánh hoa, dài bằng lá đài Bao phấn hình bầu dục, có 2 ô, hướng trong và nứt dọc Bầu dài, có lông, có 5 ô và 5 vòi ngắn, có lông, đầu nhụy hình đầu Noãn nhiều, treo và đảo Quả nang kéo dài, dài 5-6 lần so với đài, mang 5 vòi, nứt chẻ ô, các mảnh vỏ cong lại và phát tán hạt Hạt hình trứng, có mũi nhọn, dẹt bên, màu nâu sẫm.
Bộ phận dùng: toàn cây hoặc chỉ dùng lá, thường dùng tươi Mùa thu hái tốt nhất vào tháng 6-7 [6]
Hình 1.1: Hình vẽ mô tả cây Chua me đất hoa vàng [19]
Chua me đất hoa vàng là loại cây phổ biến, phân bố rộng rãi trên toàn cầu, từ vùng núi đến trung du, đồng bằng và các đảo Loại cây này có mặt ở hầu hết các quốc gia nhiệt đới và ôn đới, bao gồm châu Phi, Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ, cũng như nhiều nước châu Á như Đông Nam Á, Trung Quốc, Nepal và Ấn Độ.
Loài cây này phổ biến khắp Việt Nam, thường mọc xen kẽ với các loại cây trồng khác trong vườn, đồng ruộng, bãi sông, đồi và nương rẫy Cây ưa đất ẩm và có khả năng chịu bóng Mỗi năm, cây con nảy mầm từ hạt vào cuối mùa xuân, phát triển nhanh chóng trong mùa hè và có thể tàn lụi vào mùa thu sau khi ra hoa kết quả Tuy nhiên, những cây mọc muộn vào cuối mùa hè hoặc đầu thu có thể sống sót qua mùa đông.
Loài Oxalis corniculata L chứa gần như đầy đủ các thành phần hóa học phổ biến đã được nghiên cứu trong chi Oxalis Loài này chứa acid oxalic, muối
Chú thích: a, Cụm hoa b, Hoa c, Bộ nhị d, Bộ nhụy e, Hạt f, Quả
The School of Medicine and Pharmacy at VNU highlights the diverse chemical composition of certain species, which includes phenols, tannins, tartaric acid, citric acid, malic acid, palmitic acid, glycosides, carbohydrates, phytosterols, and terpenoids Additionally, this species contains a mixture of stearic acid, oleic acid, linoleic acid, and linolenic acid, along with various amino acids and proteins Essential elements such as carbon (C), nitrogen (N), phosphorus (P), sodium (Na), calcium (Ca), potassium (K), magnesium (Mg), sulfur (S), zinc (Zn), copper (Cu), and iron (Fe) are also present.
Một số thành phần hóa học trong loài Oxalis corniculata L được phân tích định lượng (Bảng 1) [23]
Bảng 1: Hàm lượng một số thành phần trong loài Oxalis corniculata L.
Công thức phân tử: C2H4O4 Khối lượng phân tử: 90,037 g/mol
Cấu trúc hóa học (Hình 1.2)
Tinh thể trắng, không mùi, có tính chất thăng hoa và dễ tan trong nước với độ tan 220 g/L ở 25°C Chất này cũng tan trong ethanol, nhưng ít tan trong ether và hoàn toàn không tan trong chloroform, benzen, và xăng dầu.
STT Tên thành phần Hàm lượng STT Tên thành phần Hàm lượng
10 Zn (ppm) 1,59 21 Glycosid (mg kg -1 ) 0,02
11 Cu (ppm) 0,12 22 Serpentin (mg kg -1 ) 0,01
Loài Oxalis corniculata L chứa muối oxalat như calci oxalat và kali oxalat, có thể gây độc ở liều cao Muối oxalat chủ yếu tồn tại dưới dạng muối kali tan, kết hợp với calci huyết thanh tạo thành calci oxalat không tan Sự giảm calci máu có thể dẫn đến co giật và trụy tim mạch Trong trường hợp ngộ độc Chua me đất hoa vàng, đã phát hiện tinh thể calci oxalat, có thể gây suy thận cấp do nghẽn tiểu quản thận, với triệu chứng ngộ độc là vô niệu Trên động vật thí nghiệm, triệu chứng ngộ độc cấp tính bao gồm thận to, tái nhợt, mất kiểm soát sức lực hoặc thân sau và co cứng cơ.
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của acid oxalic
Công thức phân tử: C6H8O6 Khối lượng phân tử: 176,124 g/mol
Cấu trúc hóa học (Hình 1.3)
Tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, dễ tan trong nước và ethanol, nhưng không tan trong ether, chloroform, benzen, và dầu Chất này dễ bị oxi hóa trong không khí và quá trình oxi hóa diễn ra nhanh hơn khi có sự hiện diện của sắt (Fe).
Cu Độ tan trong nước: 400 g/L ở 25 o C
Acid ascorbic bị oxy hóa cho acid dehydroascorbic tạo phản ứng oxy hóa khử thuận nghịch
Acid ascorbic dùng để phòng và chữa bệnh Scorbut, các chứng chảy máu do thiếu vitamin C, tăng sức đề kháng trong nhiễm khuẩn, nhiễm độc, mệt mỏi,
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Dùng vitamin C liều cao có thể tạo sỏi oxalat (do dehydroascorbic chuyển thành acid oxalic) hoặc sỏi thận urat, rối loạn tiêu hóa, giảm độ bền hồng cầu [2]
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của acid ascorbic
Một số flavonoid phân lập từ loài Oxalis corniculata L.:
- Flavonoid glycosid: luteolin-6''-(E-p-hydroxycinnamoyl)4'-O-β-D- glucopyranosid (corniculata A) (1) [29]
- Glycosylflavon: 6-C-glucosylluteolin (isoorientin) (2), 6-C- glucosylapigenin (isovitexin) (3), isovitexin 7-methylether (sertisin) (4), isovitexin 4’-methylether (5), orientin 3',4'-dimethylether (6), vitexin 4’- methylether (7) [34]
- Flavon: 5-hydroxy-7,8-dimethoxyflavon (8), 5-hydroxy-3',4',6,7,8- pentamethoxyflavon (9), 7,5'-dimethoxy-3,5,2'-trihydroxyflavon (10), 5- hydroxy-3,6,7,4'-tetramethoxyflavon (11), 4',5-hydroxy-3,6,7- trimethoxyflavon (12), 5-hydroxy-3,6,7,4´-tetramethoxyflavon (13), acacetin
(14), apigenin 7,4’-dimethylether (15), apigenin 7-O-β-D-glucosid (16) và
- Isoflavon: 4’,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavon (19), 4’,5,7- trihydroxy-3’,6-dimethoxyisoflavon (20), 3’,5,7-trihydroxy-4’,5’,6- trimethoxyisoflavon (21) [7]
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.4: Một số flavonoid phân lập từ loài Oxalis corniculata L
1.2.4.4 Một số hợp chất khác β-sitosterol
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU β-caroten
Hình 1.5: Một số hợp chất khác phân lập từ loài Oxalis corniculata L [34]
1.2.5 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu 1.2.5.1 Tác dụng kháng khuẩn
Dịch chiết từ loài Oxalis corniculata L có hoạt tính kháng khuẩn đối với
Xanthomonas cùng với 14 loại vi khuẩn gây bệnh khác ở người cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể khi sử dụng dịch chiết methanol và ethanol, so với K-cycline và Bact-805 đối với mầm bệnh thực vật, cũng như Gentamicin và Streptomycin đối với mầm bệnh ở con người.
Dịch chiết từ loài Oxalis corniculata L được sàng lọc chống lại bốn chủng vi khuẩn gây bệnh trên da: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis và Pseudomonas aeruginosa [35]
1.2.5.2 Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết ethanol từ Oxalis corniculata L có hoạt tính chống oxy hóa đáng kể trên chuột ở nhiều liều khác nhau Đặc biệt, dịch chiết methanol từ loài này thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ hơn so với acid ascorbic tiêu chuẩn.
Chua me đất hoa vàng chứa nhiều hoạt chất chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E, acid ascorbic, flavonoid, acid phenolic và glutathion, giúp loại bỏ gốc tự do, thúc đẩy các phản ứng sinh hóa có lợi cho cơ thể và ngăn ngừa quá trình lão hóa.
Arijit Dutta và cộng sự (2015) đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết ethanol từ lá Oxalis corniculata L trên chuột, cho thấy cả ba liều 200 mg/kg, 300 mg/kg và 400 mg/kg đều có hiệu quả chống viêm rõ rệt (p < 0,01) Loài cây này cũng được áp dụng rộng rãi trong Y học cổ truyền Ấn Độ để điều trị các vấn đề liên quan đến viêm, lợi tiểu, kháng khuẩn và sát trùng.
1.2.5.4 Tác dụng bảo vệ gan
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết ethanol từ lá cây Chua me đất hoa vàng có khả năng bảo vệ gan hiệu quả Cụ thể, khi sử dụng ở liều 200 mg/kg và 400 mg/kg, dịch chiết này đã làm giảm đáng kể các chỉ số men gan như SGOT, SGPT, GGT, ALP và tổng bilirubin, đồng thời giảm thiểu tình trạng hoại tử gan.
1.2.5.5 Tác dụng bảo vệ thần kinh
Năm 2017, nhóm nghiên cứu của K Aruna đã chỉ ra rằng dịch chiết ethanol từ loài Oxalis corniculata L có khả năng làm suy yếu sự suy giảm nhận thức và hành vi do 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro pyridine (MPTP) gây ra trên mô hình chuột điều trị Parkinson Khả năng này được cho là nhờ vào các hợp chất có trong loài thực vật này.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chống oxy hóa trong dịch chiết như flavonoid, coumarin, tocopherol và các acid phenolic [24]
1.2.5.6 Một số tác dụng khác
- Tác dụng an thần: dịch chiết ethanol từ Chua me đất hoa vàng làm giảm lo âu, căng thẳng, suy nhược thần kinh [34]
Oxalis corniculata L has beneficial effects in supporting diabetes treatment by enhancing the activity of antioxidant enzymes, inhibiting α-amylase activity, and reducing levels of triglycerides, LDL, and cholesterol.
- Tác dụng chống ung thư: dịch chiết ethanol từ loài Oxalis corniculata
L của loài ức chế sự tăng trưởng khối u ở tuyến yên và khối u rắn [34]
- Tác dụng chống loét: cao nước từ lá cây Chua me đất hoa vàng làm giảm vết loét niêm mạc dạ dày [31]
- Tác dụng chống giun sán: dịch chiết ether, methanol và ethyl acetat có tác dụng chống giun sán đáng kể so với Levamisole (0,55 mg/ml) tiêu chuẩn
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu
Hình 2.1: Hình ảnh cụm cây và cây Chua me đất hoa vàng
Cây Chua me đất với hoa vàng được thu hái vào tháng 7 năm 2016 tại xã Cẩm Sơn, huyện Cẩm Xuyên, tỉnh Hà Tĩnh Phần trên mặt đất của cây đã được phơi sấy khô và bảo quản trong túi nilon kín Mẫu thực vật mang số hiệu Vũ Đức Lợi.
11) đã được Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam liệu giám định tên khoa học là: Oxalis corniculata L., họ Chua me đất (Oxalidaceae) (chi tiết theo “Kết quả giám định tên khoa học mẫu thực vật” – Phụ lục 3) Mẫu cũng đang được lưu giữ tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
2.1.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.2.1 Hóa chất và dung môi
- Các dung môi công nghiệp dùng để chiết xuất và phân lập: methanol, ethyl acetat, chloroform, n-hexan, aceton, dichloromethan, acetonitril
- Các dung môi tinh khiết dùng trong sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng
- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck)
Bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254s của Merck có độ dày lần lượt là 0,2 mm và 0,25 mm Sau khi thực hiện sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm Để phát hiện vết chất, bản mỏng được hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance
500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Phổ khối ESI-MS đo trên máy Varian Agilent 1100 LC-MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy SMP10 BioCote tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm…
Các dụng cụ khác thuộc Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa
Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu sau khi rửa sạch, phơi khô và thái nhỏ được ngâm chiết ba lần bằng methanol dưới sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40°C trong 3 giờ Dịch chiết thu được được lọc qua giấy lọc, sau đó gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao toàn phần.
Cao chiết được phân tán trong hỗn hợp MeOH và nước với tỷ lệ 1:1, sau đó thực hiện chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan, dichloromethan và ethyl acetat Các phân đoạn n-hexan, dichloromethan và ethyl acetat sau đó được cất để loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao tương ứng từ từng phân đoạn.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Dịch chiết methanol Dược liệu
Phân đoạn nước Phân đoạn nước
Phân tán trong MeOH : nước (1:1) Lắc phân đoạn với n-hexan
Lắc với ethyl acetat Thu hồi dung môi
Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách phân đoạn
Lựa chọn các phân đoạn có tiềm năng là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu Sau đó, tiến hành xử lý và phân lập các hợp chất từ những phân đoạn đã chọn Phương pháp sắc ký cột chủ yếu được sử dụng để thực hiện việc phân lập này Để theo dõi tiến trình, các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế.
Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel làm chất hấp phụ, bao gồm cả pha thường và pha đảo, với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Silica gel pha thường có kích cỡ hạt từ 0,063-0,200 mm (Merck) và 0,040-0,063 mm (Merck), phù hợp với nhiều loại cột sắc ký khác nhau.
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng silica gel 60 F254 (Merck) với độ dày 0,2 mm và RP-18F254s, độ dày 0,25 mm (Merck) Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch.
H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ
Sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC) được thực hiện trên bản mỏng nhôm phủ silica gel 60G F254, dày 1,0 mm (Merck) Sau khi tiến hành sắc ký, bản mỏng sẽ được kiểm tra dưới đèn tử ngoại tại bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc có thể cắt rìa bản mỏng để phun dung dịch thử H2SO4 10% trong ethanol Sau đó, bản mỏng được đốt nóng trên bếp điện từ và ghép lại để xác định vùng chất bằng dung môi phù hợp.
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập thông qua phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) là một quy trình quan trọng Việc so sánh dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các thông tin đã được công bố giúp xác thực và hoàn thiện cấu trúc của các hợp chất này.
Phổ khối cung cấp thông tin về khối lượng của các ion từ phân tử bằng cách xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z) Để xác định khối lượng phân tử, cần biết số điện tích của ion.
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con
Việc phân tích khối lượng các phân mảnh của phân tử cho phép xác định cấu trúc của chất chưa biết Bằng cách so sánh phổ khối của chất chưa biết với phổ khối của chất đã biết, chúng ta có thể định danh chất đó một cách dễ dàng và chính xác.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cung cấp thông tin về môi trường hóa học của proton trong phân tử, với các proton trong các môi trường khác nhau sẽ có sự dịch chuyển hóa học khác nhau Mỗi nhóm proton có cùng môi trường hóa học sẽ hiển thị trên phổ dưới dạng một đỉnh, có thể là đỉnh đơn, đôi, ba, hoặc lên đến bảy đỉnh thành phần Diện tích của mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton tương ứng, cho phép xác định số lượng proton của đỉnh đó thông qua diện tích.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp thông tin quan trọng về môi trường hóa học của carbon Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố có sự chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm, trong khi carbon liên kết đơn với oxy (như alcol và ether) có chuyển dịch từ 45-85 ppm Đối với carbon lai hóa sp2, chuyển dịch xảy ra trong khoảng 100-150 ppm, và nếu có liên kết đôi với oxy, chuyển dịch có thể lên tới 240 ppm Kỹ thuật đo phổ hiện tại cho thấy phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch tương ứng với một carbon, hoặc nhiều carbon nếu chúng có cùng môi trường hóa học.
Kỹ thuật DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) được sử dụng để xác định số lượng proton liên kết trên mỗi nguyên tử carbon, từ đó gián tiếp cung cấp thông tin về số lượng carbon và hydro trong phân tử.
Các kỹ thuật phổ hai chiều như COSY giúp xác định tương tác giữa các proton của carbon gần nhau, trong khi HETCOR (thường là HSQC) cho phép nghiên cứu sự tương tác giữa proton và carbon lân cận Đối với các tương tác xa hơn, kỹ thuật HMBC (long-range HETCOR) được sử dụng, cùng với các phương pháp NOESY và ROESY để phân tích tương tác giữa các proton gần nhau trong không gian.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất
Phần trên mặt đất của cây Chua me đất hoa vàng được phơi khô và nghiền thành bột (2,4 kg), sau đó ngâm chiết với methanol (8,0 lít x 3 lần) Cuối cùng, dịch chiết methanol được quay cất để loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm.
Lấy 176 g dịch cô hòa vào 1,5 lít hỗn hợp MeOH và nước (1:1, v/v), sau đó chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan, dichloromethan và ethyl acetat, để thu được các phân đoạn tương ứng.
Sau đó, các phân đoạn này được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn chiết n-hexan (60 g), dichloromethan (28 g), ethyl acetat (18 g) và dịch nước còn lại
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất phân đoạn loài Oxalis corniculata L
Dược liệu được nghiền thành bột (2,4 kg)
Chiết methanol (8,0 lít x 3 lần) Thu hồi dung môi
Phân tán trong MeOH : nước (1:1) Lắc với n-hexan
Dịch chiết nước Thu hồi n-hexan
Thu hồi dichloromethan Dịch chiết nước
Thu hồi ethyl acetat Cao methanol lưu (20 g)
Phân đoạn ethyl acetat từ cây Chua me đất hoa vàng được tách bằng phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường Cột sắc ký được làm sạch và lót một lớp bông mỏng ở đáy Phương pháp nhồi cột ướt với pha tĩnh là silica gel được sử dụng, và cột được ổn định trong 24 giờ.
Cắn ethyl acetat (15 g) được trộn với silica gel tối thiểu và nạp lên cột Sau đó, mẫu được rửa giải bằng hệ dung môi aceton, cloroform và methanol theo gradient nồng độ từ 3:1:0,1 đến 100% methanol Các dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, từ đó dồn các ống có sự tương đồng cao Cuối cùng, dung môi được cất dưới áp suất giảm, thu được 6 phân đoạn: A (2,2 g), B (1,6 g), C (800 mg).
Phân đoạn A tiếp tục được phân lập trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải CHCl3 : MeOH (20:1, v/v) thu được 3 phân đoạn chính: A1, A2 và A3
Phân đoạn A1 tiếp tục được phân lập trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải CHCl3 : MeOH (15:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ: A1.1, A1.2, A1.3, A1.4 và A1.5
Phân đoạn A1.1 được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH : H2O (3:2, v/v) thu được hợp chất 1 (15 mg)
Phân đoạn A1.2 được phân tách bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 : aceton (2:1, v/v) thu được hợp chất 2 (20 mg)
Phân đoạn A1.3 được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải acetonitril : H2O (90:10, v/v) thu được hợp chất 3 (12 mg)
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat
Kết quả xác định cấu trúc hợp chất
Tính chất: tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 280-283 o C
Phổ IR (KBr) max (cm -1 ): 3332, 1720, 1648, 890
Phổ ESI-MS (m/z) = 469 [M] + tương ứng với công thức C31H50O3
Pha thường aceton : chloroform : methanol
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất so sánh M
Vị trí C δ H (1) ppm δ H (M) ppm δ C (1) ppm δ C (M) ppm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của acid eburicoic
Hợp chất 1 thu được là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 280-283 o C
Hợp chất 1 có phổ khối lượng ESI-MS (m/z) là 469 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C31H50O3 Phổ hồng ngoại của hợp chất này thể hiện các dải hấp thụ đặc trưng, bao gồm nhóm exomethylen (=CH2) tại 890 cm -1, nhóm carbonyl (C=O) tại 1720 cm -1 và nhóm hydroxyl (-OH) ở 3332 cm -1.
Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1 cho thấy tín hiệu của 5 nhóm metyl ở độ dịch chuyển δH 1,06 ppm (H-28), 1,00 ppm (H-29), 1,23 ppm (H-30), 1,60 ppm (H-26), 1,65 ppm (H-27) và hai proton exomethylen tại δH 4,88 ppm và 4,92 ppm (H-31) Ngoài ra, phổ 1 H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của proton tại δH
3,45 ppm (1H, t, H-3) Phổ 13 C-NMR, DEPT của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 31 carbon, bao gồm 5 carbon methin, 10 carbon methylen, 7 carbon methyl,
Hợp chất 1 có cấu trúc bao gồm 4 carbon olefinic, 1 carbonyl và 4 carbon bậc 4 Tín hiệu phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của 5 carbon nhóm methyl tại các vị trí C-18 (δC 16,4 ppm), C-19 (δC 19,4 ppm), C-28 (δC 28,6 ppm), C-29 (δC 16,4 ppm) và C-30 (δC 24,5 ppm) Ngoài ra, các tín hiệu carbon còn lại chỉ ra rằng hợp chất này có một hệ thống bốn vòng với một liên kết đôi tại vị trí C-8 (δC 135,4 ppm) và C-9.
Hợp chất 1 có cấu trúc với các đặc điểm nổi bật như liên kết đôi tại vị trí C-31 (δC 107,0 ppm) và C-24 (δC 155,9 ppm), cùng với một carbonyl tại C-21 (δC 191,3 ppm) Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu tại δC 78,0 ppm, đại diện cho C-3 gắn nhóm hydroxyl Thêm vào đó, phổ HMBC chỉ ra sự tương tác giữa các proton và carbon trong phân tử của hợp chất này.
Hợp chất 1 được xác định là một dẫn xuất của lanosterol thông qua việc kết hợp phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC và HMBC Dựa trên các số liệu phổ và so sánh với hợp chất M, cấu trúc của hợp chất 1 được xác định là acid eburicoic.
Tính chất: Chất bột vô định hình, màu trắng
[α] 25 D = -21,0 (c = 0,1, CHCl3) Công thức phân tử: C28H46O2 Khối lượng phân tử: 414 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất so sánh N
Vị trí C δ H (2) ppm δ H (N) ppm δ C (2) ppm δ C (N) ppm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4,84 (1H, d, J 8,0 Hz) 106,6 106,6 δ H (N), δ C (N) của 24-methylenecholest-4-ene-3,6-diol [18]
Hình 3.4: Cấu trúc hóa học của 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol
Hợp chất 2 được thu nhận dưới dạng bột màu trắng, với phổ 1 H-NMR cho thấy sự hiện diện của 5 nhóm methyl tại các vị trí δH 0,72 (3H, s, H-18), 1,54 (3H, s, H-19), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,88 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26) và 0,89 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27) Ngoài ra, có 1 proton olefin tại δH 5,99 (1H, s, H-4) và 2 proton oxymethin tại δH 4,55 (2H, m) Phổ 13 C-NMR xác nhận sự có mặt của 28 carbon, bao gồm 5 carbon methyl, 10 methylen, 9 methin và 4 carbon bậc 4.
Tương tác HMBC giữa H-26 (δH 0,88) và H-27 (δH 0,89) và C-24 (δC
156,72)/C-25 (δC 34,08) gợi ý sự có mặt của liên kết đôi tại C-24/C-28 và hai nhóm methyl tại C-25 Tương tác HMBC giữa H-19 (δH 1,54) với C-1 (δC
4,55) đến C-4 (δC 129,97)/C-5 (δC 147,15)/C-7 (δC 30,95)/C-10 (δC 37,39) cho phép xác định vị trí của 2 nhóm hydroxyl tại C-3 và C-6
Các phân tích phổ cho thấy sự tương đồng về số liệu phổ NMR ở các vị trí tương ứng giữa hợp chất 2 và hợp chất N Do đó, cấu trúc của hợp chất 2 được xác định là 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tính chất: tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 258-260 o C
Phổ IR (KBr) max (cm -1 ): 3200 (-OH), 1718, 1632
Phổ ESI-MS (m/z) = 455 [M] + tương ứng với công thức phân tử
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 3 và chất so sánh P
Vị trí C δ H (3) ppm δ H (P) ppm δ C (3) ppm δ C (P) ppm
Hợp chất 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic được thu nhận dưới dạng tinh thể màu trắng với điểm nóng chảy từ 258-260°C Phổ ESI-MS cho thấy khối lượng phân tử đạt 454, với giá trị m/z = 455 [M]+.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU xuất hiện của các tín hiệu proton methyl tại 1,06 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-
Phổ 13 C-NMR, DEPT của hợp chất 3 cho thấy tín hiệu của 30 carbon trong đó 4 carbon methin, 10 carbon methylen, 7 carbon methyl, 4 carbon olefinic, 1 carbonyl và 4 carbon bậc 4 Các tín hiệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 3 cũng bao gồm một hệ thống bốn vòng, trong đó có một liên kết đôi tại vị trí C-8 (δ C 135,0 ppm) và C-9 (δ C 134,3 ppm) Hợp chất 3 có sự xuất hiện tín hiệu của 2 carbon olefinic tại C-24 (δ C 124,9 ppm) và C-25 (δ C 134,6 ppm) và một carbonyl tại C-21 (δ C 178,7 ppm) Ngoài ra trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa các proton và carbon trong phân tử 3
Phân tích phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC và HMBC cho thấy hợp chất 3 là một dẫn xuất của lanosterol Dựa trên các dữ liệu phổ và so sánh với hợp chất P, cấu trúc của hợp chất 3 được xác định là acid 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic.
Bàn luận
Đề tài đã sử dụng phương pháp ngâm chiết siêu âm với dung môi MeOH
Phương pháp sắc ký cột phân lập cho phép tiết kiệm thời gian và đạt hiệu suất cao, sử dụng các dung môi n-hexan, dichloromethan và ethyl acetat theo thứ tự tăng dần độ phân cực Nghiên cứu đã chiết xuất ba hợp chất từ phần trên mặt đất của cây Chua me đất hoa vàng tại tỉnh Hà Tĩnh, bao gồm acid eburicoic, 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol và acid 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Các hợp chất này được xác định cấu trúc thông qua đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với dữ liệu công bố trước đó Đây là lần đầu tiên ba hợp chất này được phân lập từ cây Chua me đất hoa vàng, đóng góp mới cho kiến thức về thành phần hóa học của loài Oxalis corniculata L.
Acid eburicoic phân lập từ loài Antrodia camphorata có tác dụng giảm đau và chống viêm hiệu quả trên mô hình gây phù chân chuột bằng λ-carrageenan Sau 4-5 giờ, acid này giảm đáng kể tình trạng phù chân, đồng thời tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa như catalase (CAT), superoxid dismutase (SOD) và peroxidase glutathion (GPx) Ngoài ra, acid eburicoic cũng làm giảm nồng độ malondialdehyd (MDA), oxit nitric (NO), TNF-α và interleukin-1β (IL-1β), ức chế iNOS và cyclooxygenase-2 (COX-2), cũng như giảm sự xâm nhập của bạch cầu trung tính Cơ chế chống viêm của acid eburicoic có thể do khả năng giảm cytokin và tăng cường hoạt động của enzym chống oxy hóa.
The protective effects of eburicoic acid, isolated from Antrodia camphorata, demonstrate its ability to combat liver damage induced by carbon tetrachloride This compound notably reduces the levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and lipid peroxidation while enhancing the activity of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase (GPx) Additionally, eburicoic acid decreases nitric oxide (NO) and TNF-α levels while inhibiting iNOS and COX-2 Its liver-protective effects are attributed to its antioxidant and anti-inflammatory mechanisms.
Nghiên cứu cho thấy 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol, một polyhydroxysterol được chiết xuất từ san hô Alcyonium patagonicum, có khả năng gây độc tế bào ung thư bạch cầu ở chuột với giá trị IC50 là 1 mg/ml.
Nghiên cứu chỉ ra rằng, 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic phân lập từ dịch chiết dichloromethan của loài nấm Fomitopsis pinicola (Swartz ex Fr.)
Karst là một steroid có tác dụng kháng khuẩn chống lại chủng vi sinh vật
Bacillus subtilis trong thí nghiệm sinh học TLC [8]
Các hợp chất được phân lập từ cây Chua me đất hoa vàng đã mở ra hướng nghiên cứu mới về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài cây này.