Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu hái tại Thanh Hóa

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm chiết xuất cao Lan kim tuyến. Định tính một số hợp chất trong mẫu. Xác định được hàm lượng của một số hợp chất trong mẫu cao bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

TỔNG QUAN

Vài nét về chi Anoectochilus

Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) là một chi thực vật có hoa thuộc họ Lan

Họ Lan (Orchidaceae) và phân họ Orchidoideae nổi bật với tên gọi "Lan kim tuyến" hay "Lan kim hoàn", được đặt theo những đường gân đẹp mắt trên phiến lá của các loài lan này.

Các loài thực vật này chủ yếu có kích thước nhỏ, sinh sống trên nền đất, nhưng một số loài lại phát triển trên các bờ đá Chúng có bộ lá màu xanh lục hoặc các màu sắc khác, với bề mặt mịn màng và mạng lưới gân lá phức tạp Cụm hoa nằm ở ngọn trung tâm, với một số hoa chúc xuống đất, được bao phủ bởi lông và có cánh môi lớn nổi bật Tràng hoa và đài hoa ở mặt lưng tạo thành cấu trúc giống như chiếc mũ trùm đầu, mỗi hoa có hai nhụy và hai nhị.

Chi Anoectochilus (Orchidaceae), bao gồm hơn 40 loài, phổ biến khắp các vùng nhiệt đới, từ Ấn Độ, Himalayas, Đông Nam Á đến Hawaii

Trong số các loài thực vật này, A formosanus và A koshunensis chỉ phân bố ở Đài Loan (Trung Quốc) và Okinawa (Nhật Bản)

Anoectochilus roxburghii, phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri

Lanka, Ấn Độ và Nepal [17]

1.3 Công dụng và tác dụng

Một số loài thuộc chi này được sử dụng trong các loại thuốc dân gian Trung Quốc, chẳng hạn như A formosanus Hayata, A koshunensis Hayata, và A roxburghii

Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata, dưới dạng tươi hoặc khô, được sử dụng để nấu nước uống giúp điều trị nhiều bệnh như đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực Người Trung Quốc tin rằng trà từ A formosanus Hayata có tác dụng chữa trị các bệnh về gan và phổi Đại học Công nghệ Y dược và Cao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã nghiên cứu và áp dụng A formosanus Hayata như một loại thuốc kháng viêm, hạ sốt và giảm suy nhược cơ.

Nghiên cứu cho thấy A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid có liên quan đến chức năng tim mạch Dịch chiết từ A formosanus Hayata không chỉ có khả năng kháng virus mà còn chống viêm và bảo vệ gan hiệu quả.

The dried extract of A formosanus contains 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy, and butanoid glucosides acid Recently, a compound known as kinsenoside, which is a 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide, has been extracted from A formosanus and A koshunensis and has shown effective antihypertensive properties.

Anoectochilus roxburghii, hay còn gọi là "Vua thảo dược", được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị nhiều bệnh lý như sốt, bệnh phổi, viêm màng phổi, bệnh gan, tăng huyết áp, và hỗ trợ trẻ em suy dinh dưỡng (Viện Y học cổ truyền Trung Quốc Phúc Kiến 1982).

Mặc dù cây lan thảo dược A roxburghii được biết đến, nhưng thông tin khoa học về hoạt tính sinh học, chức năng sinh lý và hiệu quả lâm sàng của nó vẫn còn hạn chế Hiện tại, chưa có báo cáo nghiên cứu cụ thể nào về các thành phần hóa học của cây này, và số lượng hồ sơ dược lý cũng rất ít (Li et al.).

1995) bởi vì các nguồn tự nhiên của A roxburghii phần lớn đã cạn kiệt.

Tổng quan về cây Lan kim tuyến

 Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume

 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall ex Lindl 1840

 Tên gọi khác: kim cương, kim tuyến, kim tuyến tơ, lan gấm, mộc sơn, thạch tùng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Lan kim tuyến là một loại cây thảo có thân rễ dài, thân mọng nước và nhiều lông mềm, với 2 - 4 lá mọc sát đất Lá cây có hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn, kích thước khoảng 3 - 4 x 2 - 3 cm, có màu sắc đa dạng với mạng gân thường nhạt hơn Cuống lá dài từ 2 - 3 cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, chứa từ 4 - 10 hoa mọc thưa, với lá bắc hình trứng, chóp nhọn, dài 8 - 10 mm, có màu hồng.

Hoa có màu trắng, kích thước dài từ 2,5 đến 3 cm Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm, với môi dài đến 1,5 cm, mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp Chóp phiến hoa rộng và chẻ sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, có màu lục và nhiều lông mềm.

Hình 1.1 Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) [19]

2.3 Sinh học và sinh thái

Cây thường nở hoa từ tháng 2 đến tháng 4, với quá trình tái sinh chủ yếu diễn ra qua chồi từ thân rễ và hạt, tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của chúng rất chậm Chúng thường phát triển dưới tán rừng nguyên sinh, nơi có môi trường nguyên thủy và rậm rạp.

Chúng sinh sống trên các sườn núi đá granit, riôlit và phiến sét, tại độ cao từ 500 đến 1600 m, thường tập trung thành từng nhóm với vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng.

2.4 Phân bố và tình trạng

 Thế giới: Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, ampuchia, Malaixia, Inđônêxia

 Lào Cai: núi Phan Xi Păng, xã Liêm Phú

 Kon Tum: núi Ngọc Linh, Vườn Quốc gia hư Mom Ray

 Đắk Lắk: Vườn Quốc gia hư Yang Sin

 Lâm Đồng: Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà

 Phú Thọ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn

 Sơn La: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Tà Sùa

 Hà Nội: Vườn Quốc gia Ba Vì

 Thanh Hóa: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Liên, Pù Luông

Lan kim tuyến có khu phân bố rộng nhưng số lượng cá thể đang giảm sút rõ rệt do tái sinh chậm và yêu cầu điều kiện sống khắt khe ngày càng hiếm Loài này đã bị khai thác liên tục trong nhiều năm, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng Vì lý do này, lan kim tuyến được xếp vào nhóm IA theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP, cấm khai thác vì mục đích thương mại, và thuộc nhóm thực vật nguy cấp EN A1a,c,d trong Sách đỏ Việt Nam năm 2007.

Từ dịch chiết ethanol của cây Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl thuộc họ Orchidaceae, các phân đoạn ethyl acetate và n-butanol đã được sử dụng để phân lập nhiều hợp chất Qua phương pháp quang phổ, cấu trúc của các hợp chất được xác định bao gồm cirsilineol (1), quercetin (2) và quercetin 7-O-β-D-glucopyranoside.

(3), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (4), isorhamnetin (5), isorhamnetin-7-O-β-D- glucopyranoside (6), isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside (7), kaempferol-3-O-β–

D-glucopyranoside (8), kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside (9), isorhamnetin-3-O- β-D-rutinoside (10) [10,12,16,17]

Ferulic acid (11) [16], p-coumaric acid (12) [10], sorghumol (13), friedelin (14)

[18], sitosterol (15), stigmasterol (16), campesterol (17), daucosterol (18), succinic acid

Năm 2008, He và cộng sự đã phân lập thành công hai loại sorghumol acyl este mới là Sorghumol 3-O-Z-p-coumarate và Sorghumol 3-O-E-p-coumarate, cùng với một alkaloid mới có tên là anoectochine (20) và một chất đã được biết đến từ trước là sorghumol Các hoạt chất này đã được xác định với công thức cấu tạo hóa học rõ ràng.

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Lan kim tuyến

Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lan kim tuyến có khả năng điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm lao phổi, ho do viêm phế quản, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, viêm gan mãn tính, và suy nhược thần kinh Ngoài ra, loài cây này còn giúp tăng cường sức khỏe, cải thiện lưu thông khí huyết, có tính kháng khuẩn, và hỗ trợ điều trị các triệu chứng như đau bụng, đau ngực, tiểu đường, viêm thận, sốt cao, liệt dương và rối loạn gan.

Người dân tộc miền núi thường sử dụng Lan kim tuyến sắc uống để chữa trị các vấn đề như đau bụng, đau ruột và sốt cao Ngoài ra, loài cây này còn được dùng để đắp lên vết thương do rắn cắn và các vùng sưng tấy.

Lan kim tuyến là một loại dược liệu quý trong y học dân gian, có tác dụng tăng cường sức khỏe, bổ máu và giải nhiệt Cây thuốc này được sử dụng để điều trị các bệnh như bệnh phổi, di tinh, yếu gan, yếu tỳ và xuất tinh sớm.

Cây Lan kim tuyến có thể sử dụng cả tươi và khô để sắc uống, với liều dùng hàng ngày khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô Ngoài ra, có thể dùng cây tươi giã nát để đắp lên các vết thương sưng đau.

2.7 Tác dụng sinh học của một số hợp chất trong cây Lan kim tuyến

Modern medicine has analyzed and identified that Anoectochilus contains highly significant bioactive components, including flavonoids such as quercetin and isorhamnetin, steroids like isopropenyl cholesterol, sterol, ergosterol, stigmasterol, campesterol, and β-sitosterol, as well as triterpenoids including friedelin and various acids (succinic, coumaric, ferulic, palmitic, oleanolic, and bearberry) Additionally, it comprises carbohydrates (13.32% polysaccharides, 11.24% oligosaccharides, and 9.73% simple sugars), alkaloids, cardiac glycosides, esters, taurine, amino acids, trace elements, and other minerals.

Quercetin là một flavonoid giúp tăng cường sức khỏe tim mạch, làm giảm cholesterol xấu và tăng cholesterol tốt, đồng thời giảm mảng bám trong động mạch Nhờ đó, Quercetin có khả năng ngăn ngừa đột quỵ và đau tim.

Quercetin là một hợp chất có lợi cho bệnh nhân tiểu đường và cao huyết áp, nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Không có flavonoid nào vượt trội hơn quercetin trong việc hỗ trợ sức khỏe tim mạch và kiểm soát đường huyết.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU viêm và chống oxy hóa, chống lão hóa, làm bền thành mạch tránh tai biến mạch máu [8,13]

Quercetin có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư nhờ vào việc loại bỏ các gốc tự do trong cơ thể, giúp trung hòa chúng và giảm nguy cơ mắc bệnh Do đó, việc xác định (định tính và định lượng) Quercetin trong cao Lan kim tuyến là rất quan trọng, vì điều này khẳng định vai trò chữa bệnh của cao Lan kim tuyến.

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Quercetin, C 15 H 10 O 7

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất

Cây Lan kim tuyến được thu hái từ vùng núi huyện Nông Cống, tỉnh Thanh Hóa Sau khi thu hoạch, mẫu được bảo quản trong túi chứa hạt hút ẩm silicagel và được lưu giữ ở nhiệt độ -20 độ C trong phòng thí nghiệm trước khi tiến hành tách chiết.

Dược liệu được phơi, sấy khô, cắt và tán nhỏ tới độ mịn khoảng 3-4 mm để tăng khả năng khuếch tán của dung môi

Nấm men là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae

Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae: (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2 2H 2 O, NaCl, cao nấm men, glucoza, nước, đệm PBS

Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, ACN.

Phương tiện nghiên cứu

Thiết bị, máy móc, dụng cụ : que cấy, đèn cồn, đĩa petri, màng lọc, giấy lọc, giấy bao gói, bông không thấm nước, bông y tế

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: bình tam giác, ống đong, ống nghiệm, pipet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh các kích thước

Thiết bị đo phổ hấp thụ NanoDrop-1000 (USA)

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu

Phương pháp nghiên cứu

Công nghệ lên men là một phương pháp hiện đại được áp dụng trong nghiên cứu này nhằm thu nhận các hoạt chất quý có khả năng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến Đề tài nghiên cứu sẽ sử dụng chủng nấm trong quá trình lên men để tối ưu hóa việc chiết xuất các thành phần giá trị từ cây này.

Saccharomyces cerevisiae để thu nhận cao thay cho công nghệ tách chiết truyền thống

Việc sử dụng nước hoặc cồn trong quá trình chiết xuất giúp nâng cao hiệu quả tách chiết và tăng cường sự đa dạng của các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất.

Nấm men là các loài nấm đơn bào có kích thước rất nhỏ, khoảng 1/100 mm, và phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt ở vùng trồng nho và hoa quả Chúng có khả năng lên men rượu bia và đã được sử dụng trong sản xuất rượu từ lâu Nấm men sinh sôi nhanh, chứa nhiều vitamin và acid amin không thay thế, với hàm lượng protein lên tới 50% trọng lượng khô của tế bào, do đó còn được dùng để sản xuất protein Ngoài ra, nấm men cũng đóng vai trò quan trọng trong công nghệ sản xuất bánh mì Tuy nhiên, cần lưu ý rằng một số loại nấm men có thể gây hại cho sức khỏe con người và làm hư hại lương thực, thực phẩm.

Nấm men Saccharomyces là chủng vi sinh vật chính được sử dụng trong sản xuất bia, có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng như đường hòa tan, hợp chất nitơ (acid amin, peptit), vitamin và nguyên tố vi lượng từ môi trường nước mạch nha qua màng tế bào.

Nấm men Saccharomyces cerevisiae, một chủng lên men nổi, phát triển tốt ở nhiệt độ cao và thường lơ lửng trên bề mặt Nhiệt độ lý tưởng cho quá trình lên men của nó dao động từ 10 đến 25 độ C.

Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae

Môi trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cụ thể như sau:

 Nước: 1000 g Sau thời gian nuôi cấy ở 25-30 o C trong ba tuần thì ly tâm 300 vòng/ph t để thu sinh khối tế bào

Sinh khối tế bào thu được rửa 2 lần với đệm PBS, pH=7,5 trước khi sử dụng

Quy trình chiết xuất cao

Chiết với methanol, định tính và định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV và phân tích HPLC

Ly tâm 10 000 vòng/phút, thời gian 10 phút

Loại bỏ cặn ly tâm Thu dịch ly tâm và cô thành cao

Lọc lấy dịch lên men và đun đến lên 70 o C Đậy kín nắp bình lên men, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5-7 ngày

Thỉnh thoảng lắc nhẹ và xả bớt khí

Bổ sung nấm men, đường vào hỗn hợp

Nguyên liệu Lan kim tuyến tươi

Cắt, nghiền nhỏ nguyên liệu

Bổ sung nước cất vào nguyên liệu theo tỉ lệ: 5 phần nước: 1 phần nguyên liệu

Sử dụng thiết bị đo phổ hấp thụ NanoDrop-1000 (USA) để định tính các hoạt chất Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin trong mẫu cao Lan kim tuyến.

Quercetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 268 nm và 412 nm

Isorhamnetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 265 nm và 375 nm

Acid erulic có đỉnh hấp thụ cực đại ở 320 nm

Kết quả định tính các hợp chất trong Lan kim tuyến theo phương pháp phổ hấp thụ UV đã được công bố được trình bày tại các hình sau: [7,11,21,26,27]

Quercetin (Hình 2.1), Isorhamnetin (hình 2.2) và Acid ferulic (hình 2.3)

Hình 2.1 Phổ hấp thụ của Quercetin

Hình 2.2 Phổ hấp thụ của Isorhamnetin

Hình 2.3 Phổ hấp thụ của Acid Ferulic

2.3.3 Phương pháp định lượng Định lượng các hợp chất Quercetin, Isorhamnetin và Axit ferulic trong cao Lan kim tuyến bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với thiết bị HPLC Shimadzu ác pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol) Một số kỹ thuật HPLC sử dụng dung môi không nước Thành phần nước trong pha động có thể có axit (axit formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các thành phần mẫu Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho píc trên sắc ký đồ Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biệt của chất đem phân tích Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử

Phương pháp này ngày càng trở nên phổ biến do độ nhạy cao và khả năng định lượng tốt, đặc biệt thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

KẾT QUẢ

Kết quả định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic

Phổ hấp thụ UV của mẫu cao Lan kim tuyến mà đề tài đã thực hiện được trình bày tại hình 3.1

Trong đó: Trục tung: absorbance: độ hấp thụ

Trục hoành: wavelength: bước sóng

Kết quả trên hình 3.1, cho thấy trong cao lên men Lan kim tuyến có các đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho Quercetin, Isorhamnetin và Axit Ferulic

Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-Vis của mẫu cao lên men Lan kim tuyến

Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic

 Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5àm Seri cột: H16-248657

 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm

 Tốc độ dòng: 1,5mL/phút

 Pha động: ACN : 0.5% phosphoric acid = 72:28 (%)

3.2.1.2 Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Quercetin 6 àg/mL + Isorhamnetin 1 àg/mL theo điều kiện trờn

Kết quả được trình bày trong bảng 3.1:

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký dung dịch chuẩn

Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin

TB 989937 156299 10.409 20.124 0.711 0.697 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu < 1 Độ lệch chuẩn tương đối của đáp ứng < 2

=> chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao

Cách pha đường chuẩn Quercetin:

Pha dóy dung dịch chuẩn Quercetin cú nồng độ 1,5 – 15 àg/mL

Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ

Dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Hòa tan 25 mg chất chuẩn Quercetin vào bình định mức 50mL, sau đó thêm MeOH vừa đủ để đạt nồng độ Quercetin khoảng 500 àg/mL, thu được dung dịch (1).

Hỳt 1,2mL dd (1) hũa tan trong 20 mL MeOH (~ 30 àg/mL)(WS Quercetin)

Cách pha đường chuẩn Isorhamnetin:

Pha dóy dung dịch chuẩn Isorhamnetin cú nồng độ 0,2 – 2 àg/mL

Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ

Dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Hòa tan chính xác 5 mg chất chuẩn Isorhamnetin vào bình định mức 10 mL, sau đó thêm MeOH đến đủ thể tích để tạo ra dung dịch có nồng độ Isorhamnetin khoảng 1000 µg/mL, thu được dung dịch (2).

Hỳt 1mL dd (2) hũa tan trong bỡnh 25mL MeOH (40 àg/mL) => thu được dd (3) Hỳt 1mL dd (3) hũa tan trong bỡnh 10mL MeOH (4 àg/mL) (WS Isorhamnetin)

Bảng 3.2 Số liệu pha đường chuẩn

Nồng độ Quercetin (àg/mL) 1.5 3 6 12 15

Thể tớch WS Quercetin (àL) 50 100 200 400 500

Nồng độ Isorhamnetin (àg/mL) 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 Thể tớch WS Isorhamnetin (àL) 50 125 250 375 500

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của

Hình 3.2 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của

3.2.1.4 Kết quả định lượng Quercetin, Isorhamnetin

Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 àm, tiờm sắc ký

Tiến hành trên 3 mẫu độc lập

Công thức tính kết quả

Nồng độ Quercetin trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu)

St: Diện tích píc của Quercetin của dung dịch tiêm sắc ký

% Quercetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Quercetin (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử

Bảng 3.5 Kết quả định lượng Quercetin

Area Nồng độ mẫu tiêm SK

Nồng độ ban đầu (g/mL) % Quercetin

Nồng độ Isorhamnetin trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu)

St: Diện tích píc của Isorhamnetin của dung dịch tiêm sắc ký

% Isorhamnetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Isorhamnetin (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử % Isorhamnetin = C x 100

Bảng 3.6 Kết quả định lượng Isorhamnetin

Area Nồng độ mẫu tiêm

Nồng độ ban đầu (g/mL) % Isorhamnetin

3.2.2 Định lượng Acid ferulic trong dịch chiết bằng HPLC 3.2.2.1 Điều kiện sắc ký

 Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5àm Seri cột: H16-248657

 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm

 Tốc độ dòng: 1,5mL/phút

 Pha động: A N : Đệm CH 3 COONa 0,05M pH 4,0 = 12:88 (%)

3.2.2.2 Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Acid ferulic 3 àg/mL theo điều kiện trờn

Kết quả được trình bày trong bảng 4.7

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

STT RT Area Tailing factor

CV% 1.0 1.0 3.3 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu < 1 Độ lệch chuẩn tương đối của đáp ứng < 2

=> chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao

Pha dung dịch chuẩn Acid ferulic với nồng độ từ 1,0 đến 5,0 àg/mL Thực hiện sắc ký để thu thập đáp ứng píc tại từng nồng độ Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính dựa trên dữ liệu thu được.

Cách pha đường chuẩn Acid ferulic

Hòa tan 20 mg chất chuẩn Acid ferulic vào bình định mức 20 mL, sau đó thêm MeOH vừa đủ để đạt nồng độ khoảng 1000 µg/mL, thu được dung dịch (1).

Hỳt 1,0mL dd (1)/ hũa tan trong 10mL MeOH (~ 100 àg/mL) (WS1)

Hỳt 1,0mL dd (WS1) vào bỡnh 10mL, bổ sung MeOH vừa đủ (~ 10 àg/mL) (WS2)

Pha dung dịch chuẩn Acid ferulic với nồng độ từ 1,0 đến 5,0 àg/mL và thực hiện sắc ký để thu thập đáp ứng píc tại từng nồng độ Sau đó, tiến hành dựng phương trình hồi quy tuyến tính để phân tích kết quả.

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ các dung dịch

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của

3.2.2.4 Kết quả định lượng Acid ferulic

Lọc mẫu thử qua màng lọc 0.45 àm, tiờm sắc ký

Tiến hành trên 3 mẫu độc lập

Công thức tính kết quả Nồng độ Acid ferulic trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu)

St: Diện tích píc của Acid ferulic của dung dịch tiêm sắc ký

% Quercetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Acid ferulic (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử

Bảng 3.10: Kết quả xác định nồng độ Acid ferulic trong mẫu thử

Area Nồng độ mẫu tiêm

Nồng độ ban đầu (g/mL) % Acid ferulic

BÀN LUẬN Chiết xuất cao Lan kim tuyến

Công nghệ lên men được áp dụng trong nghiên cứu này nhằm thu nhận cao từ cây Lan kim tuyến, chứa các hoạt chất quý có tác dụng chữa bệnh.

Trong nghiên cứu này, công nghệ lên men được áp dụng với các chủng nấm để thu nhận các chất, thay thế cho phương pháp tách chiết truyền thống bằng nước hoặc cồn Phương pháp này không chỉ nâng cao hiệu quả tách chiết mà còn tăng cường sự đa dạng của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất.

Theo công nghệ truyền thống, việc chiết xuất hoạt chất từ thảo dược thường sử dụng nước hoặc cồn Khi chiết xuất bằng nước, dịch chiết thu được chủ yếu chứa các chất ưa nước, trong khi chiết xuất bằng cồn lại chủ yếu thu được các chất ít hoặc không hòa tan trong nước.

Vì vậy, việc sử dụng công nghệ lên men được xem là công nghệ có thể khắc phục được những hạn chế nêu trên

Công nghệ lên men đang được ứng dụng rộng rãi bởi các nhà khoa học để tạo ra sản phẩm có giá trị kinh tế và chữa bệnh, đồng thời tiết kiệm nguồn nguyên liệu nhờ khả năng chiết xuất tối đa các hợp chất quý Để tối ưu hóa quá trình tách chiết và sản xuất cao từ cây Lan kim tuyến, cần khảo sát và lựa chọn các điều kiện lên men như nhiệt độ, nồng độ giống, xử lý nguyên liệu trước lên men, thời gian lên men và thu nhận sản phẩm, nhằm đảm bảo chất lượng cao đạt yêu cầu.

Quy trình thu nhận cao ổn định có thể áp dụng vào sản xuất

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Định tính và định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học trong dịch lên men cây Lan kim tuyến

 Có thể sử dụng phổ hấp thụ UV-Vis để sơ bộ xác định các hợp chất quan trọng trong mẫu cao Lan kim tuyến

Mẫu cao Lan kim tuyến cho thấy các đỉnh hấp thụ rõ ràng, chủ yếu tập trung ở bước sóng dưới 500 nm, cho thấy sản phẩm này khá sạch và ít tạp chất.

 Có thể định lượng các hoạt chất Quercetin, Isorhamnetin và Acid ferulic trong cao Lan kim tuyến bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPL )

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,89 MB