HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN TRỌNG THƯỞNG KHẢO SÁT THỰC TRẠNG HOẠT ĐỘNG GIẾT MỔ VÀ Ô NHIỄM VSV TRONG THỊT LỢN TẠI MỘT SỐ ĐIỂM GIẾT MỔ TRÊN ĐỊA BÀN QUẬN KIẾN AN, THÀNH PHỐ HẢI PHÒNG Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Ngọc Thạch NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Trọng Thưởng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Phạm Ngọc Thạch tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Nội – Chẩn - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Chi cục Thú y Hải Phòng, quan Thú y vùng II giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Trọng Thưởng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình hoạt động giết mổ nước 2.1.1 Tình hình giết mổ động vật Thành phố Hồ Chí Minh 2.1.2 Tình hình giết mổ động vật Hà Nội .5 2.2 Nguyên nhân gây hư hỏng thịt 2.3 Đường xâm nhập vi khuẩn vào thịt 2.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Việt Nam 2.4.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm bệnh truyền qua thực phẩm 2.4.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 2.4.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn 12 2.5 Các nguồn ô nhiễm vi khuẩn vào thịt .14 2.5.1 Lây nhiễm từ khơng khí 14 2.5.2 Lây nhiễm từ nước 14 2.5.3 Lây nhiễm từ đất 15 2.5.4 Lây nhiễm trình giết mổ 15 2.5.5 Lây nhiễm trình phân phối thực phẩm 16 2.6 Những nghiên cứu ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm 17 2.7 Các tổ chức hoạt động ATTP 18 iii 2.8 Một số vi khuẩn thường gặp ô nhiễm thịt động vật 20 2.8.1 Tập đoàn vi khuẩn hiếu khí 20 2.8.2 Coliform 21 2.8.3 Escherichia coli .21 2.8.4 Vi khuẩn Salmonella 23 2.8.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 24 2.8.6 Vi khuẩn Clostridium perfringens 25 2.9 Vệ sinh an toàn thực phẩm sở giết mổ chế biến thực phẩm 25 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 28 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 28 3.2 Nội dung nghiên cứu 28 3.2.1 Điều tra tình hình giết mổ lợn phường địa bàn quận Kiến An, thành phố Hải Phòng 28 3.2.2 Đánh giá thực trạng điều kiện trang thiết bị, công nghệ, vệ sinh thú y ý thức người tham gia hoạt động giết mổ lợn số sở giết mổ quận Kiến An, thành phố Hải Phòng 28 3.2.3 Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn khơng khí nguồn nước sử dụng giết mổ 28 3.2.4 Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn thịt lợn số sở giết mổ bao gồm tiêu: tổng số vi khuẩn hiếu khí, E.Coli, Coliform, Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens 28 3.2.5 Đề xuất giải pháp quy hoạch, quản lý, công nghệ sở theo hướng giết mổ tập trung 28 3.3 Nguyên liệu nghiên cứu 28 3.3.1 Mẫu xét nghiệm .28 3.3.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 28 3.3.3 Thiết bị mày móc, dụng cụ hố chất dùng thí nghiệm .28 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Phương pháp điều tra .29 3.4.2 Phương pháp lấy mẫu kiểm tra đánh giá ô nhiễm vi khuẩn: 29 3.4.3 Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn 29 3.5 Phương pháp đánh giá xử lý số liệu 31 iv Phần Kết thảo luận 32 4.1 Điều tra tình hình giết mổ lợn địa bàn Kiến An 32 4.1.1 Địa điểm, số lượng quy mô 32 4.1.2 Loại hình sở giết mổ 33 4.2 Đánh giá điều kiện vệ sinh thú y ý thức người tham gia hoạt động giết mổ sở giết mổ lợn quận Kiến An 33 4.2.1 Về sở hạ tầng, trang thiết bị .33 4.2.2 Đánh giá điều kiện trang thiêt bị 34 4.2.3 Đánh giá vệ sinh nhà xưởng 37 4.2.4 Đánh giá tiêu chí quy định công nhân tham gia giết mổ .37 4.2.5 Kiểm tra mức độ nhiễm khơng khí nước sử dụng sở giết mổ lợn 38 4.3 Kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn số sở giết mổ 41 4.3.1 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn số sở giết mổ 41 4.3.2 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi khuẩn E.coli thịt lợn 43 4.3.3 Kết kiểm tra tiêu tổng số Coliform .45 4.3.4 Kết kiểm tra tiêu vi khuẩn Salmonella 48 4.3.5 Kết kiểm tra tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus 50 4.3.6 Kết kiểm tra tiêu vi khuẩn Clostridium perfringens 52 4.3.7 Tổng hợp kết kiểm tra vi khuẩn ô nhiễm thịt lợn số sở giết mổ 53 Phần Kết luận kiến nghị 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị .56 5.3 Đề xuất giải pháp 56 Tài liệu tham khảo 57 Phụ lục 62 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng việt CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) COD Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hóa học) CSGM Cơ sở giết mổ FAO The Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lương) GMP Good Manufacturing Practice (Thực hành sản xuất tốt) GMTT Giết mổ tập trung HACCP Hazard Analysis Critical Control Point (Phân tích mối nguy kiểm soát điểm tới hạn) ISO International Organization for Standardization (Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế) LT Heat Labile Toxin (Độc tố không chịu nhiệt) MPN Most Probable Number ST Heat Stable Toxin (Độc tố chịu nhiệt) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TSS Total Suspended Solids (Tổng chất rắn lơ lửng) TSVKHK Tổng số vi khuẩn hiếu khí VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VSTY Vệ sinh thú y VKHK Vi khuẩn hiếu khí WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) WTO World Trade Organisation (Tổ chức thương mại giới) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm nước ta từ 2011 đến 2016 13 Bảng 2.2 Quy định tạm thời vệ sinh thú y sở giết mổ động vật 26 Bảng 4.1 Địa điểm, quy mô giết mổ lợn quận Kiến An- Hải Phòng 32 Bảng 4.2 Kết kiểm tra, đánh giá tiêu sở giết mổ lợn quy định Thông tư 09/2016/TT-BNNPTNT 35 Bảng 4.3 Kết kiểm tra mức độ ô nhiễm khơng khí sở giết mổ lợn 39 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tiêu Coliform nước sử dụng cho hoạt động giết mổ CSGM địa bàn quận Kiến An 39 Bảng 4.5 Kết kiểm tra tiêu E.coli nước sử dụng cho hoạt động giết mổ CSGM địa bàn quận Kiến An 40 Bảng 4.6 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn 42 Bảng 4.7 Kết kiểm tra tiêu E coli thịt lợn 44 Bảng 4.8 Kết kiểm tra tổng số Coliform thịt lợn sở giết mổ 46 Bảng 4.9 Kết kiểm tra Salmonella thịt sở giết mổ 50 Bảng 4.10 Kết kiểm tra Staphylococcus aureus thịt sở giết mổ 51 Bảng 4.11 Kết kiểm tra Clostridium perfringens thịt sở giết mổ 52 Bảng 4.12 Tổng hợp kết kiểm tra vi khuẩn ô nhiễm thịt lợn số sở giết mổ quận Kiến An, Hải Phòng 53 vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Tháo tiết cạo lơng mổ lợn nền, sàn 35 Hình 4.2 Phạm Văn Tuấn .35 Hình 4.3 Thịt pha lọc sàn 35 Hình 4.4 Khu giết mổ tập trung giết mổ sàn .35 Hình 4.5 Trang thiết bị chưa đảm bảo theo quy định 37 Hình 4.6 Cơng nhân giết mổ khơng có bảo hộ lao động 38 Hình 4.7 Khu giết mổ hẹp 43 Hình 4.8 Khu vực giết mổ vệ sinh 43 Hình 4.9 Tỷ lệ mẫu thịt lợn không đạt tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 45 Hình 4.10 Cơ sở giết mổ Phạm Thị Bốn 47 Hình 4.11 Cơ sở giết mổ Phạm Khắc Nghiệp 48 Hình 4.12 Cơ sở giết mổ Trần Qốc Cường 51 Hình 4.13 Cơ sở giết mổ Phạm Thị Hậu 53 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Trọng Thưởng Tên luận văn: “Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn số điểm giết mổ địa bàn quận Kiến An thành phố Hải Phòng” Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định rõ thực trạng hoạt động giết mổ địa bàn quân Kiến An Xác định số lượng, loại hình, phân bố quy mô điểm giết mổ, điều kiện giết mổ ảnh hưởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm Xác định cụ thể mức độ ô nhiễm vi sinh vật thịt điểm giết mổ lợn tổng số vi khuẩn hiếu khí, Escherichia coli, Sallmonella, Staphylococcus, Clostridium perfrigen gam thịt Từ đó, đánh giá ảnh hưởng hoạt động giết mổ đến chất lượng thịt, dịch bệnh gia súc, gia cầm, vệ sinh môi trường Phương pháp nghiên cứu Để thực đề tài, sử dụng số phương pháp nghiên cứu sau: Phương pháp điều tra Phương pháp lấy mẫu kiểm tra đánh giá ô nhiễm vi khuẩn Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn Phương pháp đánh giá xử lý số liệu Kết kết luận Quận Kiến An có sở giết mổ với quy mô nhỏ vừa Hầu hết sở giết mổ lợn địa bàn có điều kiện sở hạ tầng chưa đảm bảo vệ sinh thú y, hệ thống nước thải không xử lý, nước thải đổ thẳng môi trường gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Cơ sở không nằm quy hoạch quyền địa phương Cơng tác VSTY, tình hình quản lý sở giết mổ lợn yếu kém, chưa đáp ứng yêu cầu theo quy định Nông Nghiệp Phát triển nông thôn Công nhân tham gia giết mổ chưa có kiến thức an tồn thực phẩm giết mổ, sơ chế, kinh doanh động vật, sản phẩm động vật Mức độ ô nhiễm vi khuẩn khơng khí sở đáng báo động, 30 mẫu khơng khí kiểm tra có 14/30 mẫu đạt yêu cầu theo quy định (chiếm tỷ lệ 46,67%) ix TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đặng Thị Hạnh, Trần Thị Tố Nga Trần Thị Thu Hằng (1998) Nghiên cứu tình hình nhiễm khuẩn thịt heo số chợ Tp Hồ Chí Minh Báo cáo khoa học chăn nuôi thú y (1998-1999) Hà Nội Đinh Quốc Sự (2005) Thực trạng hoạt động giết mổ gia súc tỉnh, số tiêu vệ sinh thú y sở giết mổ địa bàn thị phường Ninh Bình - Tỉnh Ninh Bình Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội – 2005 Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Văn Thị Hường, Đào Thị Hảo, Nguyễn Xuân Huyên Nguyễn Bạch Huệ (2006) Đánh giá tình hình nhiễm số loại vi khuẩn gây bệnh thịt tươi địa bàn Hà Nội Khoa học kỹ thuật thú y, tập XIII, số Hồ Văn Nam cộng (1996) Bệnh viêm ruột ỉa chảy lợn”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tr.15 - 22 Lã Văn Kính (2007) Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu sản xuất thịt lợn an toàn chất lượng cao Hồ Chí Minh tháng 3/2007 Lê Minh Sơn (2002) Kết phân lập, xác định số độc tố độc lực vi khuẩn Staphylococcus aureus thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng Khoa học kỹ thuật thú y tập IX số – 2002 Lê Văn Tạo (2006) Bệnh vi khuẩn Escherichia coli gây lợn Khoa học kỹ thuật thú y, tập XIII-số 3, 2006 Lưu Quỳnh Hương Trần Thị Hạnh (2005) Tỷ lệ lưu hành Salmonella thịt gà thu thập từ chợ bán lẻ địa bàn Hà Nội Khoa học kỹ thuật thú y, tập XII, số Ngô Văn Bắc (2007) Đánh giá ô nhiễm vi khuẩn thịt lợn sữa, lợn choai xuất khẩu, thịt gia súc tiêu thụ nội địa số sở giết mổ Hải Phòng – Giải pháp khắc phục Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Đại học nông nghiệp Hà Nội, 2007 10 Nguyễn Ngọc Tuân (2002) Vệ sinh thịt NXB nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, 2002 11 Nguyễn Thị Hoa Lý (2005) Một số vấn đề liên quan đến việc xử lý chất thải chăn ni, lị mổ Khoa học kỹ thuật thú y, tập XII, số - 2005 57 12 Nguyễn Văn Quang, Nguyễn Ngã, Trương Quang, Nguyễn Thiên Thu Lê Lập (2000) Vai trò vi khuẩn Escherichia coli hội chứng tiêu chảy bò, bê số tỉnh nam trung Khoa học kỹ thuật thú y, tập VII-số 4, 2000 13 Nguyễn Vĩnh Phước (1976) Các phương pháp bảo quản thú sản thực phẩm Vi sinh vật Thú y, tập III, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội 1976 14 Nguyễn Ý Đức (2008) Ngộ độc thực phẩm http://www.yduocngaynay.com /2_2NgYDuc_FoodPoisoning.htm 15 P.Thanh (2009) Đến hết lo thực phẩm? http://dantri.com.vn/c7/s7317317/den-bao-gio-het-lo-ve-thuc-pham.htm 16 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (2009) Kỹ thuật lấy bảo quản mẫu thịt tươi từ sở giết mổ kinh doanh thịt để kiểm tra vi sinh vật, QCVN 01 - 04: 2009/BNNPTNT 17 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (2009) quy chuẩn kỹ thuật chất lượng nước ăn uống, QCVN 01:2009/ BYT 18 TCVN (1991) Cơ sở giết mổ - yêu cầu vệ sinh, TCVN-5452 19 TCVN 6848: 2007 (ISO 4832: 2007) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Coliform – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 20 TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng E coli dương tính beta glucuronidaza Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 44°C sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indol beta-dglucuronid 21 Thanh Tùng (2007) Báo động ngộ độc thực phẩm tập thể ThanhnienOnline http://www.thanhnien.com.vn/2007/pages/200738/209858.aspx 22 Tiêu chuẩn Việt Nam (1990) Thịt sản phẩm thịt – Phương pháp phát đếm số Staphylococcus aureus, TCVN - 5156 23 Tiêu chuẩn Việt Nam (1991) Thịt sản phẩm thịt – Phương pháp xác định CL Perfringgens, TCVN 4991 ( ISO 7937: 1985) 24 Tiêu chuẩn Việt Nam (1995) Chất lượng nước - Lấy mẫu Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu nước uống nước dùng để chế biến thực phẩm đồ uống: TCVN 5992:1995 25 Tiêu chuẩn Việt Nam (1995) Chất lượng nước - Lấy mẫu Hướng dẫn bảo quản xử lý mẫu: TCVN 5993:1995 58 26 Tiêu chuẩn Việt Nam (1996) Chất lượng nước – Phát đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt Escherichia coli giải định TCVN 6187:1996 (ISO 9308:1990) 27 Tiêu chuẩn Việt Nam (2002) Thịt tươi – Quy định kỹ thuật TCVN 7046:2009 28 Tiêu chuẩn Việt Nam (2002) Thịt sản phẩm thịt, Phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu thử TCVN 4833-2002 29 Tiêu chuẩn Việt Nam (2002) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát Salmonella đĩa thạch TCVN 4829: 2005 (ISO 06579: 2002) 30 Tiêu chuẩn Việt Nam (2005) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 300C: TCVN 4884:2005 31 Trần Đáng (2006) Các bệnh truyền qua thực phẩm: thực trạng giải pháp http://www.nutifood.com.vn/default.aspx?pageid=107&mid=416&action=docdetai lview&intDocid=287&intsetitemid=225&breadrumb=225 32 Trần Linh Thước (2002) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB giáo dục, Hà Nội, 2002 33 Trần Thị Hạnh, Nguyễn Tiến Thành, Ngô Văn Bắc, Trương Thị Hương Giang Trương Thị Quý Dương (2009) Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp sở giết mổ lợn công nghiệp thủ công Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVI, số 34 Trương Thị Dung (2000) Khảo sát số tiêu vệ sinh thú y điểm giết mổ lợn địa bàn thành phố Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp ĐHNN Hà Nội 2000 35 Viện khoa học kỹ thuật miền nam (2007) Nghiên cứu giải pháp cải tiến khâu vận chuyển thịt lợn Tạp chí chăn ni 6-07 36 Viện y học lao động vệ sinh môi trường (2002) Thường quy kỹ thuật y học lao động vệ sinh môi trường sức khoẻ trường học, Bộ y tế, nhà xuất y học, Hà Nội 37 Võ Thị Bích Thủy, Trần Thị Hạnh Lưu Quỳnh Hương (2002) Kết xác định số đặc tính sinh vật hóa học chủng Salmonella phân lập thực phẩm nguồn gốc động vật địa bàn Hà Nội Khoa học kỹ thuật thú y 59 Tài liệu tiếng Anh: 39 Akiko Nakama, Michinori Terao (1998) Accomparisoniof Listeria monocytogenes serovar 4b islates of clinical and food origin in Japan by pulsed-field gel eletrophoresis International journal of food microbiology, May, No42 40 Andrews W (1992) Manual of food quality control microbiological anlysis FAO, 1992 41 Avery S.M (2000) Comparision of two cultural methods for insolating Staphylococcus aureus for use in the New Zealand meat industry Meat Ind, res Inst N.Z.Publ No686 42 Beutin L.,H Karch (1997) Virulence markers of Shiga-like toxin producing E.coli strains originating from health domestic animals of different species Journal of Clinical Microbiology (33) 43 Borowka J (1989) Results of slaughter animals and meat inspection, Fleischwirtschaft, pp 69-99 44 Cromwell (1991) Economic Research Service (ERS) Bacterial foodborn disease Agricultural economic report No 741 Washington D.C, USA 45 FAO (1992) Manual of Food quality control 4.rew, Microbiological analysis, Published by Food and Agriculture Organization of United Nations, Rome 46 Fox Maggie (2009) Salmonella outbreak linked to peanut butter Yahoo News Fri jan, 2009 47 Grau F.H., Ed.A.M Pearson and T.R Dutson (1986) Advances in Meat Research Vol Meat and Poultry microbiology, AVI publishing Co., Connecticut, USA 86 48 Helrick A.C (1997) Association of Official Analytical Chemists, 16th edition, Vol.1, Published by Ins, Washington, Virginia, USA 49 Herry F J (1990) Bacterial contamination of warning food and drinking in rural Banladesh, pp.79-85 50 Ingram M and Simonsen J (1980) Microbial ecology on food Published by Academic Press, New York 51 Lowry and Bates (1989) Identification of Salmonella in the meat industry biochemical and serological procedures Meat Ind Red, Inst No2, bub No860 52 Mirin (1991) Meat Industry Research Institute Biological and methods for meat industry Published by Meat Ind Res Inst No2 No757 60 53 Morita R.Y (1975) Psychorotrophic bacteria bacteriological Reviews p.144 – 167 54 Mpamugo O., J Donovan and M M Brett (1995) Entrotoxigenic Clostridium perfringens as a cause of sporadic cases of diarrhea, J Med Microbial, p 442 - 445 55 Reid C M (1991) Escherichia coli – Microbiological methods fỏ the meat industry New Zealand Public 56 Solomon J (2004) “Protecting meat from oxygen and spoilage” Food magazine of Australia 23 November 2004, pp 12-15 61 PHỤ LỤC TCVN 6187-2: 1996 (ISO 9308-2: 1990) Chất lượng nước - xác định - phát đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt Escherichia coli giả định Phương pháp nhiều ống (số có xác suất cao nhất) Nguyên tắc: Cấy phần mẫu thử pha loãng khơng pha lỗng vào dãy ống nghiệm chứa mơi trường ni cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza Kiểm tra ống thử sau 24h 48h nuôi nhiệt độ 35°C 37°C; cấy chuyển tiếp từ ống có biểu đục kèm sinh khí vào ống môi trường khẳng định chọn lọc muốn tìm E coli giả định cấy vào mơi trường mà qua quan sát thấy tạo thành indol Nuôi môi trường khẳng định 48h nhiệt độ 35°C 37°C để xác định loại Coliform chịu nhiệt E coli giả định Bằng bảng thống kê, tính tốn số xác suất cao dạng Coliform, Coliform chịu nhiệt E coli giả định có 100ml mẫu thử từ số ống thử có kết xác nhận dương tính Ni cấy: Chuẩn bị mẫu thử, tiến hành pha lỗng mẫu cấy vào mơi trường phân lập phần mẫu thử theo ISO 8199 Cấy ủ mẫu vào môi trường Trypton Lauryl Sulfat (TLS): Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào dãy liên tiếp dãy chứa ống môi trường TLS Cấy 10ml mẫu thử vào ống dãy ống đầu tiên, 1ml mẫu thử vào ống dãy ống 0,1ml mẫu thử vào ống dãy ống cuối Nuôi cấy 37ºC, đếm số lượng ống TLS cho kết dương tính dãy sau 24h – 48h Để khẳng định Coliform: Cấy chuyển vòng que cấy từ ống TLS dương tính sang ống nghiệm chứa trường Brilliant Green Bile 2% broth (BGB), ủ 30ºC 24 h Để khẳng định E coli cần thực tiếp: Cấy chuyển ủ môi trường Escherichia coli broth (EC): Cấy chuyển vòng que cấy từ ống nghiệm TLS dương tính sang ống nghiệm đựng canh thang EC, ủ 44ºC 24h  2h Đếm số lượng ống EC cho kết dương tính dãy Các ống dương tính mơi trường EC cấy chuyển sang môi trường nước pepton không indol để kiểm tra sinh Indol Cấy ủ môi trường nước pepton không Indol: 62 Cấy vòng que cấy canh khuẩn từ ống nghiệm EC dương tính sang ống nghiệm đựng 5-10ml nước pepton không Indol, ủ 44ºC 24h  2h Sau kiểm tra sinh khí Indol Kiểm tra sinh Indol: Nhỏ 0,5 ml thuốc thử Kovac vào ống nghiệm chứa nước pepton không Indol ủ, trộn kỹ kiểm tra sau phút Nếu xuất vịng màu đỏ phía chứng tỏ có mặt E coli Ghi nhận số lượng ống nghiệm có E.coli dương tính độ pha lỗng mẫu Tính kết quả: Từ số lượng ống nghiệm có E.coli, Coliform dương tính độ pha lỗng mẫu, dùng bảng bảng thống kê ISO 8199, số có xác suất cao vi khuẩn Coliform E coli giả định Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt theo TCVN 4884: 2005 Nguyên lý: Trên môi trường thạch PCA điều kiện hiếu khí 30ºC sau 24 - 72 h, vi sinh vật hiếu khí có khả phát triển hình thành khuẩn lạc riêng rẽ Do đó, đếm số khuẩn lạc mơi trường Plate Count Agar để xác định số lượng vi sinh vật có chứa 1gam mẫu phân tích biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU đơn vị khối lượng thực phẩm Cách tiến hành: Dùng phương pháp đổ đĩa Với mẫu xét nghiệm phải ni cấy độ pha loãng liên tiếp, độ pha loãng cấy đĩa petri vô trùng Dùng pipet vô trùng chuyển ml dung dịch mẫu độ pha loãng tương ứng vào đĩa petri trống vơ trùng Rót vào đĩa khoảng 15 ml mơi trường Plate Count Agar (PCA) đun tan chảy làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47oC Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ lắc sang trái phải cách nhẹ nhàng mẫu tan vào môi trường Đặt đĩa mặt phẳng ngang để thạch đơng tự nhiên nhiệt độ phịng, lật úp đĩa đặt vào tủ ấm 30oC ni ấm đến 72 h Tính kết quả: Chọn tất đĩa có khuẩn lạc mọc riêng rẽ có số khuẩn lạc nằm khoảng từ 15 đến 300 khuẩn lạc/đĩa để đếm Độ pha loãng cao số khuẩn lạc phân bố khuẩn lạc đĩa nuôi cấy phải hợp lý Nếu kết khơng hợp lý phải tiến hành bước nuôi cấy lại Tổng số vi sinh vật hiếu khí 1g mẫu tính theo cơng thức: 63 Trong đó: X: Tổng số vi sinh vật hiếu khí 1g thịt (CFU/g) C: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa độ pha loãng liên tiếp n1: Là số đĩa độ pha loãng thứ đếm n2: Là số đĩa độ pha loãng thứ đếm d: Hệ số pha loãng với độ pha loãng thứ đếm - Nếu đĩa độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15-30, tính số khuẩn lạc độ pha loãng kết trung bình số học giá trị thu - Nếu đĩa nuôi cấy ứng với độ pha lỗng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì: - Nếu đĩa ni cấy độ pha lỗng 10-1 khơng có khuẩn lạc thì: Với: m trung bình số khuẩn lạc đĩa d độ pha loãng huyễn dịch ban đầu, d = 10-1 Cách biểu thị kết quả: Số thập phân từ 1.00 đến 9.99 nhân với số mũ tương ứng, ví dụ 1,56×104CFU/g Xác định E coli thịt theo TCVN 7924-2: 2008 Nguyên lý: E coli dương tính - glucuronidaza Vi khuẩn nhiệt độ 44°C hình thành khuẩn lạc màu xanh điển hình mơi trường Tryptone Bile X-glucuronide (TBX) Dựa vào đặc tính ta phát định lượng vi khuẩn E coli Cách tiến hành: Cấy độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, độ pha lỗng ni cấy đĩa môi trường Dùng pipet vô trùng chuyển ml dung dịch mẫu độ pha loãng tương ứng vào đĩa petri vơ trùng Rót vào đĩa khoảng 15 ml môi trường TBX đun tan chảy làm nguội đến nhiệt độ 44 – 47°C Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ lắc sang hai bên mẫu tan vào môi trường, để đông tự nhiên nhiệt độ phòng mặt phẳng nằm ngang Lật ngược đĩa, cần ủ ấm đĩa 37°C/4h sau chuyển sang ủ ấm 44°C/18 - 24h 64 Tính kết quả: Chọn đĩa có chứa 150 khuẩn lạc điển hình E coli dương tính glucuronidaza 300 khuẩn lạc tổng số đĩa thạch Số lượng khuẩn lạc E coli 1g mẫu thử tính theo cơng thức: Trong đó: N: Số khuẩn lạc E coli 1g thịt (CFU/g ); a: Là tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại sau độ pha lỗng liên tiếp, có đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh; n1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất; n2: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai; V: Thể tích mẫu cấy dùng đĩa, tính ml; d: Hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha loãng thứ giữ lại (d = trường hợp mẫu dạng lỏng mẫu thử cấy trực tiếp) Nếu đĩa chứa 10 khuẩn lạc, có khuẩn lạc, tính kết theo trường hợp chung báo cáo kết số ước tính nhân với VSV 1ml 1g sản phẩm Nếu tổng số khuẩn lạc từ đến 1, độ chụm kết thấp kết phải ghi sau: “Có mặt vi sinh vật nhỏ (4 × d) 1g 1ml Trong trường hợp nồng độ khơng có khuẩn lạc đặc trưng mọc lên tổng số E coli biểu thị kết sau: “ít 1/d vi sinh vật 1ml (sản phẩm dạng lỏng)” “ 1/d vi sinh vật gam (sản phẩm dạng khác) Với d hệ số pha loãng mẫu huyền phù ban đầu độ pha loãng thứ cấy giữ lại Định tính vi khuẩn Salmonella thịt theo TCVN 4829: 2005 Nguyên lý: Quá trình phát Salmonella thực phẩm cần qua giai đoạn nhau: (1) Tăng sinh sơ mẫu đồng để đảm bảo phát lượng nhỏ Salmonella bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách nhận dạng Salmonella khỏi quần thể vi sinh vật khác mẫu → (4) Khẳng định đặc tính sinh hóa, huyết học Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE, Mỗi môi trường giúp nhận dạng loài thuộc giống dựa đặc tính sinh hố đặc trưng tương ứng 65 Cách tiến hành: Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình cắt nhỏ vào túi PE vơ trùng chun dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng máy dập mẫu Stomacher tốc độ 260 vịng/phút phút thu huyễn dịch có nồng độ 10 -1 Ủ huyễn dịch mẫu đồng độ pha loãng 10-1 tủ ấm 37°C/18±2h Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) Tetrathionate Broth Muller-Kauffmann (MKTTn) Chuyển 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RVS, ủ 41,5°C/24h Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h Phân lập môi trường đặc chọn lọc nhận dạng: Sau ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc ria cấy lên bề mặt thạch đĩa Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD) Hektoen enteric agar (HE) Lật úp đĩa đặt tủ ấm 37°C/24h Khẳng định: Nếu mơi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu đen nghi Salmonella Nếu mơi trường HE hình thành khuẩn lạc màu đen nghi Salmonella Đánh dấu khuẩn lạc Salmonella nghi đĩa Ria cấy khuẩn lạc điển hình lên bề mặt đĩa thạch máu Ủ ấm 37°C/24h để thu khuẩn lạc Các khuẩn lạc dùng để để khẳng định tính chất sinh vật hố học hệ thống VITEK compact làm phản ứng huyết học (HTH) với kháng huyết O, H đa giá Tiến hành làm phản ứng HTH với kháng huyết (KHT) đa giá O kháng huyết đa giá H (Phản ứng ngưng kết phiến kính) Trước làm phản ứng HTH cần kiểm tra khả tự ngưng kết vi khuẩn Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tính ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H, Vi Nếu phản ứng HTH dương tính (có tượng ngưng kết) kết luận có diện vi khuẩn Salmonella mẫu thử Xác định Staphylococcus aureus thịt theo TCVN 4830-1: 2005 Nguyên lý: Vi khuẩn Staphylococci phát triển tốt mơi trường Baird Parker Agar Base có bổ sung Egg-Yolk Tellurite Emulsion (BP) tạo khuẩn lạc màu đen, trịn, lồi, bờ đều, 66 bóng có vịng suốt xung quanh chuyển hóa muối telorite de potassium dung giải protein lòng đỏ trứng Qua đếm số lượng vi khuẩn dựa số khuẩn lạc mọc môi trường nuôi cấy Việc khẳng định vi khuẩn Staphylococci (S aureus lồi khác) dựa phản ứng đơng huyết tương thỏ (coagulase) Cách tiến hành: Phân lập (cấy láng bề mặt thạch) Sử dụng đĩa môi trường BP để ni cấy đậm độ pha lỗng 10-1; 10-2; 10-3, độ pha lỗng ni cấy đĩa môi trường Hút 0,1ml dung dịch mẫu độ pha loãng khác lên bề mặt đĩa thạch Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy bề mặt đĩa thạch, để khô 15 phút nhiệt độ phòng Lật ngược đĩa ủ 37oC/24h, đếm số lượng khuẩn lạc điển hình đĩa thạch, đánh dấu vị trí khuẩn lạc điển hình Ủ tiếp 37oC/24h, sau ủ đánh dấu vị trí khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình Phép thử coagulase: Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 15 đến 300 khuẩn lạc Từ đĩa chọn khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình (nếu có loại khuẩn lạc) khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình (nếu chứa loại khuẩn lạc) Từ khuẩn lạc chọn dùng que cấy vô trùng lấy phần chuyển vào môi trường Brain Heart Infusion (BHI), đem ủ 37°C/24h Sau ủ lấy 0,1ml dịch cấy vô trùng cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ, ủ 37°C, sau - 6h kiểm tra đông huyết tương Nếu phản ứng âm tính, kiểm tra lại sau ủ 24h Phản ứng dương tính thể tích kết dính chiếm nửa thể tích ban đầu chất lỏng Lấy khuẩn lạc điển hình có phản ứng catalase (+), coagulase (+) cấy môi trường thạch máu để thu khuẩn lạc Tính kết quả: Tính số lượng vi khuẩn S aureus/gam sản phẩm sau: - Đối với đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/hoặc khơng điển hình, đĩa thạch chọn độ pha lỗng liên tiếp số lượng vi khuẩn S aureus tính theo cơng thức: Trong đó: a: Số lượng vi khuẩn S aureus nồng độ pha loãng liên tiếp chọn; 67 Ac: số lượng khuẩn lạc điển hình qua phép thử coagulase; Anc: số lượng khuẩn lạc không điển hình qua phép thử coagulase; bc: số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; bnc: số khuẩn lạc khơng điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; cc: tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy đĩa; cnc: tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy đĩa Số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus/1g sản phẩm tính theo cơng thức: Trong đó: ∑a: tổng số khuẩn lạc có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết tất đĩa chọn; V: thể tích chất cấy đĩa, tính mililit; n1: số đĩa chọn độ pha loãng thứ nhất; n2: số đĩa chọn độ pha loãng thứ 2; d: độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ chọn - Nếu hai đĩa tương ứng với mẫu thử huyền phù ban đầu, đĩa 15 khuẩn lạc kết tính sau: Trong đó: ∑a: Tổng số khuẩn lạc Staphylococcus có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết hai đĩa chọn; d: Hệ số pha loãng huyền phù ban đầu; V: Thể tích cấy đĩa Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử huyền phù ban đầu không chứa khuẩn lạc Staphylocuccus có phản ứng dương tính với coagulase báo cáo kết sau: “ Ít 1/d Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase gam sản phẩm, d hệ số pha loãng huyền phù ban đầu” 68 Xác định tổng số vi khuẩn Clostridium perfringens thịt theo TCVN 4991:2005 Nguyên lý: Vi khuẩn C perfringens yếm khí tuyệt đối, hình thành dạng khuẩn lạc đặc trưng màu đen môi trường Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC) điều kiện yếm khí Do đó, đếm số khuẩn lạc mọc mơi trường từ xác định số lượng vi khuẩn có mặt mẫu phân tích Cách tiến hành: Phân lập: Cấy độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, độ pha lỗng ni cấy đĩa mơi trường Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml huyễn dịch mẫu độ pha loãng tương ứng vào đĩa petri vơ trùng Rót 10 - 15ml mơi trường thạch TSC trì 44°C 47°C vào đĩa petri, xoay nhẹ đĩa để trộn dịch cấy vào môi trường, để môi trường đông tự nhiên nhiệt độ phịng Phủ thêm lớp khoảng 10 ml mơi trường thạch TSC lên bề mặt đĩa thạch TSC đông trên, để đĩa thạch đông tự nhiên bề mặt nằm ngang Đặt đĩa vào bình ni cấy yếm khí, dùng pack yếm khí (anaerobical pack) để tạo điều kiện yếm khí Ủ 370C/ 18 - 20h Đếm đĩa thạch chứa 150 khuẩn lạc màu đen, chọn khuẩn lạc điển hình để khẳng định sinh hóa Khẳng định sinh hóa: Sử dụng môi trường lactoza sunfit (LS) Cấy khuẩn lạc điển hình chọn vào mơi trường Thioglycolate lỏng, ủ kỵ khí 37°C/18 - 24h Sau thời gian ủ, chuyển giọt dịch cấy môi trường thioglycolate cấy vào mơi trường LS, ủ hiếu khí 46oC/18 - 24h Các ống dương tính có tượng sinh khí kết tủa đen sắt sulfit Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình màu đen mơi trường thạch SC khẳng định dương tính với mơi trường LS coi Clostridium perfringens Tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc điển hình đĩa petri độ pha lỗng liên tiếp có số khuẩn lạc không 150 Số vi khuẩn C perfringens gam thịt tính theo cơng thức: Trong đó: C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa độ pha loãng liên tiếp; X: Số vi khuẩn C perfringens gam thịt (CFU/g); n1: số đĩa độ pha loãng thứ đếm; 69 n2: số đĩa độ pha loãng thứ đếm; d: hệ số pha loãng với độ pha loãng thứ đếm Nếu đĩa độ pha lỗng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15 - 30, tính số khuẩn lạc độ pha loãng kết trung bình số học giá trị thu Nếu đĩa ni cấy ứng với độ pha lỗng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì: Nếu đĩa ni cấy độ pha lỗng 10-1 khơng có khuẩn lạc thì: Với: m trung bình số khuẩn lạc đĩa; d độ pha loãng huyễn dịch ban đầu, d = 10-1 Xác định Coliforms tổng số thịt theo TCVN 6848: 2007 Nguyên tắc: Cấy lượng mẫu thử xác định (mẫu lỏng) với lượng xác định huyền phù ban đầu (mẫu khác) lên cặp đĩa petri trống vô trùng Đổ khoảng 1215ml môi trường VRBL (Violet Red Bile lactoza) vào trung tâm đĩa Lắc xoay cho vi khuẩn phân tán lòng thạch Sử dụng dung dịch pha loãng thập phân cần thiết (10-1, 10-2, 10-3) Ủ đĩa 30oC/24h Đếm khuẩn lạc đặc trưng, cần khuẩn lạc khẳng định lên men lactoza Xử lý sơ pha lỗng mẫu Đồng mẫu cách cân xác 25 g 10 g mẫu thử đặc (hoặc 25 ml 10 ml mẫu thử lỏng) túi đập mẫu vô trùng Bổ sung 225 ml 90 ml nước đệm pepton vô trùng để thu lượng dịch mẫu pha loãng ban đầu 10-1 Đập mẫu máy Stomacher, dung dịch thu gọi dung dịch mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử (dạng lỏng) huyền phù ban đầu (10-1) dạng khác vào cặp đĩa Petrri vô trùng Tiến hành tương tự với nồng độ pha loãng Đổ đĩa: Rót vào đĩa khoảng 15 ml thạch VRBL trước đun tan chảy làm nguội đến 44 – 47oC nồi cách thủy 70 Trộn thạch mẫu thử cách quay sang trái phải chiều vòng cho vi khuẩn phân tán thạch Để đông tự nhiên mặt phẳng nằm ngang Chuẩn bị đồng thời đĩa để kiểm tra vô trùng Sau đông đặc hồn tồn, rót khoảng ml loại mơi trường lên bề mặt đĩa Để đông tự nhiên Lật ngược đĩa, để vào tủ ấm 30oC/24 ± 2h Đọc kết quả: Đếm khuẩn lạc điển hình mơi trường VRBL, tính kết số khuẩn lạc Coliform/g ml sản phẩm.(khuẩn lạc có màu đỏ ánh tía có ĐK 0.5mm lớn hơn, đơi có vùng mật tủa đỏ bao quanh) Với khuẩn lạc khơng điển hình, cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa canh thang mật lactoza lục sáng Ủ ống 30oC/24h Các ống Durham cho thấy sinh khí coi có chứa Coliform Tính kết từ khuẩn lạc điển hình mơi trường VRBL theo công thức sau: C: số khuẩn lạc điển hình đếm đĩa; n1, n2: số đĩa nồng độ pha loãng 1, 2; d: hệ số pha loãng thứ chọn; N: số khuẩn lạc g ml mẫu thử biếu thị kết dạng thập phân 1,0 9,9 nhân với 10x số mũ thích hợp 71 ... ? ?Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn số điểm giết mổ địa bàn quận Kiến An thành phố Hải Phòng? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát để thấy rõ thực trạng hoạt động giết. .. văn: ? ?Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn số điểm giết mổ địa bàn quận Kiến An thành phố Hải Phòng? ?? Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH GIẾT MỔ LỢN TẠI ĐỊA BÀN KIẾN AN 4.1.1 Địa điểm, số lượng quy mô Bảng 4.1 Địa điểm, quy mô giết mổ lợn quận Kiến An- Hải Phòng STT Tên sở giết mổ lợn Công