Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên trờng đại học s phạm hà nội khoa sinh ktnn ********** phạm thị quyên phân lập, tuyển chọn tối u hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học khóa luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Vi sinh học Hà Nội - 2008 Vĩnh Phúc, tháng năm 2008 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Lời cảm ơn Để có thành công đề tài này, em nhận giúp đỡ quý báu, tận tình thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN, đặc biệt cô giáo, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung v thy giỏo, TS Nguyn Khc Thanh Đề tài có đóng góp bạn nhóm vi sinh, giúp đỡ cđa Bé m«n C«ng nghƯ Sinh häc – Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến thầy cô giáo Xin chân thành cảm ơn phối hợp, giúp đỡ bạn nhóm vi sinh! H Nội, ngày 29 tháng năm 2008 Sinh viên Phạm Thị Quyên Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên LờI CAM ĐOAN Em xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng em, số liệu, kết khoá luận trung thực, không trùng lặp với công trình nghiên cứu khác./ Hà nội, ngày 29 tháng năm 2008 Sinh viên: Phạm Thị Quyên Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên mục lôc ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… …………………… …………… Trang 06 CHƯƠNG 1……………………………………………………… ………….………….……………… Trang 07 1.1 Lược sử nghiên cứu…………………… …….……… ………………………………….Trang 07 1.2 Phân loại Acetobacter………………….…… …………………………… ……………Trang 08 1.3 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter…………………………… Trang 11 1.4 Một số đặc điểm nhóm vi khuẩn Acetobacter……… Trang 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… … Trang 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu………………… ……………………………… ………………Trang 17 2.2 Trang thiết bị hóa chất………………… ……… ……….………….…………… Trang 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………… ………….… …………………….Trang 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……… … Trang 31 3.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ nguồn nguyên liệu……………………………………………………… …….Trang 31 3.2 Tuyển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum…….……….…….…….…Trang 34 3.3 Nghiên cứu động thái phát triển chủng Acetobacter xylinum N1 ………………… ………….…………………Trang 41 3.4 Khảo sát thay đổi pH dịch nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum N1…………… … …………….… ……… Trang 43 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trường ni cấy khác nhau………………….….……………… Trang 44 3.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy…………………………… …….……………… Trang 45 3.7 Xử lý màng bước đầu dùng màng để đắp lên vết thương hở thỏ thử nghiệm đắp mặt nạ dưỡng da số phụ nữ…………….……… Trang 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………… ………………… Trang 56 Tµi liƯu tham khảoTrang 57 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Danh mục bảng hình Bảng Bng 1.1 Nhng c điểm phân biệt Acetobacter Gluconobacter so sánh với Pseudomonas Bảng 2.1 Các môi trường nghiên cứu khả tạo màng Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm với yếu tố Bảng 2.3 Cách xử lý màng Bảng 3.1 Hàm lượng axit axetic số chủng vi khuẩn Acetobacter Bảng 3.2 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Bảng 3.4 Thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào Bảng 3.5 Tỷ lệ pH axit axetic dịch lên men Bảng 3.6 Khảo sát khả tạo màng chủng Acetobacter xylinum N1 môi trường khác Bảng 3.7 Các yếu tố mức khảo sát chủng Acetobacter xylinum N1 Bảng 3.8 Ma trận thực nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1 Bảng 3.9 Mơ hình thí nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1 Bảng 3.10 Bảng ma trận với lược đồ tối ưu hố điều kiện ni cấy chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Bảng 3.11 Các bước xử lý màng sinh học Bảng 3.12 Bảng theo dõi tình trạng vết thương (cm2) Bảng 3.13 Tỉ lệ lành vết thương (tính theo %) Bảng 3.14 Phiếu nhận xét cho điểm số người thử nghiệm dùng màng sinh học đắp mt Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Hình Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình 3.1 Ảnh khuẩn lạc thuộc nhóm III Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic số chủng vi khuẩn Acetobacter Hình 3.3 Một số hình ảnh mẫu thu qua thí nghiệm Hình 3.4 Ảnh tế bào số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III nhuộm Gram Hình 3.5 Đồ thị sinh trưởng chủng Acetobacter xylinum N1 Hình 3.6 Phần trăm axit axetic dịch lên men Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương thỏ Hình 3.8 Tiến trình lành vết thương thỏ thí nghiệm Khãa luËn tèt nghiệp Phạm Thị Quyên T VN Acetobacter xylinum l chủng vi khuẩn mà người tìm nhận thấy ý nghĩa vơ to lớn Vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tổng hợp polysacarit phân tử lớn cellulose Khi nuôi cấy mơi trường lỏng hình thành lớp màng bao gồm sợi cellulose giống sợi bơng khỏe hồn tồn co giãn mơi trường nước nóng Vì đặc tính mà màng sử dụng chế tạo màng sinh học Bản chất màng sinh học cấu tạo từ thành phần cellulose kết hợp với sinh khối tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Màng sinh học đảm bảo dẻo dai, độ bền, độ khỏe sợi cellulose gắn kết với chặt chẽ nhờ cầu nối vi khuẩn Acetobacter xylinum Từ đặc tính quý giá màng sinh học mà nhà khoa học giới tìm hàng loạt ứng dụng thực tiễn độc đáo nhiều lĩnh vực khác nhau: lĩnh vực công nghệ thực phẩm ứng dụng làm thạch dừa, y học ứng dụng làm màng thay da tạm thời, công nghệ mỹ phẩm làm mặt nạ giúp tẩy trang, làm sáng da mặt, đặc biệt công nghệ khoa học vật liệu ứng dụng sản xuất micro với độ xác cao, bảo vệ môi trường… ứng dụng mang lại lợi ích thiết thực người, bảo vệ sức khỏe cho người Đó coi phát kiến cho ngành vi sinh vật học, khẳng định vai trò, vị trí ngành vi sinh vật học ngành khoa học khác Với ứng dụng thiết thực kể trên, tiến hành nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học” Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ nguồn vật liệu khác Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng sinh học đạt yêu cầu: đủ mỏng, dai chắc, bề mặt nhẵn Tối ưu hóa điều kiện ni cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum Chế tạo ứng dụng màng sinh học để đắp lên vết thương hở thỏ dùng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ n Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên CHNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu [6] Từ lâu, người biết cách làm giấm sở khoa học trình làm giấm nào, giải thích lúc người chưa giải thích được, người làm giấm đơn giản kinh nghiệm thực tế Giấm (Vinaigre) dung dịch nước chứa khoảng 3% axit axetic Từ Vinaigre bắt nguồn từ hai từ tiếng Pháp vin có nghĩa la vang, aigre chua nên giả định người đời xưa dùng giấm đơn giản rượu vang hỏng mà Nhưng đến năm đầu kỷ 19 người biết giấm sản phẩm nhóm vi sinh vật định, xóa bỏ hồn tồn nghi ngờ nêu Ngày nay, người ta xác định nhóm vi sinh vật Acetobacter hay vi khuẩn axetic (vi khuẩn giấm) Những cơng trình nghiên cứu vi khuẩn axetic Person 1822 Ông ý đến lớp màng mỏng phát triển bề mặt giấm chứng minh loại vi sinh vật có tên Mycoderma aceti Đến năm 1837, Kiitzing làm thí nghiệm cách loại bỏ hết vi sinh vật bình giấm khơng tạo thành Từ đó, ơng đến kết luận: trình lên men giấm thiết phải có vi sinh vật Cũng năm 1837 này, Hansen nhà bác học tiếng người Đan Mạch tách từ màng giấm loại vi khuẩn giấm khiết là: Mycoderma aceti Mycoderma pasteurianum Đến năm 1862- 1868, Pasteur nhờ trợ giúp đắc lực kính hiển vi chứng minh đắn nhận xét Kiitzing Hansen Ông dùng kính hiển vi nghiên cứu màng xuất bia, rượu vang khẳng định màng tạo thành loại trực khuẩn ơng gọi l Mycoderma aceti Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyªn Những nghiên cứu sau vi khuẩn Acetobacter, tiếp tục làm rõ thêm trình lên men giấm Hiện nay, người ta bước phân loại Acetobacter thành nhóm khác nhau, nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa ứng dụng nhóm 1.2 Phân loại Acetobacter [6] 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter Để phân loại Acetobacter tác giả dựa vào tiêu chuẩn sau đây: - Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, khả di động, màu sắc hình thành tiên mao, vỏ nhầy, màu sắc nhuộm Gram… - Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất, màu sắc…đặc điểm khuẩn lạc môi trường thạch, nuôi cấy môi trường lỏng ý biến đổi môi trường sau thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay khơng mùi, màu sắc môi trường vàng nâu hay vàng nhạt…) - Các đặc điểm sinh hóa theo khóa phân loại Frateur 1950: + Khả tạo catalase + Khả tổng hợp xeto từ rượu bậc cao như: glierol, manitol, sorbitol + Khả oxi hóa axetat thành CO2 H2O + Khả oxi hóa glucozơ thành gluconic + Khả sử dụng muối amôn làm nguồn nitơ môi trường hoyer sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon + Khả sử dụng sắc tố nâu + Khả tổng hợp cellulose 1.2.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter Ngay từ kỷ XIX tác giả tiến hành phân lập Acetobacter thành chủng khiết tiến hành phân loại chúng Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Trong ú khúa phân loại Beijernck (1899) đáng ý nhất, ông chia vi khuẩn thành nhóm Đến năm 1916, Janke cơng trình Beijerinck, Janke phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa hai dấu hiệu sau: - Một là: khả sử dụng đạm amon để thực trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Acetobacter - Hai là: có hay khơng có giai đoạn di động trình phát triển Khi nghiên cứu nơi sinh sống đặc trưng vi khuẩn axetic năm 1926 Henenberg phân loại chúng thành nhóm sau đây: - Nhóm 1: vi khuẩn khơng phát triển bia hoa hublon có độc với chúng - Nhóm : vi khuẩn có khả phát triển bia - Nhóm : vi khuẩn phát triển dung dịch rượu vang - Nhóm : vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Đến năm 1934 theo nghiên cứu nhà vi khuẩn học Hoa kỳ vi khuẩn Acetobacter có khả sử dụng hợp chất tương đối đơn giản cacbon nitơ nên xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Nitrobacteriaceae Đến năm 1936 tác giả Kenyver, Wanneil, Staniel đề xuất ý kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào học vi khuẩn Pseudomonas chúng có tượng ghép cực xoắn phần di động Đến năm 1948, Vanghn công bố kết thu sau quan sát di động nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum Ông kết luận loại thuộc loại có đơn mao cực xác định vị trí vi khuẩn Acetobacter họ vi khuẩn Pseudomonadacae Cùng năm 1948, Krasilnicov với nghiên cứu xạ khuẩn vi khuẩn với tác giả người Mỹ báo thống xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae 10 Khãa luËn tèt nghiệp Phạm Thị Quyên - T 0h n 24h: lng axit axetic dịch lên men có tăng, chậm, đồng thời giá trị pH giảm Giai đoạn tương ứng với pha tiềm phát - Từ 24h đến 72h: lượng axit axetic dịch lên men tăng nhanh giá trị pH giảm Trong trình sinh trưởng vi khuẩn Acetobacter xylinum tích lũy lượng axit axetic định Tuy nhiên, axit axetic tăng pH giảm, giá trị pH xuống thấp lại tác nhân ức chế sinh trưởng vi khuẩn Như vậy, nhận thấy giá trị pH từ 4,24 đến 5,11 (tương ứng với % axit axetic 2,60 – 2,83%) điều kiện tốt cho phát triển vi khuẩn Acetobacter xylinum Bởi vậy, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Acetobacter xylinum N1 để tìm giá trị pH thích hợp cho nghiên cứu 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trường nuôi cấy khác Chúng sử dụng môi trường 2, 3, 4, 5, để khảo sát khả tạo màng chủng Acetobacter xylinum N1 theo dõi thời gian tạo màng quan sát tính chất màng tạo thành, cân khối lượng khô màng, thử khả chịu lực màng Bảng 3.6 Khảo sát khả tạo màng chủng Acetobacter xylinum N1 môi trường khác Chủng N1 MT2 Thời gian bắt đầu tạo màng (ngày) Tính chất màng Khá dai Màu sắc Màu sáng màng Khối lượng khô 3,62 màng Khả chịu Tốt lực màng MT3 MT4 MT5 MT6 Khá dai Dai Dai Khá dai Vàng nhạt Màu sáng Vàng đậm Màu ngà 3,47 3,4 4,25 3,74 Tốt Rất tốt Tốt Tốt 45 Khãa luËn tèt nghiÖp Phạm Thị Quyên T cỏc kt qu thớ nghim cho thấy mơi trường thích hợp Mơi trường có đầy đủ thành phần: nguồn cacbon từ đường glucozơ, nguồn nitơ hữu (pepton) vô (NH4)2SO4, nguồn vitamin từ cao nấm men, thành phần cao nấm men chứa số axit amin không thay nguồn vitamin phong phú đóng vai trò chất kích thích sinh trưởng cho vi khuẩn Acetobacter xylinum Mục đích chúng tơi tạo màng mỏng, lựa chọn mơi trường thích hợp Trên sở môi trường tiến hành nghiên cứu 3.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Chúng tiến hành tối ưu hóa số điều kiện ni cấy như: nhiệt độ, độ pH, thời gian ni cấy Trong q trình chọn số yếu tố cố định số yếu tố thay đổi * Các yếu tố cố định thành phần môi trường dinh dưỡng để lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum (MT4), hàm lượng giống bổ sung ban đầu: chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 bổ sung vào môi trường theo tỉ lệ 10% Hàm lượng tế bào tương ứng 1ml dịch giống là: 3,2x106 tế bào/ml tương ứng với giá trị OD 610nm, độ pha loãng 10-2 (theo phương pháp pha loãng Pasteur) * Các yếu tố thay đổi: - Nhiệt độ: X1 - pH: X2 - Thời gian ni cấy: X3 * Chỉ tiêu cực đại hóa: (y) a) Qua thực nghiệm nuôi cấy lựa chọn khoảng có ý nghĩa biến số X1, X2, X3 đưa khoảng biến thiên (λ) biến trình bày bảng 3.6 46 Khãa luËn tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Bng 3.7 Cỏc yu t mức khảo sát chủng Acetobacter xylinum N1 Yếu tố khảo sát Nhiệt độ (X1, oC) pH (X2) Thời gian (X3, ngày) Mức thấp (-) 27,5 Mức sở (0) 29 5,5 4,5 Mức cao (+) 30,5 Các mức khảo sát Với khoảng biến thiên λ = 1,5 b) Mơ hình tốn học mà cần thiết lập có dạng y = bo + b11 + b22 + b33 Trong đó: y: hàm mục tiêu 1,2,3: biến mã yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy c) Thiết lập ma trận theo phương pháp “Thực nghiệm yếu tố đầy đủ” Ma trận thực nghiệm với số yếu tố (n = 3), số thí nghiệm tương ứng N = 23 = Kết thu thí nghiệm trình bày đây: Bảng 3.8 Ma trận thực nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1 N 1 2 3 + + + + - + + + + - + + + + - x1 30,4 30,5 30,5 30,5 27,5 27,5 27,5 27,5 x2 x3 7 4 7 4 6 6 Khối lượng màng tươi thu y1 y2 y3  4,654 4,505 5,123 4,761 4,688 4,266 5,047 4,667 3,969 2,065 2,704 2,913 1,842 2,349 1,928 2,04 3,44 3,243 4,94 3,874 3,145 3,575 2,452 3,057 1,05 1,93 3,49 2,157 2,548 2,16 2,04 2,25 * Kiểm tra hội tụ số liệu theo tiêu chuẩn Cochran 47 Sj2 0,104 0,153 0,939 0,073 0,816 0,321 1,469 0,071 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên G tt  S2j max N S j i=1  1, 469  0,368 3,991 Điều kiện để sai số hội tụ Gtt < GB Ở GB tìm cách tra bảng chuẩn Cochran hết Bậc tự do: f1 = k – f = N = Qua thực tế tra bảng ta thấy GB = 0,516 > Gtt = 0,368 Như sai số hội tụ hay nói cách khác thí nghiệm đo với độ xác * Tính hệ số phương trình hồi quy ta có: N b0  y i=1 N i  25.72  3,125 Tương ứng ta có: b1 = 0,621 b2 = 0,886 b3 = 0,599 Như ta thiết lập mơ hình tốn học là: y = 3,215 + 0,6211 + 0,8862 + 0,5993 * Kiểm tra có nghĩa hệ số mơ hình theo tiêu chuẩn Student: Hệ số mơ hình có nghĩa bi  Sb t (với N = 8, f = N (k - 1) = 16) tra bảng phân phối Student ta tìm t = 2,12 với α = 0,05 Tính phương sai cho thí nghiệm: S2y  0, 499 Phương sai loại cho lần đo: 48 Khãa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên 0,166 Phng sai hệ số gánh chịu: Sb ≈ 0,204 Kết thu đối chiếu với ta thấy với i = 1, 2, ta có |bi| > Sbxt = 0,204 x 2,12 = 0,432 Như hệ số phương trình hồi quy xác định có nghĩa * Kiểm tra thích ứng mơ hình Để kiểm tra thích ứng mơ hình ta dùng chuẩn Fisher với: f1 = N – B = – = f2 = N(k-1) = 8.4 = 16 Tra bảng Fisher ta có: FB = 4,77 Để tính Ftt lập bảng sau: Bảng 3.9 Mơ hình thí nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1 N Mơ hình Khối lượng màng (g) yTT y TN (yTT - y TN )2 3,215 + 0,621 + 0,886 + 0,599 5,312 4,761 0,314 3,215 + 0,621 + 0,886 - 0,599 4,123 4,667 0,269 3,215 + 0,621 - 0,886 + 0,599 3,549 2,913 0,404 3,215 + 0,621 - 0,886 - 0,599 2,351 2,04 0,097 3,215 - 0,621 + 0,886 + 0,599 4,079 3,874 0,042 3,215 - 0,621 + 0,886 - 0,599 2,881 3,057 0,031 3,215 - 0,621 - 0,886 + 0,599 2,307 2,157 0,023 3,215 - 0,621 - 0,886 - 0,599 1,109 2,25 1,302 Theo công thức: 49 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên S T¦ N   y  yf N  B f 1 TN TT   2,509  0,627 Mà ta có: FTT     0,627  3,777 Min  S ;S  0,166 Max S2y ;STU y TU Như mô hình: y = 3,215 + 0,6211 + 0,8862 + 0,5993 hồn tồn thích ứng Từ mơ hình ta thấy: Các yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả tạo màng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 Khối lượng tươi màng tăng lên nhiệt độ, pH tăng, đồng thời thời gian nuôi cấy giảm, đạt hàm mục tiêu y, với khối lượng tiêu chuẩn tươi 3,4g bình tam giác có V = 250ml Trong yếu tố nhiệt độ ni cấy có ảnh hưởng mạnh đến khả tạo màng * Tìm điều kiện tối ưu: - Tìm giá trị |b1λ1| = 0,621 x 1,5 = 0,932 |b2λ2| = 0,886 x 1,5 = 1,329 |b3λ3| = 0,599 x 1,5 = 0,899 Như Max |biλ1| = |b2λ2| = 1,329 Nhiệt độ ảnh hưởng đến khả tạo màng chọn nhiệt độ (Δx1) làm biến sở Chọn: Δx1 = Δxcs = 0,5 Δx  Δx  1,329 x 0,5 = 0,5 1,329 0,899 x 0,5 = 0,338 1,329 50 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Bng 3.10 Bảng ma trận với lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Nhiệt độ (oC) 29 29,5 30 30,5 N pH 5,5 4,5 Thời gian (ngày) 4,5 4,162 3,824 3,486 Khối lượng tươi (g) y1 y2 y3  4,038 3,941 3,042 2,514 4,562 3,673 3,511 2,986 4,09 3,867 3,551 2,939 4,234 3,827 3,360 2,813 Qua bảng nhận thấy để đạt hàm mục tiêu ymax thí nghiệm thích hợp với: to = 30oC pH = 4,5 Thời gian nuôi cấy = 3,824 ngày 3.7 Xử lý màng bước đầu dùng màng để đắp lên vết thương hở thỏ thử nghiệm đắp mặt nạ dưỡng da số phụ nữ 3.7.1 Xử lý màng sinh học bước đầu dùng để đắp lên vết thương hở thỏ Sau tìm mơi trường dinh dưỡng môi trường số điều kiện tối ưu nuôi cấy thu hoạch khoảng 200 màng sinh học từ vi khuẩn Acetobacter xylinum với độ dày mỏng khác tiến hành xử lý qua bước sau: Bảng 3.11 Các bước xử lý màng sinh học Các bước Cách xử lý Rửa nước máy lần Đun với NaOH 0,5% 100oC Trung hòa nước chanh loãng Ngâm với NaOH 0,5N nhiệt độ phòng 10 giờ, lặp lại lần Trung hòa lại nước chanh lỗng 51 Kết Loại bỏ bớt axit axetic Màu sắc màng: vàng sậm Màng từ màu vàng sậm chuyển thành màu trắng Màng trắng trong, không mùi, đạt mặt cảm quan Mng trng Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyªn Màng dùng để đắp vết thương hở có đường kính 10cm, nặng 2g, trắng trong, khơng mùi tẩm dầu mù u (là chất sát khuẩn) Màng có đặc điểm sau: + Trắng trong, dễ quan sát tình trạng vết thương + Ngăn không cho vi khuẩn xâm nhập, che kín vết thương, hút dịch rỉ vết thương + Làm mát vết thương, thay da tạm thời Chúng tơi sử dụng động vật thí nghiệm để thay da tạm thời thỏ nhà khỏe mạnh, trọng lượng từ 1,4 – 1,6 kg, gây vết thương thỏ cách cắt 4cm2 da thỏ vị trí Khi có màng xử lý thỏ thí nghiệm chúng tơi bố trí thành lơ thí nghiệm sau: + Lơ 1: đắp màng sinh học có tẩm dầu mù u + Lơ 2: đắp gạc y tế có tẩm dầu mù u + Lô 3: bôi dầu mù u + Lơ 4: để vết thương tự lành Sau theo dõi tình trạng vết thương: quan sát tình trạng vết thương có nhiễm trùng hay khơng, đo diện tích vết thương lại theo thời gian Bảng 3.12 Bảng theo dõi tình trạng vết thương (cm2) Ngày 12 15 3,36 2,98 2,36 0,81 0,41 3,79 3,25 2,97 1,64 1,42 3,64 3,18 2,85 1,46 1,24 4 3,84 3,54 3,12 2,01 1,76 Lụ 52 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Bảng 3.13 Tỉ lệ lành vết thương (tính theo %) Ngày 12 15 16 25.5 41 79.75 89.75 5.25 18.75 25.75 59 64.5 20.5 28.75 63.5 69 4 11.5 22 49.75 56 Tỉ lệ lành vết thương (% ) Lô 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Lô Lô Lô Lô 12 15 Ngày Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương thỏ Qua thực nghiệm nhận thây lô điều trị màng sinh học tẩm dầu mù u, thời gian lành vết thương nhanh Một số hình ảnh tiến trình lành vết thương: a 53 Khãa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên b c d Hỡnh 3.8 Tiến trình lành vết thương thỏ thí nghiệm Qua thực nghiệm nhận thấy màng sinh học tẩm dầu mù u đắp lên vết thương hở thỏ giúp ngăn chặn vi sinh vật bên xâm nhp vo 54 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên vết thương, thế, màng sinh học không gây đau rát, dễ thay hàng ngày, làm cho vết thương chóng lành Như vậy, màng sinh học tẩm dầu mù u giúp vết thương mau lành sau 15 ngày điều trị, tỉ lệ lành vết thương 89,75% 3.7.2 Kết thử nghiệm dùng màng sinh học đắp mặt nạ dưỡng da số phụ nữ Chúng cung cấp cho số phụ nữ tự nguyện dùng màng sinh học làm mặt nạ dưỡng da Màng sinh học nuôi cấy môi trường số sau -4 ngày vớt màng, rửa qua nước sạch, đắp trực tiếp lên da mặt sau 30 phút rút nhận xét Hầu hết người thử nghiệm cho màng sinh học có tác dụng tốt là: làm bề mặt da, mùi thơm dễ chịu, làm se lỗ chân lơng, khơng gây kích ứng da Bảng 3.14 phiếu nhận xét cho điểm số người thử nghiệm dùng màng sinh học đắp mặt Các tiêu đánh giá Mùi vị (5 điểm) Cảm quan Độ dầy mỏng (5 điểm) Độ đồng (5 điểm) Các tiêu cụ thể Số điểm tối đa Nồng, khó chịu Khơng mùi Ít thơm Thơm dịu hài hoà Mỏng Hơi dầy Dầy Màng nhăn Nhăn ½ - 1/5 Hơi nhăn – 1/5 Bề mặt nhẵn 55 Số điểm người sử dụng cho nhận xét Khãa ln tèt nghiƯp Vò nhẹ rách Dai Dai vừa Dai Độ se lỗ Khơng se chân lơng (5điểm) Có se Độ Không Sạch Da xuất nhờn sau đắp Da xuất nhờn sau 1h, 3h, 8h, 12h ½; 1; 2; 15 Mùi khó chịu -5, -2 Khơng mùi Mùi thơm +5; +2 Độ dai độ đàn hồi (5 điểm) Phản ng sau p mt n Phạm Thị Quyên Thi gian trì độ bền sau đắp (15 điểm) Phản ứng để lại da Các biến đổi da sau đắp Khơng đổi màu da, có xu hướng tốt +2  +10 Đổi màu da, gây kích ứng -2  -10 Gây khó chịu đắp -1 Khơng gây khó chịu +1 Khơng gây kích ứng da (nóng, dát, dị ứng) +10 Như sử dụng màng sinh học làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ đem lại kết mặt cảm quan phản ứng sau dùng tốt 56 Khãa ln tèt nghiƯp Ph¹m Thị Quyên KT LUN V NGH A.KT LUN T nguồn nguyên liệu: bia hơi, rượu vang, dịch hoa phân lập 52 chủng vi khuẩn giấm Qua sơ tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo màng tương đối mỏng xác định chủng thuộc vi khuẩn Acetobacter xylinum Tiếp tục tuyển chọn lựa chọn chủng Acetobacter xylinum N1 có khả tạo màng mỏng, dai nhẵn đáp ứng yêu cầu chế tạo màng sinh học Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter xylinum N1: xác định lượng axit axetic, nghiên cứu động thái phát triển trình lên men, khả sinh axit axetic chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đạt cực đại 72 ni cấy tích lũy 3,01% axit axetic mơi trường; thực nghiệm tốn học chúng tơi tìm điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 gồm: nhiệt độ = 300C , pH= 4,5, thời gian tạo màng 3,824 ngày Bước đầu dùng đắp lên vết thương hở thỏ cho kết tốt B.ĐỀ NGHỊ Đây kết nghiên cứu bước đầu, để đạt mục đích đề nhiều vấn đề phải giải cần tiến hành nghiên cứu sâu Do chúng tơi có số đề nghị sau đây: Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 chủng vi khuẩn có giá trị ứng dụng vào thực tiễn cao Bởi cần nghiên cứu sâu đặc tính sinh học chủng Mở rộng việc nghiên cứu tối ưu hóa khả tạo màng mỏng với nhiều yếu tố hơn, tìm điều kiện ni cấy tối ưu để sản xuất màng quy mô công nghip 57 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên TI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng cộng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Tập Nguyễn Lân Dũng cộng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Tập Nguyễn Lân Dũng cộng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Tập Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Than (2001), Nghiên cứu tạo màng sinh học trị từ Acetobacter xylinum, Y học thực hành số Đinh Thị Kim Nhung (1995), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men axetic theo phương pháp chìm, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học Đinh Thị Kim Nhung , Lê Văn Nhương (1995), “Tối ưu hóa điều kiện lên men cho vi khuẩn Acetobacter phương pháp quy hoạch hóa tốn học thực nghiệm”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, số Đinh Thị Kim Nhung (1995), “Tối ưu hóa thành phần mơi trường dinh dưỡng cho vi khuẩn Acetobacter phương pháp quy hoạch hóa tốn học thực nghiệm”, Tạp chí sinh học, số Đinh Thị Kim Nhung (1997), “Phân lập tuyển chọn số chủng Acetobacter ứng dụng làm thạch dừa”, Thông báo khoa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, số 58 Khãa luËn tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Ti liu ting Anh 10 Haim W, Shai S., Dorit A, Yehudit S., Gail V, Patriccia O, Moshe B, 1997 Cdi-binding protein, a new factor regulating cellulose synthesis in Acetobacter xylinum FEBS letter 416, 207-201 11 Hong J.S, Moon S.H, Young G.K and Sang J.L 2001 Optimization of fermentation condittion for the production of bacterial cellulose by a Appl.Biochem 331-5 (printed in Great Britain) 59 ... vi sinh vật học ngành khoa học khác Với ứng dụng thiết thực kể trên, tiến hành nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn tối ưu hóa điều kiện ni cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học ... cứu: Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ nguồn vật liệu khác Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng sinh học đạt yêu cầu: đủ mỏng, dai chắc, bề mặt nhẵn Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. .. xylinum cho màng mỏng [5] Mục đích nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai để chế tạo màng sinh học dùng cho trị bỏng dùng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ Do tuyển