Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên trờng đại học s phạm hà nội khoa sinh ktnn ********** phạm thị quyên phân lập, tuyển chọn tối u hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học khóa luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Vi sinh học Hà Nội - 2008 Vĩnh Phúc, tháng năm 2008 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Lời cảm ơn Để có thành công đề tài này, em nhận giúp đỡ quý báu, tận tình thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN, đặc biệt cô giáo, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung v thy giỏo, TS Nguyn Khc Thanh Đề tài có đóng góp bạn nhóm vi sinh, giúp đỡ Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến thầy cô giáo Xin chân thành cảm ơn phối hợp, giúp đỡ bạn nhóm vi sinh! H Nội, ngày 29 tháng năm 2008 Sinh viên Phạm Thị Quyên Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên LờI CAM ĐOAN Em xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng em, số liệu, kết khoá luận trung thực, không trùng lặp với công trình nghiên cứu khác./ Hà nội, ngày 29 tháng năm 2008 Sinh viên: Phạm Thị Quyên Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên mục lục T VN Trang 06 CHNG .. Trang 07 1.1 Lc s nghiờn cu . .Trang 07 1.2 Phõn loi Acetobacter. Trang 08 1.3 c im chung ca vi khun Acetobacter Trang 11 1.4 Mt s c im ca cỏc nhúm vi khun Acetobacter Trang 14 CHNG I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU Trang 17 2.1 i tng nghiờn cu Trang 17 2.2 Trang thit b v húa cht .. Trang 17 2.3 Phng phỏp nghiờn cu . .Trang 18 CHNG KT QU NGHIấN CU V THO LUN Trang 31 3.1 Phõn lp vi khun Acetobacter t cỏc ngun nguyờn liu .Trang 31 3.2 Tuyn chng vi khun Acetobacter xylinum....Trang 34 3.3 Nghiờn cu ng thỏi phỏt trin ca chng Acetobacter xylinum N1 .Trang 41 3.4 Kho sỏt s thay i pH dch nuụi cy ca chng Acetobacter xylinum N1 . Trang 43 3.5 Kho sỏt kh nng to mng cỏc mụi trng nuụi cy khỏc nhau.. Trang 44 3.6 Ti u húa iu kin nuụi cy . Trang 45 3.7 X lý mng v bc u dựng mng p lờn vt thng h th v th nghim p mt n dng da mt s ph n. Trang 50 KT LUN V NGH Trang 56 Tài liệu tham khảoTrang 57 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Danh mục bảng hình Bảng Bng 1.1 Nhng c im phõn bit Acetobacter v Gluconobacter so sỏnh vi Pseudomonas Bng 2.1 Cỏc mụi trng nghiờn cu kh nng to mng Bng 2.2 Ma trn thc nghim vi yu t Bng 2.3 Cỏch x lý mng Bng 3.1 Hm lng axit axetic ca mt s chng vi khun Acetobacter Bng 3.2 Quan sỏt thi gian, c im mng to thnh v c im khun lc ca cỏc chng vi khun Acetobacter phõn lp c Bng 3.3 c im sinh húa ca chng vi khun Acetobacter xylinum Bng 3.4 Thi gian nuụi cy, s lng t bo Bng 3.5 T l pH v axit axetic dch lờn men Bng 3.6 Kho sỏt kh nng to mng ca chng Acetobacter xylinum N1 trờn cỏc mụi trng khỏc Bng 3.7 Cỏc yu t v mc kho sỏt chng Acetobacter xylinum N1 Bng 3.8 Ma trn thc nghim chng Acetobacter xylinum N1 Bng 3.9 Mụ hỡnh thớ nghim ca chng Acetobacter xylinum N1 Bng 3.10 Bng ma trn vi lc ti u hoỏ iu kin nuụi cy chng vi khun Acetobacter xylinum Bng 3.11 Cỏc bc x lý mng sinh hc Bng 3.12 Bng theo dừi tỡnh trng vt thng (cm2) Bng 3.13 T l lnh vt thng (tớnh theo %) Bng 3.14 Phiu nhn xột cho im ca mt s ngi th nghim dựng mng sinh hc p mt Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Hình Hỡnh 1.1 T bo vi khun Acetobacter xylinum Hỡnh 3.1 nh khun lc thuc nhúm III Hỡnh 3.2 th biu din hm lng axit axetic ca mt s chng vi khun Acetobacter Hỡnh 3.3 Mt s hỡnh nh mu thu c qua thớ nghim Hỡnh 3.4 nh t bo mt s chng vi khun thuc nhúm III nhum Gram Hỡnh 3.5 th sinh trng ca chng Acetobacter xylinum N1 Hỡnh 3.6 Phn trm axit axetic dch lờn men Hỡnh 3.7 th biu din t l lnh vt thng th Hỡnh 3.8 Tin trỡnh lnh vt thng th thớ nghim Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên T VN Acetobacter xylinum l mt nhng chng vi khun m ngi ó tỡm v nhn thy c ý ngha vụ cựng to ln ca nú Vi khun Acetobacter xylinum cú kh nng tng hp polysacarit phõn t ln cellulose Khi nuụi cy trờn mụi trng lng nú cú th hỡnh thnh lp mng bao gm cỏc si cellulose ging nh si bụng rt khe v hon ton cú th co gión c mụi trng nc núng Vỡ c tớnh ú m mng ny c s dng ch to mng sinh hc Bn cht ca mng sinh hc c cu to t thnh phn chớnh l cellulose kt hp vi sinh ca t bo vi khun Acetobacter xylinum Mng sinh hc m bo s dai, bn, chc khe bi cỏc si cellulose c gn kt vi ht sc cht ch nh cu ni l vi khun Acetobacter xylinum T nhng c tớnh quý giỏ ca mng sinh hc m cỏc nh khoa hc trờn th gii ó tỡm hng lot ng dng thc tin c ỏo trờn rt nhiu cỏc lnh vc khỏc nhau: lnh vc cụng ngh thc phm ng dng lm thch da, y hc ng dng lm mng thay th da tm thi, cụng ngh m phm lm mt n giỳp ty trang, lm sỏng da mt, c bit cụng ngh khoa hc vt liu mi ó ng dng sn xut micro vi chớnh xỏc cao, bo v mụi trng cỏc ng dng ny ó mang li li ớch thit thc i vi ngi, bo v sc khe cho ngi ú c coi l mt phỏt kin mi cho ngnh vi sinh vt hc, khng nh vai trũ, v trớ ca ngnh vi sinh vt hc i vi cỏc ngnh khoa hc khỏc Vi cỏc ng dng thit thc k trờn, chỳng tụi tin hnh nghiờn cu Phõn lp, tuyn chn v ti u húa iu kin nuụi cy cho chng Acetobacter xylinum, ch to mng sinh hc Mc tiờu nghiờn cu: Phõn lp vi khun Acetobacter t cỏc ngun vt liu khỏc Tuyn chn chng vi khun Acetobacter xylinum cho mng sinh hc t yờu cu: mng, dai chc, b mt nhn Ti u húa iu kin nuụi cy vi khun Acetobacter xylinum Ch to v ng dng mng sinh hc p lờn vt thng h th v dựng lm mt n dng da cho ph n Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên CHNG TNG QUAN TI LIU 1.1 Lc s nghiờn cu [6] T rt lõu, ngi ó bit cỏch lm gim nhng c s khoa hc ca quỏ trỡnh lm gim th no, gii thớch thỡ lỳc ú ngi cha gii thớch c, ngi lm gim ch n gin bng kinh nghim thc t ca mỡnh Gim (Vinaigre) l dung dch nc cha khong 3% axit axetic T Vinaigre bt ngun t hai t ting Phỏp vin cú ngha la vang, aigre l chua nờn cú th gi nh rng ngi i xa dựng gim ch n gin l ru vang hng m thụi Nhng n nhng nm u ca th k 19 thỡ ngi ó bit c gim l sn phm ca mt nhúm vi sinh vt nht nh, xúa b hon ton nhng nghi ng nờu trờn Ngy nay, ngi ta ó xỏc nh nhúm vi sinh vt ú l Acetobacter hay vi khun axetic (vi khun gim) Nhng cụng trỡnh nghiờn cu u tiờn v vi khun axetic l ca Person 1822 ễng ó chỳ ý n lp mng mng phỏt trin trờn b mt gim v ó chng minh ú l mt loi vi sinh vt cú tờn l Mycoderma aceti n nm 1837, Kiitzing lm thớ nghim bng cỏch loi b ht cỏc vi sinh vt cỏc bỡnh gim s khụng c to thnh T ú, ụng ó i n kt lun: quỏ trỡnh lờn men gim nht thit phi cú vi sinh vt Cng nm 1837 ny, Hansen nh bỏc hc ni ting ngi an Mch ó tỏch c t mng gim loi vi khun gim thun khit l: Mycoderma aceti v Mycoderma pasteurianum n nm 1862- 1868, Pasteur nh s tr giỳp c lc ca kớnh hin vi ó chng minh s ỳng n nhn xột ca Kiitzing v Hansen ễng ó dựng kớnh hin vi nghiờn cu mng xut hin trờn bia, ru vang v khng nh mng ú c to thnh mt loi trc khun v ụng cng gi nú l Mycoderma aceti Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Nhng nghiờn cu sau ny trờn vi khun Acetobacter, tip tc lm rừ thờm quỏ trỡnh lờn men gim Hin nay, ngi ta ang tng bc phõn loi Acetobacter thnh cỏc nhúm khỏc nhau, nghiờn cu c tớnh sinh lý, sinh húa cng nh ng dng ca tng nhúm ú 1.2 Phõn loi Acetobacter [6] 1.2.1 Cỏc tiờu chun phõn loi Acetobacter phõn loi Acetobacter cỏc tỏc gi da vo cỏc tiờu chun sau õy: - c im hỡnh thỏi: ú l hỡnh dng t bo, cỏch sp xp t bo, kh nng di ng, mu sc s hỡnh thnh tiờn mao, v nhy, mu sc nhum Gram - c im nuụi cy: da vo trng thỏi, c im, c tớnh, tớnh cht, mu scc im ca khun lc trờn mụi trng thch, nuụi cy trờn mụi trng lng chỳ ý s bin i ca mụi trng sau mt thi gian nuụi cy (mụi trng c hay trong, cú mựi thm d chu hay khụng mựi, mu sc mụi trng vng nõu hay vng nht) - Cỏc c im sinh húa theo khúa phõn loi ca Frateur 1950: + Kh nng to catalase + Kh nng tng hp cỏc xeto t cỏc ru bc cao nh: glierol, manitol, sorbitol + Kh nng oxi húa axetat thnh CO2 v H2O + Kh nng oxi húa glucoz thnh gluconic + Kh nng s dng mui amụn lm ngun nit mụi trng ca hoyer v s dng ru etylic lm ngun cacbon + Kh nng s dng sc t nõu + Kh nng tng hp cellulose 1.2.2 Phõn loi vi khun Acetobacter Ngay t th k XIX cỏc tỏc gi ó tin hnh phõn lp Acetobacter thnh cỏc chng thun khit v tin hnh phõn loi chỳng Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Trong ú khúa phõn loi ca Beijernck (1899) l ỏng chỳ ý nht, ụng ó chia vi khun thnh nhúm c bn n nm 1916, Janke ó k tip cụng trỡnh ca Beijerinck, Janke ó phõn loi vi khun Acetobacter da trờn hai du hiu c bn sau: - Mt l: kh nng s dng m amon thc hin quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca vi khun Acetobacter - Hai l: cú hay khụng cú giai on di ng quỏ trỡnh phỏt trin Khi nghiờn cu ni sinh sng c trng ca vi khun axetic nm 1926 Henenberg ó phõn loi chỳng thnh nhúm sau õy: - Nhúm 1: vi khun khụng phỏt trin trờn bia vỡ hoa hublon cú c vi chỳng - Nhúm : vi khun cú kh nng phỏt trin trờn bia - Nhúm : vi khun phỏt trin trờn dung dch ru vang - Nhúm : vi khun dựng sn xut gim theo phng phỏp nhanh n nm 1934 theo nghiờn cu ca cỏc nh vi khun hc Hoa k vi khun Acetobacter cú kh nng s dng cỏc hp cht tng i n gin ca cacbon v nit nờn ó xp vi khun Acetobacter vo h Nitrobacteriaceae n nm 1936 cỏc tỏc gi Kenyver, Wanneil, Staniel ó xut ý kin ghộp vi khun Acetobacter vo hc vi khun Pseudomonas chỳng cú hin tng ghộp cc xon phn di ng n nm 1948, Vanghn ó cụng b nhng kt qu thu c sau quan sỏt s di ng ca nhiu loi vi khun: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum ễng kt lun nhng loi trờn cựng thuc mt loi cú n mao cc v ó xỏc nh v trớ ca vi khun Acetobacter h vi khun Pseudomonadacae Cựng nm 1948, Krasilnicov vi nghiờn cu v x khun v vi khun cựng vi tỏc gi ngi M cỏc bi bỏo ca mỡnh u thng nht xp vi khun Acetobacter vo h vi khun Pseudomonadaceae 10 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên - T 0h n 24h: lng axit axetic dch lờn men cú tng, nhng chm, ng thi giỏ tr pH cng gim Giai on ny tng ng vi pha tim phỏt - T 24h n 72h: lng axit axetic dch lờn men tng nhanh v giỏ tr pH gim Trong quỏ trỡnh sinh trng vi khun Acetobacter xylinum cú th tớch ly c lng axit axetic nht nh Tuy nhiờn, axit axetic tng thỡ pH gim, nu giỏ tr pH xung thp li l mt tỏc nhõn c ch sinh trng ca chớnh vi khun ny Nh vy, chỳng tụi nhn thy giỏ tr pH t 4,24 n 5,11 (tng ng vi % axit axetic l 2,60 2,83%) l iu kin tt cho s phỏt trin ca vi khun Acetobacter xylinum Bi vy, chỳng tụi ó tin hnh ti u húa iu kin nuụi cy ca chng Acetobacter xylinum N1 tỡm giỏ tr pH thớch hp nht cho cỏc nghiờn cu tip theo 3.5 Kho sỏt kh nng to mng cỏc mụi trng nuụi cy khỏc Chỳng tụi s dng cỏc mụi trng 2, 3, 4, 5, kho sỏt kh nng to mng ca chng Acetobacter xylinum N1 ri theo dừi thi gian to mng v quan sỏt tớnh cht ca mng to thnh, cõn lng khụ ca mng, th kh nng chu lc ca mng Bng 3.6 Kho sỏt kh nng to mng ca chng Acetobacter xylinum N1 trờn cỏc mụi trng khỏc Chng N1 MT2 Thi gian bt u to mng (ngy) Tớnh cht mng Khỏ dai Mu sc ca Mu sỏng mng Khi lng khụ 3,62 ca mng Kh nng chu Tt lc ca mng MT3 MT4 MT5 MT6 Khỏ dai Dai Dai Khỏ dai Vng nht Mu sỏng Vng m Mu ng 3,47 3,4 4,25 3,74 Tt Rt tt Tt Tt 45 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên T cỏc kt qu thớ nghim cho thy mụi trng l thớch hp Mụi trng cú y cỏc thnh phn: ngun cacbon t ng glucoz, ngun nit hu c (pepton) v vụ c (NH4)2SO4, ngun vitamin t cao nm men, thnh phn ca cao nm men cha mt s axit amin khụng thay th cng nh ngun vitamin phong phỳ úng vai trũ l cỏc cht kớch thớch sinh trng cho vi khun Acetobacter xylinum Mc ớch ca chỳng tụi l to mng mng, vy la chn mụi trng l thớch hp Trờn c s mụi trng chỳng tụi tin hnh cỏc nghiờn cu tip theo 3.6 Ti u húa iu kin nuụi cy Chỳng tụi ó tin hnh ti u húa mt s iu kin nuụi cy nh: nhit , pH, thi gian nuụi cy Trong quỏ trỡnh ú chn mt s yu t c nh v mt s yu t thay i * Cỏc yu t c nh cỏc thnh phn ca mụi trng dinh dng lờn men vi khun Acetobacter xylinum (MT4), hm lng ging b sung ban u: chng vi khun Acetobacter xylinum N1 c b sung vo mụi trng theo t l 10% Hm lng t bo tng ng 1ml dch ging l: 3,2x106 t bo/ml tng ng vi giỏ tr OD 610nm, pha loóng l 10-2 (theo phng phỏp pha loóng ca Pasteur) * Cỏc yu t thay i: - Nhit : X1 - pH: X2 - Thi gian nuụi cy: X3 * Ch tiờu cc i húa: (y) a) Qua thc nghim nuụi cy chỳng tụi la chn khong cú ý ngha ca cỏc bin s X1, X2, X3 v a khong bin thiờn () ca cỏc bin nh trỡnh by bng 3.6 46 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Bng 3.7 Cỏc yu t v mc kho sỏt chng Acetobacter xylinum N1 Yu t kho sỏt Nhit (X1, oC) pH (X2) Thi gian (X3, ngy) Mc thp (-) 27,5 Mc c s (0) 29 5,5 4,5 Mc cao (+) 30,5 Cỏc mc kho sỏt Vi khong bin thiờn = 1,5 b) Mụ hỡnh toỏn hc m cn thit lp cú dng y = bo + b11 + b22 + b33 Trong ú: y: hm mc tiờu 1,2,3: bin mó ca yu t nhit , pH, thi gian nuụi cy c) Thit lp ma trn theo phng phỏp Thc nghim yu t y Ma trn thc nghim vi s yu t (n = 3), s thớ nghim tng ng s l N = 23 = Kt qu thu c ca thớ nghim c trỡnh by di õy: Bng 3.8 Ma trn thc nghim chng Acetobacter xylinum N1 N 3 + + + + - + + + + - + + + + - x1 30,4 30,5 30,5 30,5 27,5 27,5 27,5 27,5 x2 x3 7 4 7 4 6 6 Khi lng mng ti thu c y1 y2 y3 4,654 4,505 5,123 4,761 4,688 4,266 5,047 4,667 3,969 2,065 2,704 2,913 1,842 2,349 1,928 2,04 3,44 3,243 4,94 3,874 3,145 3,575 2,452 3,057 1,05 1,93 3,49 2,157 2,548 2,16 2,04 2,25 * Kim tra s hi t ca cỏc s liu theo tiờu chun Cochran 47 Sj2 0,104 0,153 0,939 0,073 0,816 0,321 1,469 0,071 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên G tt S2j max N j S 1, 469 0,368 3,991 i=1 iu kin sai s hi t Gtt < GB õy GB c tỡm bng cỏch tra bng chun Cochran ó ht Bc t do: f1 = k v f = N = Qua thc t tra bng c ta thy GB = 0,516 > Gtt = 0,368 Nh vy cỏc sai s hi t hay núi cỏch khỏc l cỏc thớ nghim ó c o vi cựng mt chớnh xỏc nh * Tớnh cỏc h s ca phng trỡnh hi quy ta cú: N y b0 i=1 N i 25.72 3,125 Tng ng ta cú: b1 = 0,621 b2 = 0,886 b3 = 0,599 Nh vy ta thit lp mụ hỡnh toỏn hc l: y = 3,215 + 0,6211 + 0,8862 + 0,5993 * Kim tra s cú ngha ca cỏc h s ca mụ hỡnh trờn theo tiờu chun Student: H s ca mụ hỡnh trờn ch cú ngha bi Sb t (vi N = 8, f = N (k - 1) = 16) tra bng phõn phi Student ta tỡm c t = 2,12 vi = 0,05 Tớnh phng sai cho tng thớ nghim: S2y 0, 499 Phng sai cựng loi cho mi ln o: 48 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên 0,166 Phng sai cỏc h s gỏnh chu: Sb 0,204 Kt qu thu c i chiu vi trờn thỡ ta thy vi i = 1, 2, ta u cú c |bi| > Sbxt = 0,204 x 2,12 = 0,432 Nh vy mi h s ca phng trỡnh hi quy ó xỏc nh c trờn u cú ngha * Kim tra s thớch ng ca mụ hỡnh kim tra s thớch ng ca mụ hỡnh ta dựng chun Fisher vi: f1 = N B = = f2 = N(k-1) = 8.4 = 16 Tra bng Fisher ta cú: FB = 4,77 tớnh c Ftt lp bng sau: Bng 3.9 Mụ hỡnh thớ nghim ca chng Acetobacter xylinum N1 Khi lng mng (g) N Mụ hỡnh yTT y TN (yTT - y TN )2 3,215 + 0,621 + 0,886 + 0,599 5,312 4,761 0,314 3,215 + 0,621 + 0,886 - 0,599 4,123 4,667 0,269 3,215 + 0,621 - 0,886 + 0,599 3,549 2,913 0,404 3,215 + 0,621 - 0,886 - 0,599 2,351 2,04 0,097 3,215 - 0,621 + 0,886 + 0,599 4,079 3,874 0,042 3,215 - 0,621 + 0,886 - 0,599 2,881 3,057 0,031 3,215 - 0,621 - 0,886 + 0,599 2,307 2,157 0,023 3,215 - 0,621 - 0,886 - 0,599 1,109 2,25 1,302 Theo cụng thc: 49 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên S TƯ N y yf N B f TN TT 2,509 0, 627 M ta cú: FTT 0,627 3,777 Min S ;S 0,166 Max S2y ;STU y TU Nh vy mụ hỡnh: y = 3,215 + 0,6211 + 0,8862 + 0,5993 l hon ton thớch ng T mụ hỡnh ta thy: Cỏc yu t nhit , pH, thi gian nuụi cy u cú nh hng rt ln n kh nng to mng ca vi khun Acetobacter xylinum N1 Khi lng ti ca mng tng lờn nhit , pH tng, ng thi thi gian nuụi cy gim, t hm mc tiờu y, vi lng tiờu chun ti l 3,4g bỡnh tam giỏc cú V = 250ml Trong yu t trờn nhit nuụi cy cú nh hng mnh nht n kh nng to mng * Tỡm iu kin ti u: - Tỡm cỏc giỏ tr |b11| = 0,621 x 1,5 = 0,932 |b22| = 0,886 x 1,5 = 1,329 |b33| = 0,599 x 1,5 = 0,899 Nh vy Max |bi1| = |b22| = 1,329 Nhit nh hng n kh nng to mng vy chỳng tụi chn nhit (x1) lm bin c s Chn: x1 = xcs = 0,5 x x 1,329 x 0,5 = 0,5 1,329 0,899 x 0,5 = 0,338 1,329 50 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Bng 3.10 Bng ma trn vi lc ti u hoỏ iu kin nuụi cy chng vi khun Acetobacter xylinum Nhit (oC) 29 29,5 30 30,5 N pH 5,5 4,5 Thi gian (ngy) 4,5 4,162 3,824 3,486 Khi lng ti (g) y1 y2 y3 4,038 3,941 3,042 2,514 4,562 3,673 3,511 2,986 4,09 3,867 3,551 2,939 4,234 3,827 3,360 2,813 Qua bng trờn chỳng tụi nhn thy t c hm mc tiờu ymax thỡ thớ nghim l thớch hp nht vi: to = 30oC pH = 4,5 Thi gian nuụi cy = 3,824 ngy 3.7 X lý mng v bc u dựng mng p lờn vt thng h th v th nghim p mt n dng da mt s ph n 3.7.1 X lý mng sinh hc v bc u dựng p lờn vt thng h th Sau ó tỡm c mụi trng dinh dng l mụi trng s v iu kin ti u chỳng tụi ó nuụi cy thu hoch c khong hn 200 tm mng sinh hc t cỏc vi khun Acetobacter xylinum vi cỏc dy mng khỏc v tin hnh x lý qua cỏc bc nh sau: Bng 3.11 Cỏc bc x lý mng sinh hc Cỏc bc Cỏch x lý Ra sch bng nc mỏy ln un vi NaOH 0,5% 100oC Trung hũa bng nc chanh loóng Ngõm vi NaOH 0,5N nhit phũng 10 gi, lp li ln Trung hũa li bng nc chanh loóng 51 Kt qu Loi b bt axit axetic Mu sc ca mng: vng sm Mng t mu vng sm chuyn thnh mu trng Mng trng trong, khụng mựi, t v mt cm quan Mng trng Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Mng dựng p vt thng h cú ng kớnh 10cm, nng 2g, trng trong, khụng mựi c tm du mự u (l cht sỏt khun) Mng cú c im sau: + Trng trong, d quan sỏt tỡnh trng vt thng + Ngn khụng cho cỏc vi khun xõm nhp, che kớn vt thng, hỳt cỏc dch r vt thng + Lm mỏt vt thng, thay th da tm thi Chỳng tụi s dng ng vt thớ nghim thay th da tm thi l th nh khe mnh, trng lng t 1,4 1,6 kg, gõy vt thng th bng cỏch ct 4cm2 da th cựng mt v trớ Khi cú c mng ó c x lý v th thớ nghim chỳng tụi b trớ thnh lụ thớ nghim nh sau: + Lụ 1: p mng sinh hc cú tm du mự u + Lụ 2: p gc y t cú tm du mự u + Lụ 3: ch bụi du mự u + Lụ 4: vt thng t lnh Sau ú theo dừi tỡnh trng vt thng: quan sỏt tỡnh trng vt thng cú nhim trựng hay khụng, o din tớch vt thng cũn li theo thi gian Bng 3.12 Bng theo dừi tỡnh trng vt thng (cm2) Ngy 12 15 3,36 2,98 2,36 0,81 0,41 3,79 3,25 2,97 1,64 1,42 3,64 3,18 2,85 1,46 1,24 4 3,84 3,54 3,12 2,01 1,76 Lụ 52 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Bng 3.13 T l lnh vt thng (tớnh theo %) Ngy 12 15 16 25.5 41 79.75 89.75 5.25 18.75 25.75 59 64.5 20.5 28.75 63.5 69 4 11.5 22 49.75 56 T l lnh vt thng (% ) Lụ 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Lụ Lụ Lụ Lụ 12 15 Ngy Hỡnh 3.7 th biu din t l lnh vt thng th Qua thc nghim chỳng tụi nhn thõy lụ c iu tr bng mng sinh hc tm du mự u, thi gian lnh vt thng nhanh nht Mt s hỡnh nh v tin trỡnh lnh vt thng: a 53 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên b c d Hỡnh 3.8 Tin trỡnh lnh vt thng th thớ nghim Qua thc nghim nhn thy mng sinh hc c tm du mự u p lờn vt thng h th giỳp ngn chn vi sinh vt bờn ngoi xõm nhp vo 54 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên vt thng, khụng nhng th, mng sinh hc khụng gõy au rỏt, d thay hng ngy, lm cho vt thng chúng lnh Nh vy, mng sinh hc c tm du mự u giỳp vt thng mau lnh nht sau 15 ngy iu tr, t l lnh vt thng l 89,75% 3.7.2 Kt qu th nghim dựng mng sinh hc p mt n dng da mt s ph n Chỳng tụi ó cung cp cho mt s ph n t nguyn dựng mng sinh hc lm mt n dng da Mng sinh hc c nuụi cy trờn mụi trng s sau -4 ngy vt mng, qua bng nc sch, p trc tip lờn da mt sau 30 phỳt rỳt nhn xột Hu ht nhng ngi th nghim u cho rng mng sinh hc cú tỏc dng tt nh l: lm sch b mt da, mựi thm d chu, lm se l chõn lụng, khụng gõy kớch ng i vi da Bng 3.14 phiu nhn xột cho im ca mt s ngi th nghim dựng mng sinh hc p mt Cỏc ch tiờu ỏnh giỏ Mựi v (5 im) Cm quan dy mng (5 im) ng nht (5 im) Cỏc ch tiờu c th S im ti a Nng, khú chu Khụng mựi t thm Thm du hi ho Mng Hi dy Dy Mng nhn Nhn ớt ẵ - 1/5 Hi nhn 1/5 B mt nhn 55 S im ngi s dng cho v nhn xột Khóa luận tốt nghiệp Vũ nh rỏch Dai ớt Dai va Dai se ca l Khụng se chõn lụng (5im) Cú se sch Khụng sch Sch Da xut hin nhn sau p Da xut hin nhn sau 1h, 3h, 8h, 12h ẵ; 1; 2; 15 Mựi khú chu -5, -2 Khụng mựi Mựi thm +5; +2 dai v n hi (5 im) Phn ng sau p mt n Phạm Thị Quyên Thi gian trỡ bn sau p (15 im) Phn ng li trờn da Cỏc bin i ca da sau p Khụng i mu da, cú xu hng tt +2 +10 i mu da, gõy kớch ng -2 -10 Gõy khú chu p -1 Khụng gõy khú chu +1 Khụng gõy kớch ng da (núng, dỏt, d ng) +10 Nh vy s dng mng sinh hc lm mt n dng da cho ph n em li kt qu v mt cm quan v cỏc phn ng sau dựng khỏ tt 56 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên KT LUN V NGH A.KT LUN T cỏc ngun nguyờn liu: bia hi, ru vang, dch hoa qu chỳng tụi ó phõn lp c 52 chng vi khun gim Qua s tuyn chỳng tụi chn c chng vi khun cú kh nng to mng tng i mng v xỏc nh chng ú thuc vi khun Acetobacter xylinum Tip tc tuyn chn chỳng tụi la chn c chng Acetobacter xylinum N1 cú kh nng to mng mng, dai v nhn ỏp ng c cỏc yờu cu ch to mng sinh hc Nghiờn cu mt s c tớnh sinh hc ca chng Acetobacter xylinum N1: xỏc nh lng axit axetic, nghiờn cu ng thỏi phỏt trin ca quỏ trỡnh lờn men, kh nng sinh axit axetic ca chng vi khun Acetobacter xylinum t cc i 72 gi nuụi cy v tớch ly c 3,01% axit axetic mụi trng; bng thc nghim toỏn hc chỳng tụi ó tỡm c iu kin nuụi cy thớch hp cho chng vi khun Acetobacter xylinum N1 gm: nhit = 300C , pH= 4,5, thi gian to mng 3,824 ngy Bc u dựng p lờn vt thng h th cho kt qu tt B. NGH õy l nhng kt qu nghiờn cu bc u, t c mc ớch cũn nhiu phi gii quyt v cn tin hnh cỏc nghiờn cu sõu hn Do vy chỳng tụi cú mt s ngh sau õy: Chng vi khun Acetobacter xylinum N1 l mt chng vi khun cú giỏ tr ng dng vo thc tin cao Bi vy cn nghiờn cu sõu hn v cỏc c tớnh sinh hc ca chng ny M rng vic nghiờn cu ti u húa kh nng to mng mng vi nhiu yu t hn, tỡm iu kin nuụi cy ti u sn xut mng trờn quy mụ cụng nghip 57 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên TI LIU THAM KHO Ti liu ting Vit Nguyn Lõn Dng v cng s (1972), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Nh xut bn Khoa hc v K thut, Tp Nguyn Lõn Dng v cng s (1976), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Nh xut bn Khoa hc v K thut, Tp Nguyn Lõn Dng v cng s (1978), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Nh xut bn Khoa hc v K thut, Tp Nguyn Thnh t, Nguyn Duy Tho, Vng Trng Ho (1990), Thc hnh vi sinh vt hc, Nh xut bn Giỏo dc Hunh Th Ngc Lan, Nguyn Vn Than (2001), Nghiờn cu to mng sinh hc tr phng t Acetobacter xylinum, Y hc thc hnh s inh Th Kim Nhung (1995), Nghiờn cu mt s c im sinh hc ca vi khun Acetobacter v ng dng chỳng lờn men axetic theo phng phỏp chỡm, Lun ỏn Phú tin s khoa hc Sinh hc inh Th Kim Nhung , Lờ Vn Nhng (1995), Ti u húa iu kin lờn men cho vi khun Acetobacter bng phng phỏp quy hoch húa toỏn hc thc nghim, Tp khoa hc v cụng ngh, s inh Th Kim Nhung (1995), Ti u húa thnh phn mụi trng dinh dng cho vi khun Acetobacter bng phng phỏp quy hoch húa toỏn hc thc nghim, Tp sinh hc, s inh Th Kim Nhung (1997), Phõn lp v tuyn chn mt s chng Acetobacter ng dng lm thch da, Thụng bỏo khoa hc trng i hc S phm H Ni 2, s 58 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Ti liu ting Anh 10 Haim W, Shai S., Dorit A, Yehudit S., Gail V, Patriccia O, Moshe B, 1997 Cdi-binding protein, a new factor regulating cellulose synthesis in Acetobacter xylinum FEBS letter 416, 207-201 11 Hong J.S, Moon S.H, Young G.K and Sang J.L 2001 Optimization of fermentation condittion for the production of bacterial cellulose by a Appl.Biochem 331-5 (printed in Great Britain) 59 [...]... tuyn chn chng vi khun Acetobacter xylinum cho mng mng [5] Mc ớch nghiờn cu l tuyn chn c nhng chng vi khun Acetobacter xylinum cho mng mng, dai ch to mng sinh hc dựng cho tr bng v dựng p mt n dng da cho ph n Do vy tuyn chn chng vi khun Acetobacter xylinum thụng qua cỏc ch tiờu sau: 23 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên - Kớch thc v hỡnh dng t bo qua nhum Gram - Kim tra cỏc c tớnh sinh húa - Quan sỏt... nghiờn cu v c trng nuụi cy sinh húa ca vi khun Acetobacter v a ra kt lun khụng cú s phõn loi ng nht vi khun Acetobacter Nhng nghiờn cu c im v s phõn loi vi khun Acetobacter ny ó to c s cho nhng nghiờn cu tip theo ng thi l c s cho vic ng dng cỏc chng vi khun ny vo thc tin i sng Hin nay, ngi ta ó s dng vi khun gim mt cỏch rng rói trờn quy mụ cụng nghip to ra nhiu sn phm cú ý ngha 11 Khóa luận tốt nghiệp Phạm... nhy cú cha cellulose in hỡnh l Acetobacter rancenss, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizgianus - Loi 2 : khụng cú kh nng oxy húa axit axetic + To sc t trờn mụi trng glucoz: Sc t nõu n en nht: Acetobacter melanogeus Sc t hng: Acetobacter zancens + Khụng to sc t: Nhit thớch hp nht l gia 30oCn 35oC: Acetobacter Suboxy dans Nhit thớch hp nht l gia 18oCn 21oC: Acetobacter oxydans Nm 1960, Shilwel... biiotin, nicotinamidu cú vai trũ quan trng trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca vi khun Acetobacter 14 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Mt s vi khun Acetobacter (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti) cú kh nng t tng hp cỏc polisaccarit phõn t ln nh cellulose, dextran in hỡnh l vi khun Acetobacter xylinum cú th tng hp c nhng si cellulose ging nh nhng si bụng 1.3.4 Con ng chuyn húa cacbon Nghiờn... ca mt s chng vi khun Acetobacter STT 1 2 3 4 5 6 Tờn chng N1 N2 N3 N4 N5 N6 Lng axit to thnh (P%) 2,24 2,36 2,38 2,42 2,47 2,59 Axit axetic (%) 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N: Nhúm vi khun Acetobacter Hỡnh 3.2 th biu din hm lng axit axetic ca mt s chng vi khun Acetobacter 34 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Cỏc chng la chn u thuc ging Acetobacter vỡ u cú kh nng sinh axit axetic trong... Quyên 1.3 c im chung ca vi khun Acetobacter Vi khun Acetobacter l tỏc nhõn chớnh ca quỏ trỡnh lờn men axit axetic Da vo c im i chiu vi cỏc tiờu chun phõn loi hc thy rng chỳng thuc vo hai ging: - Vi khun Acetobacter cú chu mao hoc khụng cú chu mao - Glucono bacter n mao Theo Bergey 1989 v Larpent et al 1990 Acetobacter v Gluconobacter l 2 ging vi khun axetic quan trng nht ca h Acetobacteriacae Hai ging vi... gluconic t dextroza, nhit thớch hp cho s phỏt trin l 30oC-35oC 1.4.6 Acetobacter orleanense Trc khun di va phi, khụng di ng, khi gp nhit cao cú th sinh ra cỏc t bo d hỡnh: t bo kộo di hay phỡnh to hn Cú kh nng phỏt trin c trờn mụi trng cú nng ru cao t 10%- 12% v tớch ly c 9,5% axit axetic, nhit thớch hp 25oC- 30oC 16 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên 1.4.7 Acetobacter plancatum Trc khun kớch... trin 30oC 17 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên CHNG 2 I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 i tng nghiờn cu i tng nghiờn cu l cỏc chng vi sinh vt thun khit c phõn lp mng cỏc ngun nguyờn liu nh quỏ trỡnh lờn men gim t: bia, ru vang, dch hoa qu T cỏc chng ny chỳng tụi ó tin hnh tuyn chn ra c mt chng vi khun cú kh nng cho mng mng nht: chng Acetobacter xylinum N1, sau ú ti u iu kin nuụi cy cho vi khun ny,... khun Acetobacter to nờn do dai, tớnh n hi tt v chc khe ca mng Cú nhng loi mng li rt mng, d v, khụng nhn hoc nhn nheo, bỏm theo thnh bỡnh, dch nuụi cy thng c cú mu vng nõu, khụng trong, khụng cú mựi thm d chu, t nhng quan sỏt v khun lc v cỏc loi mng trờn cng gúp phn s b nh loi cỏc loi ca vi khun Acetobacter 1.3.3 Nhu cu dinh dng ca vi khun Acetobacter Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin vi khun Acetobacter. .. Wilson l phng phỏp dn dt cỏc yu t n vựng ti u húa khi cỏc bin s thay i cựng mt lỳc Phng phỏp ny cho phộp xỏc nh iu kin nuụi cy thớch hp cho quỏ trỡnh lờn men axetic, s phỏt trin ca vi khun Acetobacter xylinum ng thi to mng sinh hc Phng phỏp ny gm 2 bc: 2.3.7.1 Thit lp mụ hỡnh toỏn hc Thit lp mụ hỡnh toỏn hc cho phộp thy c mi liờn h gia hm liờn tc vi cỏc kin thc di dng mt ng mc Mt ng mc cú th c biu din ... kin nuụi cy cho chng Acetobacter xylinum, ch to mng sinh hc Mc tiờu nghiờn cu: Phõn lp vi khun Acetobacter t cỏc ngun vt liu khỏc Tuyn chn chng vi khun Acetobacter xylinum cho mng sinh hc t yờu... cú vai trũ quan trng quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca vi khun Acetobacter 14 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Mt s vi khun Acetobacter (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti) cú kh nng t... vi khun Acetobacter xylinum cho mng mng [5] Mc ớch nghiờn cu l tuyn chn c nhng chng vi khun Acetobacter xylinum cho mng mng, dai ch to mng sinh hc dựng cho tr bng v dựng p mt n dng da cho ph