trường đại học sư phạm hà nội ii khoa sinh ktnn ********** đào thị nữ Tuyển chọn, tối ưu hóa môi trường điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học khóa luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Vi sinh học Hà Nội - 2008 LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành đề tài này, em nhận giúp đỡ bảo tận tình thầy giáo tổ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2, giúp đỡ động viên gia đình, bạn bè Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Khắc Thanh PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung thầy cô người cung cấp cho em kiến thức, hướng trình nghiên cứu Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, cô không hướng dẫn bảo em cách tận tình mà cịn cung cấp cho em tài liệu giá trị để em có hướng đắn q trình nghiên cứu, hoàn thành đề tài Đồng thời em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy giáo, anh chị phịng Vi sinh Khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện tốt nhất, không sở vật chất mà cịn động viên, khuyến khích em hồn thành đề tài Do thời gian nghiên cứu hạn chế, đề tài em không tránh khỏi sai sót, mong đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2008 Sinh viên thực Đào Thị Nữ K30 B Sinh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan viết luận văn thật Tất số liệu thu thập từ thực nghiệm qua sử lí thống kê, hồn tồn khơng có số liệu chép, bịa đặt không trùng với tài liệu nào.Trong đề tài tơi có trích dẫn số dẫn liệu số tác giả khác Tơi xin phép tác giả trích dẫn để bổ sung cho khố luận MỤC LỤC Danh mục hình bảng biểu ĐẶT VẤN ĐỀ NỘI DUNG Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter 1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.3 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 10 Chương 2: Nguyên liệu phương pháp 17 2.1 Nguyên liệu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp vi sinh 19 2.2.2 Phương pháp toán học 25 2.2.3 Phương pháp tạo chế phẩm màng sinh học cellulose từ A.xylinum 30 Chương 3: Kết nghiên cứu 33 3.1 Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter từ số nguồn nguyên liệu 33 3.2 Tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum khiết 34 3.3 Quan sát hình dạng tế bào kính hiển vi quang học 38 3.4 Nghiên cứu động thái phát triển chủng A.xylinum D13 41 3.5 Khảo sát thay đổi pH môi trường nuôi cấy D13 45 3.6 Khảo sát khả tạo màng D13 môi trường ni cấy khác 46 3.7 Tối ưu hố khả tạo màng chủng A.xylinum D13 48 3.8 Xử lý màng BC bước đầu dùng màng để đắp lên vết thương hở thỏ 59 KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU HÌNH Hình 3.1 Đồ thị diễn hàm lượng axit axetic số chủng Acetobacter Hình 3.2 Ảnh khuẩn lạc chủng Acetobacter xylinum D13 Hình 3.3 Vịng phân giải CaCO3 chủng D13 Hình 3.4 Màng BC chủng D13 Hình 3.5 Tế bào D13 nhuộm Gram Hình 3.6 Tế bào D13 nhuộm I2 H2SO4 Hình 3.7 Đồ thị tương quan số lượng tế bào chủng D13 với giá trị OD610 Hình 3.8 Đồ thị sinh trưởng chủng D13 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn thay đổi hàm lượng axit axetic dịch nuôi cấy theo thời gian chủng D13 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương thỏ Hình 3.11 Tiến trình lành vết thương thỏ BẢNG Bảng 1.1 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter Gluconobacter Bảng 3.1 Hàm lượng axit axetic số chủng Acetobacter Bảng 3.2 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Bảng 3.3 Thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào, giá trị OD610 chủng D13 Bảng 3.4 Khảo sát khả tạo màng môi trường khác Bảng 3.5 Các yếu tố mức khảo sát chủng D13 Bảng 3.6 Ma trận thực nghiệm chủng D13 Bảng 3.7 Mơ hình thực nghiệm chủng D13 Bảng 3.8 Lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy chủng D13 Bảng 3.9 Các yếu tố mức khảo sát Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm chủng D13 Bảng 3.11 Mơ hình thực nghiệm chủng D13 Bảng 3.12 Lược đồ tối ưu hố mơi trường ni cấy chủng D13 Bảng 3.13 Các bước xử lý màng BC Bảng 3.14 Kết theo dõi tình trạng vết thương thỏ thí nghiệm ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tự nhiên thực vật có khả tổng hợp màng cellulose cịn có nhiều lồi vi khuẩn có khả sản sinh màng cellulose gọi màng sinh học hay Bacterial Cellulose (BC), đặc biệt lồi Acetobacter điển hình chủng Acetobacter xylinum Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum môi trường dịch lỏng, điều kiện nuôi cấy tĩnh hình thành nên lớp màng, màng có chất cellulose liên kết với tế bào vi khuẩn [1] Do vậy, màng BC vừa có cấu trúc đặc tính học giống với cellulose thực vật có thêm số tính chất hoá lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả thấm hút nước nhanh, khả polymer hố lớn [12] [13] Màng BC có nhiều đặc tính hố lý ưu việt nên xem nguồn polymer sinh học ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau: ngành công nghiệp thực phẩm sản xuất thạch dừa, nguyên liệu tốt công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao, làm mơi trường phân tách cho q trình xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho sợi pin tế bào lượng, sử dụng nhân tố để biến đổi độ nhớt, làm sợi truyền quang, môi trường chất sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí, làm màng nối mạch máu màng thẩm tách [11] [17]… Các nhà khoa học nghiên cứu tính đặc biệt như: bám bề mặt nước bốc hơi, không cho nước lỏng thấm qua lại cho nước di chuyển, có khả ngăn cản vi khuẩn, thay da tạm thời Vì vậy, màng BC coi nguyên liệu y học dùng để làm da nhân tạo [12] Bỏng tai nạn thường gặp lao động sinh hoạt hàng ngày Ngoài làm tổn thương da, trường hợp bỏng nặng cịn gây rối loạn nội tạng, để lại di chứng đến khả vận động, thẩm mỹ sức khoẻ người bệnh Ở Việt Nam riêng viện bỏng Quốc gia (Hà Nội) năm tiếp nhận khoảng 400 ca bỏng Hiện nay, nguời ta có nhiều dược phẩm dùng để điều trị bỏng như: Madecassol, Polymethan hay chế phẩm sinh học như: màng da ếch, màng ối, da lợn chứng minh có hiệu tốt [7] [8] Nhưng sử dụng chế phẩm có hạn chế như: thời gian điều trị dài ngày, chi phí cao, không ngăn xâm nhập vi khuẩn, gây đau rát sử dụng … Mặt khác từ lâu lịch sử y học, người ta sử dụng dầu mù u vào việc săn sóc bảo vệ da chống lại tác nhân gây tổn hại, có tác dụng mạnh điều trị đau dây thần kinh, đau khớp xương; thuốc kháng viêm đắp chỗ có hiệu quả; định rộng rãi cho vùng viêm tấy có vết thương; thuốc đắp tuyệt hảo chữa vết bỏng kích thích mơ hạt mọc nhanh, tạo sẹo da mềm mại Dầu mù u sử dụng rộng rãi điều trị bệnh da [18] [19] Trên sở nghiên cứu dầu mù u màng BC có trước đó, với mong muốn tìm hiểu thêm tác dụng màng BC - dầu mù u tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn, tối ưu hố mơi trường điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học” NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter [1] Từ lâu lịch sử, người biết cách làm giấm kinh nghiệm thực tiễn họ chưa hiểu rõ sở trình tạo giấm, khơng thể giải thích cách mà từ rượu lỗng lại chuyển thành giấm Cho đến khoa học phát triển, đặc biệt với đời kính hiển vi, giới vi sinh vật khám phá việc giải thích sở q trình lên men giấm trở nên đơn giản Ngày nay, khẳng định tác nhân trình sản xuất giấm ăn vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn axetic, vi khuẩn giấm) Những cơng trình nghiên cứu vi khuẩn axetic vào năm 1822 Person Ông nghiên cứu lớp màng mỏng phát triển bề mặt dịch giấm, sau tiến hành phân lập thu loại vi sinh vật tên Mycoderma aceti Đến năm 1837, Kiitzing làm thí nghiệm cách loại bỏ hết vi sinh vật bình giấm giấm khơng tạo thành Ơng đến kết luận: q trình lên men giấm thiết phải có vi sinh vật Cùng năm 1837, nhà bác học tiếng người Đan Mạch Hansen tách từ màng giấm loại vi khuẩn giấm khiết là: Mycoderma aceti Mycoderma pasteurinanum Những năm 1862 - 1868, Pasteur với trợ giúp đắc lực kính hiển vi, ông chứng minh nhận xét Kiitzing Hansen hoàn toàn đắn Pasteur nghiên cứu màng xuất bia, rượu vang khẳng định: màng tạo thành loại trực khuẩn mà ông gọi tên Mycoderma aceti Cùng với nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter, nghiên cứu sau nhằm tìm hiểu rõ thêm cải thiện trình lên men giấm Hiện nay, người ta vào ứng dụng vi khuẩn Acetobacter cách phân lập chủng vi khuẩn khiết, nghiên cứu đặc điểm cấu tạo sinh lý, sinh hố nhằm tìm chủng tốt cho ứng dụng, sở đối chiếu với tiêu chuẩn phân loại đưa 1.2 Phân loại Acetobacter [1] 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter Để phân loại Acetobacter, tác giả dựa vào tiêu chuẩn sau đây: - Địa điểm phân lập: có liên quan đến điều kiện mơi trường sống - Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất, màu sắc … đặc điểm khuẩn lạc môi trường thạch Khi nuôi cấy môi trường lỏng ý biến đổi môi trường sau thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay khơng mùi, màu sắc môi trường vàng nâu hay vàng nhạt …) - Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, khả di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy, màu sắc tế bào nhuộm Gram - Các đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với yếu tố nhiệt độ, pH môi trường, khả hình thành sắc tố, quan hệ với oxi, khả lên men axetic, khả sử dụng hợp chất hữu vơ Ngồi tiêu chuẩn trên, ngày định loại Acetobacter tác giả sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN16S 1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter thực từ kỷ XIX Năm 1898 Rothenback tiến hành phân loại, Hoyer (1899), Hansen ( 1911), Heneberg (1926), Janike (1931), Vanghn (1948), Ta có: FTT < FB = 4,78 Như mơ hình: ~ ~ ~ y  3,237  0,529X  0,74X  0,29X hồn tồn thích ứng Từ mơ hình chúng tơi thấy: Các yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả tạo màng chủng vi khuẩn D13 Khối lượng màng tăng lên pH tăng, thời gian nuôi cấy tăng Do vậy, đạt hàm mục tiêu y Trong yếu tố pH có ảnh hưởng mạnh đến khả tạo màng * Tìm điều kiện tối ưu Tìm giá trị: bi  i b11  0,529 x1,5  0, 794 b22  0, 74 x0,5  0,37 b33  0, 29 x1,5  0, 435 Như Max bi  i = b  = 0,794 Vậy pH ảnh hưởng lớn đến khả tạo màng chọn pH biến sở Chọn:  x cs   x  ,  x1  b11 0, 794  xcs  x 0,  1, 07 bcs cs 0, 37  x3  0, 59 Theo thiết lập bảng ma trận với lược đồ tối ưu hoá sau: Bảng 3.8 Lược đồ tối ưu hố điều kiện ni cấy chủng D13 Nhiệt độ (0C) 29,0 4,5 Thời gian (ngày) 4,5 3,420 3,871 4,067 3,786 30,07 3,91 3,375 3,401 3,396 3,391 31,14 5,5 3,32 3,052 3,471 2,901 3,141 32,21 2,73 3,016 2,978 2,489 2,908 N pH Khối lượng màng thu (g/l) y y1 y2 y3 Do yêu cầu tuyển chọn màng BC có độ mỏng vừa phải (0,5 - mm) dùng để chế tạo màng sinh học, kết hợp với nghiên cứu phần khảo sát khả tạo màng môi trường khác rút kết luận: khối lượng màng đạt khoảng 3,4g/1l môi trường thích hợp đảm bảo màng BC có đủ độ mỏng mong muốn Mặt khác theo nghiên cứu [15], ni cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum có thơng khí cho khối lượng màng BC 7,72g/l mơi trường; theo [14] nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum sp.9 điều kiện ni cấy lắc chủng phát triển tốt 300C, pH tốt 6,5 sau ngày ni cấy thu màng có khối lượng 3,8g/l môi trường So sánh với kết nghiên cứu chúng tơi sau tối ưu hố khối lượng màng (3,391g/l), thời gian thu hoạch màng BC (3,91 ngày) giảm hẳn - thuận lợi để sản xuất màng BC quy mô lớn, đem lại lợi ích kinh tế cao Như vậy, chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi cấy môi trường số điều kiện t0 = 30,070C; pH = thời gian nuôi cấy 3,91 ngày cho màng BC tốt với khối lượng 3,391 g/l 3.5.2 Tối ưu hố mơi trường ni cấy chủng A xylinum D13 Các yếu tố cố định bao gồm: nhiệt độ, pH, thời gian ni cấy; số chất có môi trường KH2PO4, MgSO4.7H2O, cao nấm men, hàm lượng giống ban đầu, hàm lượng rượu etylic, axit axetic bổ sung vào môi trường sau khử Các yếu tố thay đổi: hàm lượng đường glucozơ (x1); hàm lượng pepton (x2); hàm lượng (NH4)2SO4 (x3) Chỉ tiêu đạt hàm mục tiêu y (với y khối lượng màng đạt 3,4g/1l) Dựa vào nghiên cứu trước sơ xác định khoảng có ý nghĩa biến x1, x2, x3 trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Các yếu tố mức khảo sát Mức thấp (-) Hàm lượng đường (x1; g) 18 Hàm lượng pepton (x2; g) (NH4)2SO4 ( x3, g) 2,5 Mức sở (0) 20 Mức cao (+) 22 3,5 Khoảng biến thiên  2 0,5 Các yếu tố khảo sát * Mơ hình tốn học cần thiết lập có dạng: ~ ~ ~ y  b  b1X1  b X  b X * Thiết lập ma trận theo “yếu tố đầy đủ” Ma trận thực nghiệm với n = 3, số thí nghiệm N = 23 = Kết thực nghiệm trình bày bảng sau: Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm chủng D13 N x x Khối lượng màng thu (g) x x1 x2 x3 Y1 y2 y3 y S 2j + + + 22 3,5 4,257 4,710 4,932 4,633 0,146 + + - 22 2,5 4,312 4,168 4,570 4,350 0,048 + - + 22 3,5 3,981 3,507 3,169 3,552 0,176 + - - 22 2,5 2,966 3,019 2,876 2,954 0,059 - + + 18 3,5 2,496 2,850 2,610 2,652 0,040 - + - 18 2,5 3,419 2,206 2,980 2,840 0,381 - - + 18 3,5 2,980 2,487 2,145 2,537 0,188 - - - 18 2,5 1,908 2,090 2,090 2,055 0,024 * Kiểm tra hội tụ số liệu theo tiêu chuẩn Cochran G TT  0,381  0,359 < GB = 0,516 1,062 Như sai số hội tụ hay thí nghiệm đo với độ xác Chúng tơi tính hệ số phương trình hồi quy: b0  3,2; b1 = 0,598; b2 = 0,344; b3 = -0,482; Mơ hình tốn học thiết lập là: ~ ~ ~ y = 3,2  0,589X  0,344 X  0,482X * Kiểm tra có nghĩa hệ số thuộc mơ hình theo tiêu chuẩn Student Hệ số phương trình hồi quy có nghĩa bi  Sb t (với N = 8, f = N (k - 1) = 16) Tra bảng phân phối Student tìm f = 2,12, với   0,05 Chúng tơi tính được: S 2y  0,133 ; S 2y  0,044 ; S b  0,1 Ta có với i = 1, 2, thu bi  Sb t = 0,113 x 2,12 = 0,23 Như vậy, hệ số phương trình hồi quy có nghĩa * Kiểm tra thích ứng mơ hình qua bảng sau: Bảng 3.11 Mơ hình thí nghiệm chủng D13 Khối lượng màng (g/l) N Mơ hình y TT 3,2 + 0,589 + 0,344 - 0,482 3,2 + 0,589 + 0,344 + 0,482 3,2 + 0,589 - 0.344 - 0,482 3,2 + 0,589 - 0,344 + 0,482 3,2 - 0,589 + 0,344 - 0,482 3,2 - 0,589 +0,344 + 0,482 3,2 - 0,589 -0,344 - 0,482 3,2 - 0,589 - 0,344 + 0,482 Mặt khác 3,651 4,615 2,963 3,927 2,473 3,437 1,785 2,749 yTN 3,810 4,308 2,702 3,806 2,816 3,109 1,980 2,550 ( y TT - yTN )2 0,025 0,094 0,068 0,015 0,118 0,108 0,038 0,040 S 2TU  0,127 FTT  2,875 Ta có FTT < FB Như mơ hình ~ ~ ~ y = 3,2  0,589X  0,344 X  0,482X hồn tồn thích ứng Qua mơ hình chúng tơi nhận thấy yếu tố thay đổi là: hàm lượng đường glucozơ, hàm lượng pepton hàm lượng (NH4)SO4 có ảnh hưởng đến khả tạo màng Trong yếu tố ảnh hưởng hàm lượng đường quan trọng chúng tơi gọi yếu tố sở Lần lượt tính giá trị b1x1 ; b x ; b3 x b11  0, 589 x  1,178 b2   0, 344 x  0, 688 b3     0, 482  x 0,  0, 241 Từ chọn hàm lượng đường làm biến sở ( x ) x cs  x  1,5 x  0,876 x  0,308 Dựa vào giá trị xây dựng bảng ma trận với lược đồ tối ưu hố mơi trường ni cấy chủng D13 Bảng 3.12 Lược đồ tối ưu hoá môi trường nuôi cấy chủng D13 Khối lượng màng (g/l) Hàm lượng Hàm (NH4)2SO4 đường lượng (g) glucose (g) pepton (g) 20 y1 y2 3,281 3,046 2,967 3,101 18,5 6,876 3,308 3,167 3,598 3,405 3,390 17 7,752 3,616 2,619 2,819 3,010 2,816 15,5 8,628 3,942 2,912 2,509 2,709 2,710 N y3 y Qua bảng thấy: để đạt hàm mục tiêu y, thí nghiệm với hàm lượng đường = 18,5 (g); hàm lượng pepton = 6,876 (g); hàm lượng (NH4)2SO4 = 3,308 (g) thích hợp cho khối lượng màng trung bình 3,390 (g) Kết phù hợp với yêu cầu tạo màng mỏng, dai Như vậy, qua phần tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy hàm lượng giống bổ sung ban đầu chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum để lên men tạo màng BC Chúng bước đầu thu số kết sau: Về điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ = 30,070C; pH = 5,0; thời gian tạo màng 3,91 ngày Về môi trường nuôi cấy là: hàm lượng đường glucozơ = 18,5 (g); pepton = 6,876 (g); hàm lượng (NH4)2SO4 = 3,308 (g) 3.8 Xử lý màng BC, bước đầu dùng để đắp lên vết thương hở thỏ 3.8.1 Kết trình lên men tạo chế phẩm Sau tìm mơi trường dinh dưỡng điều kiện tối ưu, nuôi cấy, thu hoạch lượng lớn màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum D13 với độ dày, mỏng (từ 0,5 – mm) diện tích khác nhau, chế tạo màng BC dùng đắp lên vết thương thỏ Chúng sử dụng động vật thí nghiệm để thay da tạm thời thỏ nhà khoẻ mạnh trọng lượng từ 1,4 – 1,6 kg, gây vết thương thỏ cách cắt 4cm2 da thỏ vị trí Màng BC dùng đắp lên vết thương có đường kính cm, nặng gam, dày 0,5 mm tẩm với g dầu mù u Dầu mù u có chứa nhóm lipid bản: lipid trung tính, glycolipid, phospholipid; axxit béo calophylic; chất kháng sinh mang vòng lactone chất kháng viêm calophyllolide Ngồi cịn chất kháng viêm coumarine tạo nên hoạt tính bảo vệ sức khoẻ Dầu mù u có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, đặc tính làm liền sẹo, kích thích mơ hạt mọc nhanh Do sử dụng rộng rãi điều trị bệnh lý da, định rộng rãi cho vùng viêm tấy có vết thương thuốc đắp tuyệt hảo chữa vết thương bỏng [18] [19] Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy qua bước xử lí sau Bảng 3.13 Các bước xử lý màng BC Các bước Cách xử lý Rửa nước máy lần Kết Loại bỏ bớt axit axetic Đun với NaOH 3% 1000C Màu sắc màng vàng sậm thời gian 30 phút Mùi khét Trung hoà nước chanh Màu sắc màng từ vàng loãng (axit citric) sậm chuyển thành màu trắng Ngâm với NaOH 3% nhiệt độ Màng BC trắng trong, khơng phịng 12 giờ, lặp lại lần mùi đạt cảm quan Trung hoà lại nước chanh Màng BC trắng lỗng Màng BC sau xử lý có đặc điểm sau: trắng trong, dễ quan sát tình trạng vết thương, ngăn không cho vi khuẩn xâm nhập, che kín vết thương, hút dịch rỉ vết thương, làm mát vết thương, thay màng thường xuyên mà không gây đau rát cho vết thương Chế phẩm có khả thấm nước cao, khả kết dính chặt chẽ trơ mặt hố học nên có vai trị màng sinh học thay da tạm thời Theo [8], người ta dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che vết thương sớm Qua rút ngắn thời điều trị giảm thiểu sẹo xấu vùng bỏng sâu Màng sinh học tẩm dầu mù u với hoạt chất tái sinh mô chất kháng khuẩn tự nhiên, khơng có yếu tố lây lan mầm bệnh, khơng giải phóng chất độc vào vết thương Màng BC có khả diệt 100% vi khuẩn thường gây nhiễm trùng vết thương hở vết bỏng, hay vết thương [7] [19] Chỉ cần áp sát màng vào vết thương mà không cần sử dụng thứ khác, màng có khả ngăn cản vi khuẩn, đồng thời làm vết thương mau lành thúc đẩy q trình tái tạo mơ hạt Đặc biệt, sản phẩm màng thay hàng ngày khả làm mát bề mặt da dính chặt vết thương nên màng dễ bong Đồng thời màng không gây đau loại màng sử dụng gạc vô trùng hay băng bán thấm 3.8.2 Bước đầu ứng dụng chế phẩm BC vào trị bỏng thỏ Sau tạo chế phẩm sinh học từ màng BC dầu mù u, chúng tơi tiến hành thí nghiệm thử tác dụng chế phẩm BC Chúng tơi tiến hành thí nghiệm thỏ chia thành lô sau: Lơ 1: Đắp màng BC có tẩm dầu mù u Lơ 2: Đắp gạc y tế có tầm dầu mù u Lô 3: Chỉ bôi dầu mù u Lô 4: Để vết thương tự lành (lơ đối chứng) Sau theo dõi tình trạng vết thương xem có nhiễm trùng hay không, để đánh giá tỉ lệ lành vết thương, tiến hành đo diện tích vết thương cịn lại theo thời gian Kết dẫn bảng sau: Bảng 3.14 Bảng kết theo dõi tình trạng vết thương thỏ thí nghiệm (cm2) Ngày 12 15 3,36 2,98 2,36 0,81 0,41 3,79 3,25 2,97 1,64 1,42 3,64 3,18 2,85 1,46 1,24 4 3,84 3,54 3,12 2,01 2,01 Lô Tỷ lệ lành vết thương (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Lô Lô Lô Lô 12 15 Ngày Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương thỏ Theo nghiên cứu trước [8], sử dụng màng BC tẩm dầu mù u điều trị bỏng cấp thỏ so với việc sử dụng chế phẩm y học khác màng BC có tẩm dầu mù u chữa lành vết bỏng độ nhanh (sau 22 ngày tỉ lệ vết thương lành 99,3%) Qua kết thực nghiệm nhận thấy, lô điều trị màng BC tầm dầu mù u, thời gian lành vết thương nhanh (89,75%), kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu có Qua thực nghiệm nhận thấy màng BC tẩm dầu mù u đắp lên vết thương hở thỏ giúp ngăn cản vi sinh vật bên xâm nhập vào vết thương, màng BC không gây đau rát, dễ thay hàng ngày làm cho vết thương chóng lành Đây hướng nghiên cứu ứng dụng có giá trị, chúng tơi mong muốn thử nghiệm người sản xuất quy mô lớn màng BC làm chế phẩm dùng y học Như vậy, màng BC tẩm dầu mù u giúp vết thương mau lành sau 15 ngày điều trị tỉ lệ lành 89,75% Sau số hình ảnh tiến trình lành vết thương a) Vết thương sử dụng thí nghiệm b) Sau ngày dùng chế phẩm BC c) Sau 15 ngày dùng chế phẩm BC d) Lô đối chứng sau 15 ngày Hình 3.11 Tiến trình lành vết thương thỏ thí nghiệm KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu phân lập chủng Acetobacter xylinum từ nguồn nguyên liệu bia, giấm, rượu vang, dịch hoa Từ chúng tơi chọn chủng A.xylinum D13 cho màng tốt phù hợp với yêu cầu chọn màng mỏng, dai, độ đàn hồi tốt Chúng nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố; nghiên cứu động thái sinh trưởng chủng D13; nghiên cứu khả tạo màng chủng D13 từ chọn lọc môi trường số môi trường cho màng mỏng, màng dai thích hợp cho nghiên cứu Đồng thời tối ưu hố điều kiện mơi trường ni cấy (trên MT4) thích hợp cho chủng D13 phát triển, chế tạo màng sinh học Trong chủng D13 phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 30,070C; pH 5,0; thời gian nuôi cấy 3,91 ngày; thành phần môi trường để thu màng tốt nhất, đảm bảo yêu cầu nghiên cứu có hàm lượng đường 18,5; hàm lượng pepton 6,876; hàm lượng (NH4)2SO4 3,308 Xử lý sản phẩm trình lên men bước đầu ứng dụng việc trị bỏng thỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng cộng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, 2, 3, Nxb Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học (sách dịch), Nxb “Mir” Moskwa Nguyễn Thành Đạt (1990), Cơ sở vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Tập 2, tr 40 – 41 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 17 - 34 Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thy Thư (2004), Hoá sinh học, Nxb Đại học sư phạm, tr 94 Nguyễn Thuý Hương ( 2003), "Chọn lọc dịng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại mơi trường dùng sản xuất cellulse với quy mô lớn", Tạp chí di truyền học ứng dụng Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh ( 2006) "Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng", Tạp chí dựơc học số (361), tr 18 – 20 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh ( 2001) "Nghiên cứu tạo màng sinh học trị bỏng từ Acetobacter xylinum”, Y học thực hành số Đinh Thị Kim Nhung ( 1996), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng lên men theo phương pháp chìm, Luận án phó tiến sỹ khoa học 10 Lê Thế Trung (2000), Những điều cần biết bỏng, Nxb y học Hà Nội 11 Abbas Rezaee, sanaz Solimani and Mahdi foro Zandemogadam, (2005) "Role of Plasmid Foro zan demogadam, Role of Plasmid in production of Acetobacter xylinum biofilms", American Journal of Biochemistry and Biotechnology 1, p.121 - 125 12 Cazafa W, Young.D.J, Kawechi.M, Brow.R.M.Je, (2007) "The future prospects of microbial cellulose applications biomacromolecules", p.112 13 Diete Klem et al, (2001) "Bacterial synthesis cellulose aryical blood vessels for microsurgery", In Prog Polym Sci, p.1561 – 1603 14 Hai – Peng Cheng, Pei – Ming Wang, Jech – Weichen and Wen – Teng Wu, (2002) "Optimixation fermentation conditions for the production of bacterialcellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in Shaking cultures" Biotechnol.Appl.Bichem p.125 – 132 15 Hong - Joo son, Moon - SuHeo, Yong - GyunKim and Sang - Hoon Lee,(2001) "Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified ailift reactor" Biotechnol Appl Biochem, p.33 16 Kouda, T,H, Yano and F Yoshinaga, (1987) "Effect of agitator configuration on bacterial cellulose productiviy in aetated and agitated culture", p.371 - 376 17 Luiz F.X Farah, Curitibe, (1990) "Process for the preparaton of cellulose film, cellulose film producced thereby, Articial skin graft and its use" 18 Http: //www Frecpatientonline.com / 4788-146.html 19 Http://www.Vnexpress.net ... triển Acetobacter chịu ảnh hưởng yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy Vì lựa chọn mơi trường điều kiện ni cấy tối ưu cho trình sinh trưởng phát triển thu sinh khối tốt yêu cầu cần thiết Do điều kiện. .. cứu dầu mù u màng BC có trước đó, với mong muốn tìm hiểu thêm tác dụng màng BC - dầu mù u tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Tuyển chọn, tối ưu hoá môi trường điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter. .. quang học 38 3.4 Nghiên cứu động thái phát triển chủng A.xylinum D13 41 3.5 Khảo sát thay đổi pH môi trường nuôi cấy D13 45 3.6 Khảo sát khả tạo màng D13 môi trường nuôi cấy khác 46 3.7 Tối ưu hoá