Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Trường đại học sư phạm hà nội Khoa sinh - ktnn - Lô thị bảo khánh Phân lập, tuyển chọn tối ưu hóa môi trường dinh d­ìng cho chđng vi khn acetobacter xylinum h6, chÕ t¹o màng sinh học Khóa luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Vi sinh vật Hà nội 2008 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật MC LC Li cm n Bản cam đoan Mục lục Danh mục bảng hình Đặt vấn đề Nội dung Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter 1.2 Phân loại Acetobacter 1.2.1.Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn 1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter 1.3 Đặc điểm chung Acetobacter 11 1.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter 13 1.3.2 Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter môi trường lỏng 13 1.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng chủng Acetobacter 14 1.3.4 Con đường chuyển hoá Cacbon 14 1.3.5 Đặc điểm số loài vi khuẩn Acetobacter 15 1.4 Cơ sở khoa học trình lên men axetic 18 1.5 Các yếu tố điều kiện môi trường ảnh hưởng 19 1.6 Màng sinh học (Bacterial cellulose, Biocellulose – BC) 20 Chương Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 22 2.1 Đối tượng – hoá chất 22 2.1.1 Đối tượng 22 2.1.2 Thiết bị - hoá chất 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghµnh vi sinh vËt 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter 24 2.2.2 Tuyển chọn Acetobacetr cho màng 25 2.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter khiết 25 2.2.4 Phân biệt vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram 26 2.2.5 Phương pháp xác định khả tổng hợp axit 27 2.2.6 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn 28 2.2.7 Phương pháp tuyển chọn chủng 28 2.2.8 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn 29 2.2.9 Phương pháp quy hoạch hoá toán học thực nghiệm 29 2.2.10 Phương pháp tạo vết thương thỏ 33 Chương Kết thảo luận 35 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter 35 3.2 Nghiên cứu số đặc tính hình thái 39 3.2.1 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum 39 3.2.2 Khảo sát khả tạo axit axetic vi khuẩn 39 3.2.3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng 42 3.2.4 Khảo sát khả tạo màng vi khuẩn A.xylinum 43 3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển A xylinum H6 47 3.4 Tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn H6 51 3.4.1 Thiết lập mơ hình tốn học 52 3.4.2 Tối ưu hoá 56 3.5 Bước đầu dùng màng BC trị bỏng thỏ 58 Chương Kết luận kiến nghị 62 4.1 Kết luận 62 4.2 Kiến nghị 62 Tài liệu tham kho 63 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Bảng: Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt, so sánh Acetobacter……………… 12 Bảng 2.1 Thành phần môi trường………………………………………… 23 Bảng 2.2 Cách sử lý màng……………………………………………… 34 Bảng 3.1 Quan sát thời gian dặc điểm màng tạo thành…………………… 37 Bảng 3.2 Hàm lượng axit axetic số chủng…………………………40 Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hoá chủng vi khuẩn A xylinum…………… 42 Bảng 3.4 Khảo sát khả tạo màng vi khuẩn A xylinum………… 43 Bảng 3.5 Khảo sát khả tạo màng H6…………………………… 45 Bảng 3.6 Tương quan nồng độ pha lỗng……………………… 48 Bảng 3.7 Thời gian ni cấy hàm lượng tế bào………………………… 49 Bảng 3.8 Các yếu tố mức khảo sát………………………………………53 Bảng 3.9 Ma trận thực nhiệm……………………………………………….54 Bảng 3.10 Kiểm tra thích ứng mơ hình…………………………… 56 Bảng 3.11 Tối ưu hố mơi trường……………………………………… 57 Bảng 3.12 Diện tích vết thương lại thực tế………………………59 Hình: Hình 1.1 Cơ chế q trình oxy hố rươụ etylic ……………………… 19 Hình 3.1 Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 1……………………38 Hình 3.2 Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 3……………………38 Hình 3.3 Tế bào chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 39 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic ……………………… 40 Hình 3.5 Vòng phân giải CaCO3 vi khuẩn Acetobacter xylinum 41 Hình 3.6 Màng mỏng, dịch ni cấy đục………………………………… 45 Hình 3.7 Màng mỏng, dịch ni cấy Lô Thị Bảo Khánh 45 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Hỡnh 3.8 Màng BC dày…………………………………………………… 46 Hình 3.9 Màng BC chủng H6 46 Hình 3.10 Đồ thị tương quan số lượng tế bào chủng H6 49 Hình 3.11 Đồ thị sinh trưởng phát triển chủng H6…………………… 50 H ình 3.12 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương 59 Hình 3.13 Vết thương sử dụng màng trị bỏng………………………………60 Hình 3.14.Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau ngày……… 60 Hình 3.15 Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 15 ngày………61 Hình 3.16 Vết thương không dùng màng BC, bôi dầu mù u sau 15 ngy 61 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, quốc gia giới cơng nghệ sinh học (CNSH) khơng nghành mẻ mà trở thành nghành kinh tế chủ đạo phát triển khoa học kĩ thuật công nghệ Là phận CNSH, công nghệ vi sinh ngày phát triển mạnh mẽ ngày có ứng dụng thiết thực vào sống Bằng việc ứng dụng trình lên men vi sinh vật tạo chế phẩm giúp tận dụng tiết kiệm chi phí việc giải nhiều vấn đề ví dụ nơng nghiệp, cơng nghiệp, bảo vệ môi trường Một chủng vi khuẩn sử dụng rộng rãi công nghệ lên men vi sinh vi khuẩn Acetobacter (còn gọi vi khuẩn giấm) Vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi cấy môi trường dịch lỏng, điều kiện nuôi cấy tĩnh hình thành lớp lớp màng bề mặt thống dung dịch, màng có chất cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter xylium Công thức cellulose vi khuẩn sản xuất giống cellulose tế bào thực vật có số tính chất ưu việt hơn: độ dẻo dai, độ bền học, khả polymer hố cao… Nhờ vào số đặc tính lý hoá vượt trội mà màng BC ngày coi nguồn polymer sinh học mới, nguồn nguyên liệu có tiềm Hiện nay, nhà khoa học tìm thêm số tính đặc biệt màng : bám vào bề mặt nước bốc lại di chuyyển qua, ngăn cản xâm nhập vi khuẩn… [7], [8] Nhờ mà màng BC ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau: công nghệ thực phẩm làm thạch dừa đồ ăn tráng miệng phổ biến, công nghệ sản xuất giấy chất lượng cao, y học làm màng thay cho da tạm thời bệnh nhân bỏng, loại màng siêu thm, khoa hc vt liu mi Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghµnh vi sinh vËt với việc sản xuất micro chất lượng cao, tác dụng bảo vệ môi trường sản xuất EM (Effective Micorgamisms) [11] Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sử dụng màng BC quan tâm thời gian gần thu kết bước đầu (dùng màng đắp lên vết thương hở, dùng màng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ) [7], [8] Việc nghiên cứu môi trường dinh dưỡng tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển, chế tạo màng sinh học quy mô công nghiệp hướng nghiên cứu nhiều tác giả quan tâm Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn, tìm mơi trường dinh dưỡng tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum ứng dụng hữu ích màng BC sở kế thừa kết thu tác giả nghiên cứu trước mà định chọn đề tài: “ Phân lập, tuyển chọn tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylinum H6, ch to mng sinh hc Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghµnh vi sinh vËt NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter ( vi khuẩn giấm) Giấm sản phẩm quen thuộc có từ lâu đời mà ngày sử dụng rộng rãi công nghiệp đời sống hàng ngày Từ xa xưa người biết làm giấm dựa vào kinh nghiệm thực tế mà họ chưa hiểu sở khoa học, khơng giải thích cách rượu lỗng biến thành giấm ăn Cho đến đầu kỉ XIX, khoa học kĩ thuật phát triển, đặc biệt với đời kính hiển vi, giới vi sinh vật dần khám phá Con người giải thích chế trình lên men tạo giấm (Vinnnegar) nhờ nhóm vi sinh vật mà ngày nhà khoa học gọi chúng vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic, vi khuẩn giấm [4], [5] Năm 1822, Person tiến hành nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu bề mặt bình sản xuất giấm Ơng khẳng định loại vi sinh vật, gọi Mycoderma aceti [7] Đến năm 1837, Kiitzing tiếp tục tìm hiểu sau loại bỏ hết vi sinh vật chum làm giấm thấy giấm khơng tạo thành Ơng đưa nhận xét: q trình lên men giấm thiết phải có vi sinh vật không không diễn chuyển hoá rượu thành giấm Cũng năm 1837, Hansen (người Đan Mạch) tách từ màng giấm hai loại vi khuẩn khiết là: Mycoderma aceti Mycoderma pastuerianum Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur với trợ giúp đắc lực kính hiển vi chứng minh đắn nhận xét Kiitzing, Hansen khẳng định chất trình lên men gim ễng tip tc tin hnh Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghµnh vi sinh vËt nghiên cứu lớp màng nhầy xuất bề mặt bia, rượu vang đưa đến kết luận: màng tạo thành loại trực khuẩn mà ông gọi tên Mycoderma aceti Cùng với nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter, nghiên cứu nghiên cứu sau nhằm mục đích tìm hiểu rõ thêm tìm cách cải thiện trình lên men giấm Từng bước nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Acetobacter cách phân lập chủng vi khuẩn khiết, nghiên cứu đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hố chúng để tìm chủng tốt cho ứng dụng dựa sở tiêu chuẩn phân loại đưa 1.2 Phân loại Acetobacter 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter Để phân loại vi khuẩn Acetobacter có mốt số tiêu chuẩn phân loại : + Đặc điểm phân lập: nơi cư trú có liên quan đến điều kiện mơi trường sống + Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, khả di động, vỏ nhầy, màu sắc tế bào nhuộm Gram… + Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính (trơn, xù xì…), tính chất (đục, trong…), màu sắc…của vết mọc (khuẩn lạc) môi trường thạch Khi nuôi cấy môi trường lỏng cần lưu ý đến biến đổi môi trường sau thời gian ni cấy (mơi trường đục hay trong, có mùi thơm hay khơng mùi, có màu vàng nâu hay vàng nhạt) + Đặc điểm sinh hoá (theo khoá phân loại Pasteur, 1950) - Khả tạo catalase - Khả tổng hợp xeto từ rượu bậc cao như: glyxerol, manitol, sorbitol - Khả oxi hoá axetat thnh CO2 v H2O Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vËt - Khả oxi hoá glucozơ thành axit gluconic - Khả sử dụng muối amon làm nguồn nitơ môi trường Hoyer sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon - Khả tạo sắc tố nâu - Khả tổng hợp cellulose Ngoài tiêu chuẩn trên, phân loại Acetobacter, tác giả sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN 16S 1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter Ngay từ kỷ XIX, tác giả tiến hành phân lập Acetobacter thành chủng khiết tiến hành phân loại chúng Trong đó, khóa phân loại Beijerinck (1899) thu hút quan tâm nhiều tác giả Ông chia vi khuẩn axetic thành nhóm Năm 1916 nghiên cứu Beijerinck, Janke phân loại vi khuẩn axetic thành nhóm dựa dấu hiệu sau: - Một là: khả sử dụng đạm amoni để thực trình sinh trưởng phát triển - Hai là: có hay khơng giai đoạn di động trình phát triển Dựa vào nơi sống đặc trưng vi khuẩn axetic mà năm 1926, Heneberg chia chúng thành nhóm khác nhau: - Nhóm 1: vi khuẩn khơng phát triển bia hoa hublon độc với chúng - Nhóm 2: vi khuẩn có khả phát triển bia - Nhóm 3: vi khuẩn phát triển dung dịch rượu vang - Nhóm 4: vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Năm 1934, theo nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, vi khuẩn axetic có khả sử dụng hợp chất tương đối đơn giản C N từ vi khuẩn axetic có tên vi khuẩn Acetobacter L« Thị Bảo Khánh 10 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Hỡnh 3.11 th sinh trưởng phát triển chủng H6 Dựa vào đồ thị ta thấy : + Từ – 24h : số lượng tế bào dịch nuôi cấy tăng lên mức độ tăng chậm Giai đoạn vi khuẩn làm quen với mơi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng lượng cho giai đoạn sinh trưởng Đây thời gian pha tiềm phát, chưa thấy màng xuất + Từ 24 – 48h : pha cấp số mũ (hay pha log) Ở pha số lượng tế bào tăng nhanh tốc độ sinh trưởng riêng chúng đạt cực đại, chưa thấy màng xuất + Từ 48 – 72h : pha cân động, biểu pha số lượng tế bào dịch nuôi cấy tương đối ổn định Có thể giải thích tượng số tế bào sinh số tế bào khác lại bị phân huỷ dẫn đến tổng số lượng tế bào quần thể dịch không đổi, giai đoạn thấy màng xuất + Từ 72h trở số lượng tế bào dịch nuôi cấy giảm mạnh, thời gian pha suy vong Ở giai đoạn số lng t bo cht nhiu Lô Thị Bảo Khánh 51 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vËt nguồn chất dinh dưỡng dần cạn kiệt, không đủ cung cấp cho tế bào sinh trưởng phát triển vi khuẩn không phân chia Động thái phát triển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 phù hợp với động thái phát triển vi sinh vật nói chung tác giả nhiên cứu từ trước [6], [7], [8] Như vậy: dựa vào động thái sinh trưởng chủng H6 thấy màng BC hình thành từ ngày thứ sau ổn định – ngày để thu màng tốt từ 72 – 96 h, ứng với pha cân 3.4 Tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 Cũng tất vi sinh vật có nhân nguyên thuỷ trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Acetobacter chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố môi trường ni cấy Có thể chia chúng thành: + Nhóm yếu tố thành phần môi trường dinh dưỡng nuôi cấy: glucozơ, pepton, (NH4)2SO4, CaHPO4 + Nhóm yếu tố điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, độ pH, thời gian ni cấy Do điều kiện hạn chế, chưa thể tiến hành nghiên cứu tất yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp màng BC chủng Acetobacter xylinum Trong phạm vi đề tài tơi sâu tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylinum H6, theo phương pháp quy hoạch hoá toán học thực nghiệm dựa sở nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển chúng Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung [9] môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Acetobacter từ nguồn: nguồn cug cấp C từ glucozơ, nguồn cug cấp N bao gồm: N vô (NH4)2SO4 N hữu pepton, cao nấm men , ngun cung cp P gm Lô Thị Bảo Khánh 52 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vËt CaHPO4, KH2PO4, nguồn cung cấp S từ MgSO4 Dựa vào thành phần mơi trưường sở (MT2) việc tạo màng định lựa chọn phương pháp Box – Wilson (phương háp độ dốc) đồng thời dẫn dắt yếu tố tới vùng tối ưu Mục đích trình tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 thu màng BC đạt yêu cầu : mỏng, dai, thời gian tạo màng ngắn ổn định… Từ áp dụng chế tạo màng sinh học quy mô công nghiệp đem lại lợi ích kinh tế có ý nghĩa lớn Do chúng tơi định tối ưu hố môi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylium H6 3.4.1 Thiêt lập mơ hình tốn học tối ưu hố mơi trường nuôi cấy Chúng tiến hành tối ưu hóa mơi trường với yếu tố là: Hàm lượng đường (Glucozơ), pepton, (NH4)2SO4 - Các yếu tố cố định: Các yếu tố điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy Các yếu tố môi trường dinh dưỡng : KH2PO4, MgSO4.7H2O,cao nấm men, rượu Hàm lượng giống ban đầu … - Các yếu tố thay đổi: Hàm lượng đường (Glucozơ) (x1) Pepton (x2) (NH4)2SO4 (x3) * Chỉ tiêu đạt hàm mục tiêu y với khối lượng màng tiêu chuẩn 3,4 (g) bình tam giác 250ml + Qua nghiên cứu thử nghiệm chúng tơi xác định khoảng có nghĩa biến số x1, x2, x3 bảng sau: (với khoảng bin thiờn = 2) Lô Thị Bảo Khánh 53 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vËt Bảng 3.8 Các yếu tố mức khảo sát Đường Pepton (NH4)2SO4 (x1, g) (x2, g) (x3, g) Mức thấp (-) 18 Mức sở (0) 20 Mức cao (+) 22 Các yếu tố khảo sát + Mơ hình tốn học cần thiết lập biểu diễn mối liên hệgiữa hàm mục tiêu với biến số có dạng: y  b0  b1~ x1  b2 ~ x2  b3 ~ x3 Trong đó: y: hàm mục tiêu (khối lượng màng) ~ x1 , ~ x2 , ~ x : biến mã yếu tố đường, pepton, (NH4)2SO4 b0, b1, b2, b3 : hệ số + Thiết lập ma trận theo phương pháp “thực nghiệm yếu tố đầy đủ”: Ma trận thực nghiệm với n=3, số thí nghiệm N= 23, kết thí nghiệm trình bày bng sau: Lô Thị Bảo Khánh 54 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Bng 3.9 Ma trận thực nghiệm Khối lượng màng tươi (g) N ~ x1 ~ x2 ~ x3 x2 + + + + + + x2 x3 y1 22 4,168 4,256 4,848 4,424 0,137 - 22 4,275 3,702 3,657 3,878 0,119 - + 22 3,472 2,532 2,982 2,964 0,179 + - - 22 3,056 2,765 2,624 2,815 0,049 - + + 18 3,210 3.914 3,512 3,545 0,125 - + - 18 3,128 3,416 2,945 3,163 0,056 - - + 18 2,253 2,761 2,534 2,516 0,065 - - - 18 2,156 1,917 2,245 2,109 0,029 y2 y3 S 2j y *) Kiểm tra hội tụ số liệu theo tiêu chuẩn Cochran S 2j max 0,179 GTT  N   0,236 GB  0,156 0,759 S j j 1 Trong GB tìm cách tra bảng chuẩn Cochran biết bậc tự f1= k-1 f2 =N=8 Như sai số hội tụ hay thí nghiệm đo độ xác *) Tính hệ số phương trình hồi quy: N b0 y j N b1 Lô Thị Bảo Khánh j 25,414  3,177 N ~ 4,121  yx1   0,515 N j 1 55 Líp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật s b2  b3  ,313  , 664 2, 405  ,3 Mơ hình toán học thiết lập là: y  3,177  ,515 ~ x1  ,664 ~ x  ,3 ~ x3 *) Kiểm tra có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student Hệ số mơ hình có nghĩa: bi  Sb t Với N= 8, f= N(k- 1) = 16 tra bảng phân phối Student tìm t= 2,12 với  = 0,05 Phân phối trung bình cho thí nghiệm: N Sy2  S j 1 j  N 0,759  0,095 Phân phối trung bình loại cho lần đo y S  Sy2 k  0,095  0,032 Phân phối mà cấc hệ số xác định Sb  Sy2 B  0,032  0,089 Với i = 1,2,3 ta có bi  Sb t  0,089.2,12  0,188 Như hệ số phương trình hồi quy xác định có nghĩa *) Kiểm tra thích ứng mơ hỡnh, ta cú bng sau: Lô Thị Bảo Khánh 56 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vËt Bảng 3.10 Bảng kiểm tra thích ứng mơ hình Khối lượng màng tươi (g) N Mơ hình yTT y TN y TT  yTN 3,177+0,515+0,644+0,3 4,576 4,424 0,023 3,177+0,515+0,644-0,3 4,036 3,878 0,025 3,177+0,515-0,644+0,3 3,348 2,964 0,147 3,177+0,515-0,644-0,3 2,748 2,815 0,004 3,177-0,515+0,644+0,3 3,606 3,545 0,004 3,177-0,515+0,644-0,3 3,006 3,163 0,025 3,177-0,515-0,644+0,3 2,318 2,515 0,039 3,177-0,515-0,644-0,3 1,718 2,109 0,153 STU  Ta có: 2 0,42   0,105 yTN  yTT  j N B  FTT  Như mơ hình:      0,105  3,281  F minS ; S  0,032 max S y2 ; STU y TU B  4,77 y  3,177  0,515~ x1  0.664~ x2  0,3~ x3 hồn tồn thích ứng Qua mơ hình ta thấy yếu tố: đường, pepton, (NH4)2SO4 ảnh hưởng đến khả tạo màng Trong yếu tố pepton yếu tố quan trọng 3.4.2 Tối ưu hố mơi trường ni cấy Tìm giá trị tuyệt đối bi i b11  0,515  1,03 b2   0,644.2  1,288 b3 0,3.2 0,6 Lô Thị Bảo Khánh 57 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghµnh vi sinh vËt Vậy : max b i  i  b   1, 288 Chọn lượng pepton biến sở ( xcs ) xcs  x2  x1  2,03  1,576 1,288 x3  0,6  0, 466 1, 288 Bảng 3.11 Tối ưu hóa mơi trường Đường Pepton SLGBĐ Khối lượng màng tươi (gam) N (gam) (gam) (ml) y1 y2 y3 y 16,848 2,068 4,012 4,645 3,704 4.12 18,424 2,534 3,258 3,463 3,395 3.372 20 3,024 2,769 3,207 21,576 3,466 3,145 3,929 3,864 3.646 23,152 3,832 4,254 4,650 4,012 4.244 Qua bảng ta thấy: để đạt hàm mục tiêu (ymax) thí nghiệm thích hợp thí nghiệm với lượng đường 18.424(g), pepton (g), (NH4)2SO4 2,534(g) Kết thu được giải thích sau: glucozơ tham gia vào trình chuyển hố , có vai trò hình thành tính dày mỏng màng BC Theo tác giả Hong – Joo Son, 2001 [12] sản xuất màng BC dày đưa vào môi trường 40 g đường glucozơ Theo để tạo màng mỏng bổ sung 18,424 hồn tồn phù hợp Với N có vai trò tham gia vào cấu trúc tế bào vi khuẩn Kết nghiên cứu khẳng định nguồn N hữu N vơ có ý nghĩa đối vơi việc tổng hợp tổng hợp cellulose chủng Acetobacter xylinum H6 Trong ú theo Hong Joo Son Lô Thị Bảo Khánh 58 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật [12] thỡ pepton c coi chất kích thích sinh trưởng Acetobacter Khi vi khuẩn sinh trưởng tốt trình trao đổi chất diễn mạng mẽ sản phẩm trao đổi chất – màng BC lớn Với mục đích chế tạo màng mỏng nên theo với lượng pepton = 5g (NH4)2SO4 = 3,466g phù hợp Như vậy: thành phần môi trường chứa hàm lượng đường 18,424 (g), pepton (g), (NH4)2SO4 2,534 gam làm môi trường dinh dưỡng chế tạo màng BC 3.5 Bước đầu dùng màng trị bỏng thỏ Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 lựa chọn từ trình nghiên cứu Qua việc khảo sát khả tạo màng chủng H6 môi trường khác nhau, định lựa chọn môi trường môi trường sở cho việc tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng H6 Tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng phù hợp nhằm mục đích chế tạo màng sinh học, bưóc đầu ứng dụng thực nghiệm Chúng tiến hành trình lên mên điều kiện thích hợp mơi trường dinh dưỡng tối ưu thu Sau ngày tiến hành thu màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6, nhân thấy màng thu đồng nhất, mỏng khoảng 0,8 – 1,2 mm Lượng màng thu tiến hành xử lý theo quy trình nghiên cứu khả trị bỏng đối tượng thử nghiệm thỏ nhằm thay da tạm thời Thỏ nhà khoẻ mạnh trọng lượng từ 1,4 – 1,6 kg gây bỏng cách cắt miếng da khoảng cm2, dùng màng thu có tẩm dầu mù u, đường kính khoảng 10cm đắp lên vết thương hở Dầu mù u chất sát khuẩn tốt Màng có đặc điểm sau: + Trắng trong, dễ quan sát tình trạng vết thương + Ngăn khơng cho vi khuẩn xâm nhập, che kín vết thng, hỳt cỏc dch r vt thng Lô Thị Bảo Khánh 59 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật + Lm mỏt vt thng, có tác dụng thay da tạm thời, thay màng thường xuyên mà không gây đau rát cho vết thương [8] Chúng tơi bố trí thành lơ thí nghiệm : + Lơ 1: đắp màng BC có tẩm dầu mù u lên vết bỏng + Lô 2: đắp gạc y tế có tẩm dầu mù u lên vết bỏng + Lô 3: bôi dầu mù u lên vết bỏng + Lô 4: để vết bỏng tự lành Sau theo dõi tình trạng vết thương xem có nhiễm trùng hay khơng, để đánh giá tình trạng lành vết thương chúng tơi tiến hành đo diện tích vết thương lại theo thời gian Kết thu sau : Bảng 3.12 Diện tích vết thương lại thực tế (cm2) Ngày Lơ 3,36 2,98 2,36 0,81 0,41 3,79 3,25 2,97 1,64 1,42 3,64 3,18 2,85 1,46 1,24 4 3,84 3,54 3,12 2,01 1,76 90 80 70 60 Tỷ lệ lành vết 50 thương (%) 40 30 20 10 12 15 Lô Lô Lô Lô ngày 12 15 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ (%) lành vết thương theo thời gian L« Thị Bảo Khánh 60 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật T kt qu trờn ta thấy rằng: lô điều trị bằng, màng BC có tẩm dầu mù u đối tượng thỏ có thời gian lành vết thương nhanh Chúng tơi mong muốn ứng dụng thử nghiệm dùng màng BC bệnh nhân bỏng sản xuất chế phẩm BC y học Như vậy: màng BC có tẩm mù u có thời gian lành vết thương nhanh nhất: 15 ngày tỉ lệ lành vết thương 89,75% đối tượng động vật thử nghiệm thỏ Hình 3.13 Vết thương sử dụng Hình 3.14 Vết thương dùng màng màng BC tr bng Lô Thị Bảo Khánh BC ngy 61 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghµnh vi sinh vËt Hình 3.15 Sử dụng màng BC tẩm Hình 3.16 Vết thương khơng dùng dầu mù u sau 15 ngày màng BC, bôi dầu mù u sau 15 ngy Lô Thị Bảo Khánh 62 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp 4.1 Kt lun Chuyên nghành vi sinh vËt Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Từ nguồn nguyên liệu bia Hà Nội giấm làm theo phương pháp thủ công phân lập 20 mẫu vi khuẩn axetic có chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Khi tiến hành thử khả tạo màng chủng chúng tơi lựa chọn chủng Acetobacter xylinum H6 có khả tạo màng mỏng, dai, bền, đáp ứng yêu cầu chế tạo màng sinh học Nghiên cứu số đặc tính sinh học, động thái phát triển chủng H6 Tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng với thành phần: hàm lượng đường (glucozơ) 18.424(g), pepton (g), (NH4)2SO4 2,534(g)cho chủng Acetobacter xylinum H6 theo phương pháp toán học thực nghiệm Bước đầu ứng dụng thử nghiệm thỏ để trị bỏng, thay da tạm thời 4.2 Đề nghị Đây nghiên cứu bước đầu vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 cho màng mỏng với mục đích tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng chế tạo màng sinh học Nhưng hạn chế định thời gian khả nghiên cứu số đặc điểm sinh học, tìm mơi trường dinh dưỡng với yếu tố tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 bước đầu ứng dụng trị bỏng thỏ Tôi mong rằng, thời gian tới tạo điều kiện để tiếp tục nghiên cứu sâu đối tượng Acetobacter xylinum H6 lĩnh vực như: lựa chọn môi trường tối ưu nhiều yếu tố cho chủng phát triển, ứng dụng thử nghiệm màng BC cho bệnh nhân bỏng, sản xuất màng quy mô công nghiệp để ứng dụng y học Đây hướng nghiên cứu có triển vọng hin Lô Thị Bảo Khánh 63 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật TI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 1972 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 3, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào, 1990 Thực hành vi sinh vật học, nhà xuất Giáo dục, trang 213- 278 Đặng Thị Hồng, 2007 Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học (BC) Luận văn thạc sĩ khoa học Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh, 2001 Nghiên cứu tạo màng sinh học trị bỏng từ Acetobacter xylinum Y học thực hành, Số Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh, 2001 Nghiên cứu đặc tính màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học, số 361, trang 18-20 Đinh Thị Kim Nhung, Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng Acetobacter ứng dụng lên men Axêtic theo phương pháp chìm Luận án phó tiến sĩ khoa học ,1995 Đinh Thị Kim Nhung, 1997 Phân lập tuyển chọn số chủng Acetobacter ứng dụng làm thạch dừa Thông báo khoa học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2, số 1, trang 181- 186 10 Đinh Thị Kim Nhung, 1995 Tối ưu hóa thành phần mơi trường dinh dưỡng cho vi khuẩn Acetobacter phương pháp quy hoạch hóa tốn học thực nghiệm Tạp chí Sinh học, số Lô Thị Bảo Khánh 64 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật 11 Haim W, Shai S., Dorit A, Yehudit S., Gail V, Patriccia O, Moshe B, 1997 Cdi-binding protein, a new factor regulating cellulose synthesis in Acetobacter xylinum FEBS letter 416, 207- 201 12 Hong J.S, Moon S.H, Young G.K and Sang J.L, 2001 Opimization of fermentation condittion for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter A9 in shacking cultures Biotecchnool Appl.Biochem 331-5 (printed in Great Britain) 13 Kiyoshi T., Tomoko Asakura, Masahiro Fukaya, Etsuzo Entani and Yoshiya Kawamura Cellulose Production by acetic acid- Resistant Acetobacter xylinum 14 Czafa, W., Young , D.J.; Kawechi, M Brown R.M.Je, 2007 The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications Biomacromolecules 8, 1- 12 15 Cienchanska D, 2004 Multifuntional bacterial cellulose chitosan composite materials for medical applications Fibres and Textiles in Easter Europe 12 69 – 72 16 Embuscado, M, Marks, I., and Miller, J., (1994) Bacterial cellulose I Factors affecting the production of Acetobacter xylinum Food Hydrocolloids, No 5, 407 – 418 Lô Thị Bảo Khánh 65 Lớp K30b- Sinh ... hở, dùng màng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ) [7], [8] Việc nghiên cứu môi trường dinh dưỡng tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển, chế tạo màng sinh học quy mô công nghiệp hướng... 3.4 Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn H6 51 3.4.1 Thiết lập mơ hình tốn học 52 3.4.2 Tối ưu hoá 56 3.5 Bước đầu dùng màng BC trị bỏng thỏ 58 Chương Kết luận. .. tuyển chọn tối ưu hố mơi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylinum H6, chế tạo màng sinh hc Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật NI DUNG Chương