1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  HOÀNG THỊ HƯƠNG QUỲNH NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÂY HỒNG BÌ (Clausena lansium Lour.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM HÀ NỘI, 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan trình bày luận văn riêng tôi, hướng dẫn GS TS Đỗ Ngọc Liên không trùng lặp với nghiên cứu có trước Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009 Học viên Hoàng Thị Hương Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất thứ sinh từ thực vật 1.1.1 Các hợp chất phenolic từ thực vật 1.1.2 Alkaloid thực vật 10 1.1.3 Terpen thực vât 11 1.2 Bệnh béo phì (Obesity) 11 1.2.1 Khái niệm phân loại béo phì 11 1.2.2 Thực trạng béo phì giới Việt Nam 12 1.2.3 Tác hại nguy bệnh béo phì 12 1.2.4 Nguyên nhân, giải pháp phòng, điều trị béo phì 13 1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid máu 14 1.2.6 Mối quan hệ béo phì đái tháo đường 15 1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetse mellitus) 16 1.3.1 Khái niệm phân loại 16 1.3.2 Thực trạng đái tháo đường giới Việt Nam 18 1.3.3 Tác hại biến chứng 18 1.3.4 Phòng điều trị bệnh đái tháo đường 19 1.3.5 Đái tháo đường với Y học cổ truyền 19 1.3.6 Chuyển hoá glucose điều hoà glucose huyết 19 1.4 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 20 1.4.1 Đặc điểm thực vật học 21 1.4.2 Thành phần hoá học 22 1.4.3 Sử dụng hoạt tính sinh học 22 1.4.4 Các nghiên cứu Hồng Bì (Clausena lansium Lour) có tác dụng giảm béo phì hạ glucose huyết 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1 Mẫu thực vật 23 2.1.2 Mẫu động vật 23 2.1.3 Dụng cụ hoá chất thí nghiệm 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu 24 2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học Hồng Bì 24 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì đến trọng lượng số số hoá sinh máu chuột BPTN 28 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì mô hình chuột ĐTĐ type thực nghiệm 30 2.2.5 Một số kĩ thuật phân tích hoá sinh 31 2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết 31 2.2.5.2 Định lượng insulin huyết chuột 31 2.2.5.3 Phương pháp định lượng số số lipid huyết 32 2.2.5.4 Phương pháp xác định hoạt độ số enzyme liên quan đến trình trao đổi carbohydrate chuột đái tháo đường 33 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Quy trình tách chiết phân đoạn từ vỏ Hồng Bì 35 3.2 Kết khảo sát thành phần hợp chất tự nhiên có phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì 36 3.2.1 Định tính số hợp chất tự nhiên có vỏ Hồng Bì 36 3.2.2 Hàm lượng polyphenol tổng số 37 3.2.3 Kết sắc kí lớp mỏng 38 3.3 Kết xác định liều độc cấp 40 3.4 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì mô hình chuột BPTN 41 3.4.1 Kết xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm 41 3.4.2 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì đến trọng lượng số số lipid huyết chuột 44 3.4.2.1 Tác dụng đến trọng lượng chuột 44 3.4.2.2 Tác dụng đến số lipid chuột béo phì 46 3.5 Tác dụng hạ đường huyết vỏ Hồng Bì mô hình chuột ĐTĐ type 50 3.5.1 Kết tạo mô hình chuột ĐTĐ type thực nghiệm 50 3.5.2 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì đến nồng độ glucose huyết chuột ĐTĐ 53 3.5.3 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì đến hàm lượng insulin huyết 55 3.6 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì đến số yếu tố liên quan đến chuyển hoá glucose 57 3.6.1 Ảnh hưởng đến hàm lượng glycogen gan 58 3.6.2 Ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme hexokinase glucose-6-phosphatase 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BPTN : Béo phì thực nghiệm BMI : Chỉ số khối thể (Body Mass Index) BuOH : Cao buthanol CH2Cl2 : Cao dichlomethan ĐTĐ : Đái tháo đường ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay EtOAc : Cao ethylacetate G6Pase : Glucose -6- phosphatase HK : Hexokinase HFD : Ăn thức ăn chứa chất béo cao HDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein) LDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LD50 : Liều độc làm chết 50% số chuột MeOH : Cao methanol Met : Thuốc metformin ND : Ăn thức ăn chuẩn, bình thường PĐ : Phân đoạn STZ : Streptozocin SE : Sai số chuẩn (Standard error) TC : Cholesterol tổng số TG : Triglycerid TW : Trung ương DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại BMI người trưởng thành Châu Âu Châu Á Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WTO Bảng 2.1 Bảng phản ứng định tính đặc trưng Bảng 2.2 Kết xây dựng đường chuẩn acid gallic Bảng 2.3 Thành phần thức ăn giàu lipid Bảng 2.4 Mô hình nghiên cứu khả giảm béo phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì Bảng 2.5 Mô hình nghiên cứu khả hạ glucose huyết phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút phân đoạn từ vỏ Hồng Bì Bảng 3.2 Kết định tính phân đoạn dịch chiết vỏ Hồng Bì Bảng 3.3 Hàm lượng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì Bảng 3.4 Đặc điểm sắc kí đồ phân đoạn dịch chiết vỏ Hồng Bì Bảng 3.5 Kết thử độc tính theo đường uống Bảng 3.6 Trọng lượng trung bình chuột nuôi hai chế độ dinh dưỡng Bảng 3.7 So sánh số số hóa sinh chuột nuôi thường nuôi BPTN Bảng 3.8 Trọng lượng trung bình lô chuột thí nghiệm trước sau điều trị 21 ngày Bảng 3.9 Tác động phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì đến số lipid chuột béo phì Bảng 3.10 Nồng độ glucose huyết lúc đói lô chuột trước sau tiêm STZ Bảng 3.11 Kết nồng độ glucose huyết lúc đói lô chuột sau 21 ngày điều trị Bảng 3.12 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết chuột sau 21 ngày điều trị Bảng 3.13 Hàm lượng glycogen gan chuột sau 21 ngày điều trị phân đoạn dịch chiết Bảng 3.14 Hoạt độ enzyme hexokinase glucose-6-phosphatase lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) cành mang Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn acid gallic Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết hợp chất tự nhiên vỏ Hồng Bì Hình 3.2 Sắc kí đồ phân đoạn dịch chiết từ vỏ Hồng Bì Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn tăng trọng nhóm chuột với chế độ dinh dưỡng khác vòng tuần Hình 3.4 Biểu đồ so sánh số số hóa sinh lô chuột thí nghiệm Hình 3.5 Biểu đồ trọng lượng trung bình lô chuột trước sau điều trị 21 ngày Hình Tác động phân đoạn dịch chiết đến số số trao đổi lipid chuột béo phì thực nghiệm Hình 3.7 Nồng độ glucose huyết lúc đói lô chuột thí nghiệm trước sau tiêm 72 Hình 3.8 Kết nồng độ glucose huyết lúc đói lô chuột sau 21 ngày điều trị Hình 3.9 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết chuột sau 21 ngày điều trị Hình 3.10 Hàm lượng glycogen gan (mg/g gan) sau điều tri lô chuột Hình 3.11 Hoạt độ enzyme hexokinase glucose-6-phosphatase lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị Hình 12 Tóm tắt chế tác dụng phân đoạn dịch chiết đến khả hạ glucose huyết MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nhịp sống công nghiệp đại, thói quen dinh dưỡng cân bằng…là nguyên nhân nhiều bệnh nguy hiểm béo phì (Obesity), đái tháo đường (Diabetse mellitus), … Ngày theo thống kê tổ chức quốc tế theo dõi bệnh béo phì (International Obesity Task Force – IOTF) giới có khoảng 1,7 tỉ người thừa cân béo phì [3], [4] có xu hướng trẻ hóa Bệnh béo phì thường gặp quốc gia phát triển ví dụ Mỹ có 30% người trưởng thành mắc bệnh, Thái Lan có 20%, Hàn Quốc 22%, Singapore 31% [3], [4], [13], [34] dần xuất nước phát triển Tại Việt Nam theo thống kê Viện Dinh dưỡng Quốc gia (2007) tỉ lệ người trưởng thành từ 25- 64 tuổi có tình trạng thừa cân béo phì 16,8%, trẻ em 16,3% tiếp tục gia tăng [3], [31] Ngày 31/11/2007 Bộ Y tế kí định thành lập Trung tâm Dinh dưỡng Kiểm soát béo phì thuộc Viện Dinh dưỡng, thức tuyên chiến với bệnh béo phì [13] Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh nội tiết phổ biến nhất, giới có 200 triệu người mắc bệnh ĐTĐ Nhìn chung khoảng 4% người trưởng thành chẩn đoán ĐTĐ vào năm 1985 ước tính số tăng lên 5,4% vào năm 2025 [4], [18], [37] Sự gia tăng nhanh chóng tỉ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành vấn đề sức khỏe lớn bệnh có tỉ lệ mắc, chết trầm trọng trình trị liệu lâu dài, đặc biệt ĐTĐ type bệnh phổ biến bệnh ĐTĐ Nếu béo phì ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe, thẩm mỹ tiềm ẩn nhiều nguy bệnh tật khác ĐTĐ type (diabetes type 2), bệnh tim mạch, rối loạn lipid máu, sỏi túi mật, gan nhiễm mỡ, viêm khớp mãn tính, đột quỵ … ĐTĐ mang đến nhiều biến chứng nguy hiểm như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cắt cụt …Vì đại đa số người bệnh có nhu cầu chữa bệnh cách an toàn Mỗi năm nước Mỹ 10 hàng tỉ đô la cho điều trị béo phì ĐTĐ thuốc tổ chức an toàn thực phẩm dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin … Song hầu hết thuốc có nguồn gốc hóa học thường gây tác dụng phụ Trước tình hình ủy ban chuyên gia WHO khuyến nghị nên sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ độc tính Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học tác dụng dược lý loài thảo mộc giới nói chung, Việt Nam nói riêng phát triển, mang tầm quan trọng đặc biệt Dựa sở nghiên cứu tác dụng dược lý thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) [16], [32], chi Clausena [26], [27], [66] nói chung số nghiên cứu đối tượng Clausena lansium [33], [50] nói riêng, định chọn đề tài : “Nghiên cứu tách chiết đặc tính sinh dược học số hợp chất tự nhiên từ Hồng Bì ( Clausena lansium Lour.)” Mục đích nghiên cứu Luận văn tập trung nghiên cứu thành phần hóa học Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) tác động tới trọng lượng số số hóa sinh, nhằm tạo sở khoa học cho nghiên cứu lĩnh vực tìm kiếm thuốc giải thích tác dụng chữa bệnh thuốc y học cổ truyền Mục tiêu luận văn: Tìm quy trình tách chiết khảo sát thành phần hợp chất tự nhiên từ mẫu thực vật Đánh giá tác dụng sinh dược học số phân đoạn dịch chiết từ mẫu thực vật mô hình chuột béo phì ĐTĐ thực nghiệm Nhiệm vụ nghiên cứu Dựa mục tiêu nghiên cứu xác định nhiệm vụ cụ thể luận văn sau: Đưa quy trình tách chiết hợp chất từ Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 66 Glycogen dạng dự trữ nội bào chủ yếu phân tử glucose gan, xương, tim hàm lượng mô khác phản ánh trực tiếp hoạt động insulin (tác dụng tăng trình tổng hợp glycogen cách kích thích enzyme glycogen synthetase ức chế enzyme glycogenphosphogenase) Kết cho thấy rằng: chuột đái tháo đường có tượng tăng trình phân giải glycogen kháng hay thiếu hụt insulin, biểu glycogen chuột đái tháo đường giảm so chuột bình thường Hai phân đoạn dịch chiết dichlomethan ethylacetate làm tăng hàm lượng glycogen sau 21 ngày điều trị cho chuột ĐTĐ với liều 1500mg/kg thể trọng Điều hai phân đoạn dịch chiết có từ vỏ Hồng Bì có chứa hợp chất có tác dụng kích thích trình tổng hợp glycogen chế 3.6.2 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết đến hoạt độ enzyme hexokinase glucose-6-phosphatase gan Glucose-6-phosphate hexokinase hai enzyme có nhiều gan, có tác dụng điều hòa glucose huyết theo theo hai chiều ngược Hoạt độ chúng trình bày bảng 3.14 hình 3.11 Bảng 3.14 Hoạt độ enzyme hexokinase glucose-6-phosphatase lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị STT Lô điều trị Chuột thường KĐT (lô chứng thường) Hoạt độ hexokinase (mol/phút/mg protein) Hoạt độ G6Pase (molPi/phút/mg protein) 1,05 ± 0,08 0,535± 0,01 0,33 ± 0,05 0,963± 0,03 # (↓ 68,57%) (↑ 80%)# (p