1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2    HOÀNG THỊ MINH TÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÂY TÁO MÈO “DOCYNIA INDICA (WALL.)DECNE” CÓ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ CHỐNG RỐI LOẠN TRAO ĐỔI GLUXIT, LIPIT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2009 2 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của GS.TS. Đỗ Ngọc Liên giảng viên cao cấp - Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Qua đây tôi xin gửi tới thầy lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, khoa Sinh học, phòng Sau đại học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 và Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội cùng các bạn học viên cao học K10 đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Học viên Hoàng Thị Minh Tân 3 LỜI CAM ĐOAN Luận văn này được hoàn thành dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Đỗ Ngọc Liên Tôi xin cam đoan: - Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. - Kết quả này không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã được công bố. Nếu sai tôi xin hoàn thành chịu trách nhiệm. Học viên Hoàng Thị Minh Tân 4 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………… 4 1.1. Các hợp chất thực vật thứ sinh………………………………………… 4 1.2. Bệnh béo phì……………………………………………………………10 1.3. Enzyme lipase………………………………………………………… 19 1.4. Vi sinh vật………………………………………………………………19 1.5. Vài nét về cây táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne)……………… 21 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………… 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………….24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………………33 3.1. Quy trình tách chiết các cao phân đoạn từ quả và lá táo mèo………… 33 3.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các cao phân đoạn dịch chiết từ quả và lá táo mèo……………………………………………………………34 3.3. Định lượng hợp chất polyphenol tổng số trong các cao phân đoạn dịch chiết từ quả và lá táo mèo………………………………………………… 37 3.4. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng……38 3.5. Thử hoạt tính kháng khuẩn …………………………………………….41 3.6. Tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ quả táo mèo lên chuột béo phì thực nghiệm…………………………………………………………… 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………………61 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………… 63 PHỤ LỤC………………………………………………………………… 66 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHE : Cholesterol esterase CHO : Cholesterol oxydase CHCl 3 : Chloroform EtOAc : Ethylacetate EtOH : Ethanol BMI : Chỉ số khối cơ thể HDL : Lipoprotein tỷ trọng cao LDL : Lipoprotein tỷ trọng thấp TG : Triglycerid TW : Trung ương MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài 6 Hiện nay, trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại, cuộc sống của con người được đáp ứng đầy đủ cả về mặt vật chất cũng như tinh thần. Tuy nhiên, chế độ dinh dưỡng chưa khoa học, xu hướng ăn thiên về các thức ăn chế biến sẵn, giàu chất dinh dưỡng, ít chất xơ nên đã dẫn đến một số bệnh rối loạn trao đổi lipid, gluxit như: béo phí, tiểu đường… Tình hình thừa cân và béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động không những ở các quốc gia phát triển mà ở cả các quốc gia đang phát triển. Đây thực sự là mối đe dọa tiềm ẩn trong tương lai. Do tốc độ phát triển nhanh của bệnh nên nhu cầu thuốc điều trị ngày càng tăng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được sản xuất. Thuốc tổng hợp hóa học có tác dụng nhanh, hiệu quả nhưng nhiều tác dụng phụ. Vì vậy, các nhà khoa học đang hướng sự quan tâm của mình sang các thuốc có nguồn gốc thảo dược. Loại thuốc này ít độc tính, ít tác dụng phụ, dễ sử dụng, giá thành rẻ do nguồn nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên. Việc nghiên cứu khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của các loại cây thuốc có giá trị ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, hiệu quả giữ tầm quan trọng đặc biệt. Trong các công trình nghiên cứu khoa học gần đây, dược liệu thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) đang được chú ý. Một trong các loài có triển vọng là táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne). Táo mèo thường mọc ở vùng núi cao Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Lai Châu… là loại cây mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân nơi đây. Quả táo mèo không chỉ dùng để ăn mà còn là vị thuốc rất tốt. Trong đông y, táo mèo được sử dụng chữa bệnh cao huyết áp, kích thích tiêu hoá, tăng cường sức miễn dịch của cơ thể, chữa ho, trấn tĩnh an thần… Trên cơ sở những đặc tính sinh học, khả năng chữa bệnh của táo mèo, kết hợp với xu thế hiện nay trong việc nghiên cứu thảo dược chữa bệnh, 7 chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự nhiên từ cây táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne) có tác dụng kháng khuẩn và chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid”. Nghiên cứu này góp phần đánh giá khả năng chữa bệnh của táo mèo, bổ sung vào nguồn thảo dược chữa bệnh. Đây là vấn đề có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu quy trình tách chiết một số hợp chất tự nhiên, khả năng kháng khuẩn và tác động hạ lipid (mỡ máu), đường huyết trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm của táo mèo. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu sử dụng các hệ dung môi khác nhau để tách chiết một số hợp chất tự nhiên trong quả và lá táo mèo có tác dụng kháng khuẩn, chống rối loạn trao đổi lipid, gluxit từ đó thiết lập quy trình hoàn thiện. - Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên - Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định - Đánh giá tác dụng hạ lipid (mỡ máu), đường huyết của các phân đoạn dịch chiết quả táo mèo trên mô hình chuột gây béo phì. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Mẫu thực vật Quả và lá táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne), được thu hái vào tháng 9 năm 2008, tại huyện Văn Chấn - Yên Bái. 4.2. Mẫu động vật và vi sinh vật Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14g/con) được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW. Các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Bacillus subtilis. 8 4.3. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ quả táo mèo lên 4 chủng vi khuẩn: Escherchia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Bacillus subtilis và chuột béo phì thực nghiệm, xem xét khả năng kháng khuẩn và tác dụng của chúng lên các chỉ số cholesterol, triglycerid, HDL, lipase, glucose huyết của chuột béo phì sau 16 ngày điều trị. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp tách chiết 5.2. Phương pháp định tính 5.3. Phương pháp định lượng 5.4. Phương pháp phân lập các chất 5.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 5.6. Phương pháp gây rối loạn trao đổi gluxit, lipid trên mô hình động vật 5.7. Phương pháp thử hoạt tính sinh học trên mô hình chuột béo phì 6. Giả thuyết khoa học 6.1. Đưa ra quy trình tách chiết 6.2. Phân lập xác định định tính (phản ứng đặc trưng và sắc ký lớp mỏng) 6.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 6.4. Tạo mô hình chuột béo phì, xác định các chỉ tiêu: khối lượng cơ thể và chỉ số mỡ máu chứng minh là chuột béo phì 6.5. Đánh giá khả năng điều trị của các cao phân đoạn dịch chiết NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9 1.1. Các hợp chất thực vật thứ sinh 1.1.1. Một số khái niệm cơ bản về hợp chất thực vật thứ sinh [15], [17], [19], [21] Ở thực vật, ngoài protein, saccharide, lipid, vitamine… còn có các chất khác được gọi là các hợp chất thực vật thứ sinh. Nhóm hợp chất này thường có trong thực vật với hàm lượng thấp. Khác với các chất trao đổi bậc nhất, giữ vai trò trung tâm và tham gia trực tiếp vào các quá trình trao đổi chất của cơ thể, các hợp chất thực vật thứ sinh không phải là yếu tố đặc biệt cần thiết cho các quá trình sinh trưởng, phát triển, quang hợp và sinh sản. Một số hợp chất thực vật thứ sinh được tích tụ trong thực vật với hàm lượng đáng kể (như alkaloid, cao su, tinh dầu) gây nên kiểu trao đổi chất đặc trưng của các loài đó. Nhiều chất thuộc nhóm này ở mức độ đáng kể quyết định phẩm chất thực phẩm và mùi vị các sản phẩm khác nhau chế biến từ thực vật. Ngoài ra, còn có một số chất được dùng trong công nghiệp và y học. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học và tính chất lý học của chúng mà các hợp chất thực vật thứ sinh được chia ra làm 3 nhóm chính là: terpene, các hợp chất phenolic, ankaloid. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, các hợp chất polyphenol (thuộc nhóm các hợp chất phenollic) đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh như: ung thư, viêm gan, béo phì… 1.1.1.1. Nhóm hợp chất terpene Terpene là nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến nhất, được hình thành từ quá trình polyme hóa các tiểu đơn vị isopren, có công thức cấu tạo chung là (C 5 H 8 ) n . Đó là thành phần chính của các loại tinh dầu thường được dùng trong công nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm. Trong thực vật terpene được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevanolate hoặc con đường glyceraldehyde - 3 - phosphate/pyruvat. Hầu hết các terpene đều 10 thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxi hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như: alcohl, ketone, acid và aldehyde. 1.1.1.2. Nhóm hợp chất phenolic Hợp chất phenolic là một nhóm lớn các hợp chất thực vật thứ sinh. Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có chứa vòng thơm mang một hay nhiều nhóm thế hydroxyl. Dựa vào thành phần và cấu trúc hóa học,người ta chia hợp chất phenolic thành 2 nhóm lớn là nhóm phenol đơn giản (simple phenols) và nhóm pholyphenol. Nhóm phenol đơn giản gồm 2 nhóm chính là nhóm phenolic acid và nhóm coumarin. Nhóm polyphenol cũng gồm 2 nhóm chính là nhóm flavonoid và nhóm tannin. Phân nhóm phenolic acid Phenolic acid trong thực vật là tất cả các hợp chất thực vật thứ sinh có tối thiểu một nhóm hydroxyl phenolic, gần đây các nhà khoa học thường giới hạn phân nhóm phenolic acid chỉ gồm các chất là dẫn xuất của acid benzoic (C 6 -C 1 ) và acid cinamic (C 6 -C 3 ). Gallic acid Procatechuic acid Phân nhóm coumarin Coumarin là dẫn xuất của α-pyrone có cấu trúc C 6 -C 3 , dị vòng chứa oxy và có trong nhiều loại cây. Chúng là những chất kết tinh không màu hoặc có màu vàng nhạt, vị đắng, một số lớn dễ thăng hoa, có mùi thơm giống như mùi thơm của valinin. Về mặt hóa học, coumarin có thể tồn tại trong cây ở dạng aglycon tan nhiều trong các dung môi kém phân cực và dạng kết hợp với [...]... kết quả tốt Tuy nhiên, chi tiết về các hợp chất tự nhiên trong quả táo mèo có tác động đến quá trình chuyển hóa lipid, béo phì và rối loạn trao đổi gluxit chưa có tài liệu nào nghiên cứu đầy đủ Vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là nghiên cứu hiệu quả giảm mỡ máu, giảm đường huyết và tác động đến enzyme chuyển hóa lipid (enzyme lipase) của dịch chiết các hợp chất tự nhiên từ quả táo mèo trên mô hình... trực khuẩn Gram dương, là tác nhân gây một số bệnh cho cây trồng Chúng sinh bào tử, sống hiếu khí và không gây bệnh cho người 1.5 Vài nét về cây táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne) [5] 1.5.1 Đặc điểm hình thái, phân bố Cây táo mèo hay còn gọi là chua chát, có tên khoa học là Docynia indica (Wall.)Decne, thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) Cây nhỡ cao khoảng 5m, nhánh và thân non có gai, lá có phiến, có thùy... động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch Nhiều chất coumarin có tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán, giảm đau và hạ nhiệt Coumarin Phân nhóm flavonoid Trong số các hợp chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng, phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị Flavonoid thường là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavon,... mg/l axit gallic 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn [4], [12] Mục đích là xác định khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết từ quả và lá táo mèo đối với một số chủng vi khuẩn theo phương pháp nhỏ giọt, xác định đường kính vòng kháng khuẩn 33 2.2.4.1 Dụng cụ - Đĩa petri: đường kính 9cm, đáy phẳng, lượng thạch 25ml/đĩa - Dung dịch nghiên cứu: dịch chiết của các phân đoạn cao cồn, n-hexan,... nước Trong cây, coumarin được coi là một trong số các chất “phòng thủ hóa học hữu hiệu” giúp thực vật chống lại những điều kiện bất lợi do môi trường và dịch bệnh gây ra Trong đời sống, coumarin được sử dụng làm nước hoa, hương liệu, bán tổng hợp các chất hóa học khác nhau, đặc biệt là các chất chống đông máu và chất diệt loài gậm nhấm Trong y học, đáng chú ý là dẫn xuất coumarin có tác dụng chống co... vật có hoa nhưng cũng chỉ 20% số loài thực vật này là sản sinh được ra alkaloid Đa số alkaloid không có mùi, vị đắng, một số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin) Về vai trò sinh học, các alkaloid bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và các loại côn trùng, sâu bệnh ăn lá Trong y học, alkaloid được sử dụng làm thuốc ức chế hoặc kích... viêm họng, viêm phổi, viêm xương, có thể gây nhiễm trùng huyết rất nguy hiểm và gây nhiễm độc thực phẩm Loại vi khuẩn này sống tương đối lâu và có thể kháng nhiều loại kháng sinh 1.4.3 Salmonella typhi Salmonella typhi là vi khuẩn Gram âm, hình que, có nhiều lông, sống kị khí tùy tiện, có thể di động Vi khuẩn này xâm nhập vào cơ thể người, tập trung chủ yếu ở ống tiêu hóa và gây bệnh thương hàn 1.4.4 Bacillus... kháng lại các loại kháng sinh cổ Khả năng này của chúng có thể được hình thành do đột biến gen, di truyền qua các thế hệ, tiếp hợp hoặc do biến đổi thành và màng tế bào 1.4.2 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là đại diện cho nhóm cầu khuẩn Gram dương không sinh bào tử Nếu một loại kháng khuẩn nào có tác dụng với Staphylococcus aureus thì cũng có thể có tác dụng với các loại cầu khuẩn khác (Streptococcus,... thiện vì thế các rối loạn tâm thần đặc biệt có hại đến sự phát triển của trẻ Ở các nước phương Tây, phụ nữ và trẻ em béo phì có tỷ lệ phạm tội và liên quan đến hành vi gây rối xã hội cao hơn các đối tượng khác Hậu quả của béo phì ở trẻ và vị thành niên: Đó là tăng tỷ lệ các bệnh mãn tính như: rối loạn dung nạp glucose, tăng huyết áp, rối loạn chuyển hóa lipid máu, bệnh thoái hóa mỡ, các rối loạn tiêu hóa,... phì thực nghiệm CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Quả, lá táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne) : được thu hái vào tháng 9 năm 2008, tại huyện Văn Chấn - tỉnh Yên Bái Sau đó được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột mịn Mẫu khô được ngâm với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng (quá trình chiết được lặp lại 3 lần) Hỗn hợp này được lọc bằng giấy lọc Phần . của táo mèo. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu sử dụng các hệ dung môi khác nhau để tách chiết một số hợp chất tự nhiên trong quả và lá táo mèo có tác dụng kháng khuẩn, chống rối loạn trao. của táo mèo, kết hợp với xu thế hiện nay trong việc nghiên cứu thảo dược chữa bệnh, 7 chúng tôi lựa chọn đề tài: Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự nhiên từ cây táo mèo (Docynia indica. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2    HOÀNG THỊ MINH TÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÂY TÁO MÈO DOCYNIA INDICA (WALL. )DECNE