1 B GIO DC V O TO TRNG I HC S PHM H NI NGUYN TRNG TN Nghiên cứu tách chiết đặc tính sinh dược học số hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea triloba L Ipomoea pes-tigridis L Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUN VN THC S SINH HC Ngi hng dn khoa hc: TS Trng Vn Chõu Hà Nội - 2009 Lời cảm ơn Bằng lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Trương Văn Châu Học viện Quản lý giáo dục, giao đề tài, tận tình giúp đỡ, bảo suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng lòng kính trọng biết ơn tới GS.TS Đỗ Ngọc Liên cán Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cán Trung tâm Hỗ trợ thiết bị thí nghiệm chuyển giao công nghệ - Đại học Sư phạm Hà Nội 2, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, bạn học viên trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Hùng Vương Phú Thọ, bạn đồng nghiệp tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Trương Tấn Li cam oan Tụi xin cam oan nhng kt qu nghiờn cu c trỡnh by lun l tụi thc hin v khụng trựng lp vi bt c tỏc gi no khỏc Tụi xin hon ton chu trỏch nhim i vi nhng ni dung c cp bn lun ny H Ni, ngy 10 thỏng 10 nm 2009 Hc viờn Nguyn Trng Tn MC LC Trang Li cm n Mc lc Danh mc cỏc bng, hỡnh, biu Danh mc ch vit tt M U NI DUNG CHNG TNG QUAN TI LIU 1.1 MT S HP CHT T NHIấN THC VT 1.1.1 Hp cht phenolic 1.1.2 Flavonoid thc vt 1.1.3 Tanin 10 1.1.4 Alkaloid 11 1.2 BNH BẫO PHè V I THO NG 14 1.2.1 Bnh bộo phỡ 14 1.2.2 Bnh ỏi thỏo ng 21 1.3 C IM MT S CHNG VI SINH VT GY BNH 25 1.4 VI NẫT V CHI IPOMOEA V LOI IPOMOEA TRILOBA L V IPOMOEA PES-TIGRIDIS L 26 CHNG I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 28 2.1 I TNG NGHIấN CU 28 2.1.1 Mu thc vt 28 2.1.2 Mu ng vt 28 2.1.3 Mu vi sinh vt 28 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU 29 2.2.1 Quy trỡnh chit xut 29 2.2.2 Kho sỏt thnh phn húa hc cỏc phõn on dch chit 30 2.2.3 Sc ký lp mng 32 2.2.4 nh lng polyphenol tng s theo phng phỏp Folin Ciocalteau 33 2.2.5 To mụ hỡnh chut bộo phỡ v ỏi thỏo ng thc nghim 35 2.2.6 Nghiờn cu cỏc ch s sinh lý ca chut bộo phỡ v ỏi thỏo ng 36 2.2.7 Th hot tớnh khỏng vi sinh vt 36 CHNG KT QU NGHIấN CU V THO LUN 38 3.1 TCH CHIT, NH TNH, NH LNG CC HP CHT T NHIấN T L CA LOI IPOMOEA TRILOBA L V IPOMOEA PES-TIGRIDIS L 38 3.1.1 Kt qu tỏch chit cỏc phõn on 38 3.1.2 nh tớnh cỏc hp cht t nhiờn t cỏc phõn on dch chit 39 3.1.3 nh lng polyphenol tng s cỏc phõn on dch chit 41 3.2 TH NGHIM TRấN Mễ HèNH CHUT GY BẫO PHè THC NGHIM 43 3.2.1 To mụ hỡnh chut bộo phỡ thc nghim 43 3.2.2 Tỏc dng ca mt s phõn on dch chit loi bỡm bỡm ba thựy lờn chut gõy bộo phỡ thc nghim 46 3.3 TH NGHIM TRấN Mễ HèNH CHUT GY T THC NGHIM 52 3.3.1 To mụ hỡnh chut ỏi thỏo ng mụ phng theo type 52 3.3.2 Tỏc dng gim nng ng huyt ca cỏc phõn on dch chit 52 3.4 HOT TNH KHNG VI SINH VT CA CC PHN ON DCH CHIT 57 KT LUN V KIN NGH 59 KT LUN 59 KIN NGH 60 DANH MC CC BNG, HèNH, BIU Trang Bng 1.1 Tiờu ca t chc y t th gii WHO v chn oỏn T 21 Bng 3.1 Khi lng khụ ca cỏc phõn on dch chit 38 Bng 3.2 Kt qu th nh tớnh mt s hp cht t nhiờn 40 Bng 3.3 nh lng polyphenol tng s cỏc phõn on dch chit 42 Bng 3.4 Nng cỏc ch s húa sinh ca cỏc lụ chut trc v sau tun iu tr 48 Bng 3.5 Nng glucose huyt ca cỏc lụ chut thớ nghim sau 10 gi iu tr 53 Bng 3.6 Nng glucose huyt ca cỏc lụ chut thớ nghim sau 20 ngy iu tr 55 Bng 3.7 ng kớnh vũng vụ khun ca cỏc phõn on dch chit loi bỡm bỡm ba thựy v bỡm bỡm chõn cp i vi E.coli v S.aureus 57 Hỡnh 1.1 Khung cacbon ca flavonoid Hỡnh 1.2 Cu trỳc ca Rutin v Saponin Hỡnh 1.3 Cu trỳc ca flavonoid, isoflavonoid, v neoflavonoid Hỡnh 1.4 Cu trỳc ca cafein v nicotin 12 Hỡnh 2.1 Mu thc vt 28 Hỡnh 2.2 S quy trỡnh tỏch chit cỏc phõn on 30 Hỡnh 2.3 Kt qu xõy dng ng chun acid gallic 34 Hỡnh 3.1 Sc ký cỏc phõn on dch chit t bỡm bỡm ba thựy v bỡm bỡm chõn cp 41 Hỡnh 3.2 Biu trng lng trung bỡnh ca cỏc lụ chut 44 Hỡnh 3.3 Chut nuụi ch n bỡnh thng v v bộo 45 Hỡnh 3.4 Biu ch s húa sinh mỏu chut i chng v v bộo 45 Hỡnh 3.5 Biu trng lng c th chut trc v sau tun iu tr 47 Hỡnh 3.6 Biu so sỏnh ch s húa sinh gia cỏc lụ chut thớ nghim 49 Hỡnh 3.7 Biu so sỏnh s thay i nng glucose huyt ca cỏc lụ chut thớ nghim sau 10 gi iu tr 54 Hỡnh 3.8 Biu so sỏnh s thay i nng glucose huyt ca cỏc lụ chut thớ nghim sau 20 ngy iu tr 56 DANH MC CH VIT TT BP Chl Cho T E.coli EtOAc EtOH Glu HDL LDL Metf n-hex P S.aureus STZ Tri Bộo phỡ Chloroform Cholesterol ỏi thỏo ng Escherichia coli Ethylacetat Ethanol Glucose Lipoprotein t trng cao (High-density lipoprotein) Lipoprotein t trng thp (Low-density lipoprotein) Metformin n - hexan Phõn on Staphylococcus aureus Streptozotocin Triglycerid M U Lý chn ti Vit Nam l mt nc khớ hu nhit i vi ngun ti nguyờn sinh vt núi chung v thc vt núi riờng rt a dng phong phỳ Nc ta li cú nn y dc hc c truyn dõn tc t lõu i T xa xa, nhõn dõn ta ó bit s dng nhng cõy c cú sn xung quanh nh l mt ngun dc liu cha bnh, phc v c lc cho vic bo v sc kho v y lựi bnh tt Hin tc phỏt trin nhanh ca mt s loi bnh cú tỏc ng tiờu cc n cht lng cuc sng ca ngi, s ú cú bnh bộo phỡ (BP) v ỏi thỏo ng (T) nờn nhu cu v thuc iu tr cng tng nhanh Hng lot thuc iu tr bnh BP v T ó i v ang c s dng nhm hn ch s phỏt trin ca bnh v ci thin cuc sng cho ngi Bờn cnh cỏc thuc tng hp, cỏc thuc cú ngun gc tho dc cng ang c quan tõm v phỏt trin U ban chuyờn gia ca WHO v BP v T ó khuyn ngh nờn phỏt trin cỏc thuc iu tr bnh BP v T cú ngun gc t thiờn nhiờn Vỡ vy, t cho y hc l nghiờn cu phỏt trin cỏc loi thuc cú ngun gc t tho dc, c bit l cỏc nc ang phỏt trin cú ngun nguyờn liu sn cú, r tin v ớt tỏc dng ph Quỏ trỡnh kho sỏt, nghiờn cu thnh phn hoỏ hc v tỏc dng dc lý ca cỏc loi cõy Vit Nam nhm t c s khoa hc cho vic s dng chỳng mt cỏch hp lý, hiu qu nc ta, cỏc loi thuc chi Ipomoea tng i ph bin khp cỏc vựng v c nhõn dõn ta s dng nhiu i sng hng ngy lm thc phm cng nh lm thuc cha cỏc bnh n gin [5],[10] Do ú, vic nghiờn cu mt cỏch h thng trờn c s khoa hc v c tớnh sinh dc hc ca cỏc loi chi ny l vic lm cn thit v cú ý ngha ln thc tin Chớnh vỡ vy, chỳng tụi chn ti: Nghiờn cu tỏch chit v c tớnh sinh dc hc ca mt s hp cht t nhiờn t hai loi Ipomoea triloba L v Ipomoea pes-tigridis L. Mc ớch nghiờn cu Mc ớch nghiờn cu nhm gúp phn hiu bit thờm v c tớnh sinh lý, húa sinh v kh nng khỏng khun v cha bnh ca dch chit t hai loi Ipomoea triloba L v Ipomoea pes-tigridis L., to c s cho nhng hng nghiờn cu tip theo lnh vc tỡm kim cỏc phng thuc mi cng nh tỡm hiu tỏc dng ca cỏc loi tho dc sn cú thiờn nhiờn Nhim v nghiờn cu Phõn tớch thnh phn nh tớnh, nh lng ca dch chit t hai loi Ipomoea triloba L v Ipomoea pes-tigridis L., nghiờn cu hot tớnh khỏng vi sinh vt v th tỏc dng ca mt s phõn on dch chit i vi bnh bộo phỡ v T type i tng v phm vi nghiờn cu ti nghiờn cu trờn i tng mu thc vt Ipomoea triloba L v Ipomoea pes-tigridis L., mu ng vt Mus musculus Swiss v mu vi sinh vt E.coli v S.aureus Th hot tớnh khỏng vi sinh vt ca cỏc phõn on dch chit t c loi Ipomoea triloba L v Ipomoea pes-tigridis L Th kh nng iu tr bộo phỡ v tiu ng vi hai phõn on dch chit EtOH v EtOAc ca loi Ipomoea triloba L Phng phỏp nghiờn cu Nghiờn cu c tin hnh da trờn cỏc phng phỏp húa sinh v trờn mụ hỡnh chut gõy bnh thc nghim 10 Nhng úng gúp mi ca ti Cung cp dn liu khoa hc v thnh phn húa hc v hm lng cỏc nhúm hp cht hu c phõn on dch chit t hai loi Ipomoea triloba L v Ipomoea pes-tigridis L ng thi xỏc nh kh nng khỏng khun ca cỏc phõn on dch chit ú Phỏt hin kh nng h ng huyt v gim bộo phỡ ca hai phõn on dch chit t loi Ipomoea triloba L 59 3.3 TH NGHIM TRấN Mễ HèNH CHUT GY T THC NGHIM 3.3.1 To mụ hỡnh chut T mụ phng theo type Chut nht trng chng Swiss sau v bộo tun cú trng lng 45 50 gam trng lng ny, nng glucose huyt ca chut ó tng lờn trung bỡnh 7,9 mmol/l vt quỏ ngng bỡnh thng (6,4 mmol/l), chut ó bt u cú biu hin T nh Trc lm thớ nghim chut b nhn n 16 gi, sau ú tiờm mng bng streptozotocin (STZ) m citrat phosphate vi liu lng 90 mg/kg th trng gõy bnh T thc nghim mụ phng theo type Sau ú cho chut n ung theo ch bỡnh thng Sau 72 gi, nhng chut ny ó b T vi nng glucose huyt trung bỡnh trờn 20 mmol/l Kt qu ny cho thy tt c cỏc lụ chut sau tiờm STZ ó b T theo c ch type 3.3.2 Tỏc dng gim nng ng huyt ca cỏc phõn on dch chit 3.3.2.1 Tỏc dng gim nng ng huyt sau 10 gi iu tr Da trờn kt qu nh lng polyphenol tng s, chỳng tụi cho chut b T ung dch chit hai phõn on EtOH v EtOAc t loi bỡm bỡm ba thựy vi liu lng 1000 mg dch chit/1 kg th trng Trờn c s ú, chỳng tụi so sỏnh nng glucose huyt ca cỏc lụ chut cho ung dch chit vi lụ chut i chng (cho ung nc mui sinh lý) v lụ chut iu tr bng metformin (liu lng 50 mg/kg th trng) Sau 10 gi iu tr, kt qu thu c bng 3.5 v biu hỡnh 3.7 60 Bng 3.5 Nng glucose huyt ca cỏc lụ chut thớ nghim sau 10 gi iu tr (n v: mmol/l) Gi 0h 2h 4h 6h 8h 10h i chng 20,8 1,1 20,9 1,0 20,7 1,1 20,6 1,0 20,8 0,7 21,0 0,5 Ung cao 21,1 1,0 19,5 0,8 15,1 0,5* 13,6 0,7** 12,9 0,7** 12,7 1,0** 20,0 P EtOAc 0,9 15,4 0,9* 10,3 8,1 7,4 ** *** 1,6 0,4 1,5** Mu P EtOH Ung cao Ung Metf 20,9 6,0 0,6 1,4*** 5,2 1,1** Ghi chỳ: p>0,05; * Gim % ln gim nht 0,2 1,0 7,4** 35,1** 8,4 12,6*** 63,0*** 0,7** 5,7 5,9 6,0 15,0*** 71,7*** ** *** 1,1 0,6 0,3** p