Nghiên cứu chiết xuất acid amin từ saccharomyces cerevisiae

Câc acid amin trong tu nhiên dêu là acid L-amino acid trong dô câ hai nhôm chüc dêu gân vào carbon a.[15] Dua vào dâc tmh acid, base câc acid amin duoc phân biêt làm 3 nhôm: Nhôm acid am

BÔ Y TÉ TRITÔNG DAI HOC DlTOC HÀ NÔI

- Ngudi hüâng dân: PGS TS Tiï Minh Koông

- Nai thuc hiên: Bô mon Công Nghiêp dirac

Trucmg dai hoc Duçfc Hà Nôi

- Thôi gian thuc hiên: Tir thâng 11/ 2006 dén thâng 05/ 2007

là nhûng nguôi thày dâ hirông dân, giüp dà tôi rat tân tînh trong suôt quâ trînh thuc hiên luân vân.

Tôi xin chân thành câm on TS Dàm Thanh Xuân, câc thày cô cùng câc anh

chi kÿ thuât viên bô môn Công Nghiêp Dirac dâ luôn sàn long giüp dô, khich

lê và tao moi dieu kiên thuân lçfi cho tôi trong quâ trînh thuc nghiêm

Tôi xin güri lcfi câm cfn ban giâm hiêu nhà trucmg, phông dào tao và câc thày

cô giâo Truông Dai hoc Duçfc Hà Nôi dâ hét süc quan tâm và giüp dô tôi trong quâ trînh hoc tâp và nghiên cuxi

Cuôi cùng, tôi xin bày tô long biét on tôi nhüng nguôi thân trong gia dinh và ban bè dâ luôn tao diêu kiên thuân loi, dông viên, nhiêt tînh giüp dô tôi trong quâ trînh thuc hiên luân vân

MUC LUC

Trang bỵa phu

Ldi câm on

Mue lue

Chu giâi chù viêt tât

Danh mue câc bâng

Dang mue câc hỵnh

DAT VAN DE 1

PHÂNI - TƠNG QUAN 2

1 Dai cirtmg vè Saccharomyces cerevisiae 2

1.1 Câu tao, sinh sân và phât triën cüa Saccharomyces cerevisiae 2

1.2 Üng dung cüa Saccharomyces cerevisiae 3

1.2.1 Nhufng ung dung chung 3

1.2.2 (Jng dung trong lïnh vue Y-Duoc 4

1.3 Câc phuong phâp nuơi cây dé thu sinh khợ tir Saccharomyces cerevisiae 4

1.3.1 Sân xuât sinh khoi S cerevisiae tù glucose 4

1.3.1 Sân xuât sinh khoi S cerevisiae tùr glucose 6

1.4 Thu hơi sinh khoi Saccharomyces cerevisiae 7

2 Acid amin 7

2.1 Vai trô cüa acid amin trong dôfi song 8

2.2 Câc phuong phâp sân xuât acid amin 9

2.2.1 Phuong phâp tong hop hoâ hoc 9

2.2.2 Phuong phâp chiét xuât tù nguon nguyên lieu thiên nhiên lO 2.2.3 Phuong phâp lên men 10

2.2.4 Phuong phâp két hop 11

2.2.5 Phuong phâp chiét xuât tù sinh khoi nâm men 12

2.3 Phuong phâp tâch chiét và tinh ché acid amin 12

2.4 Dinh tmh và dinh hrong acid amin 14

PHÂNII - THITC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ 16

2.1- NGUYÊN VÂT LIEU VÀ PHUONG PHÂP THUC NGHIÊM 16 2.1.1 Nguyên lieu 16

2.1.2 Thiê'tbi 16

2.1.3 Câc môi truùng sü dung trong nuôi cây 17

2.2 PHUONG PHÂP NGHIÊN CÜU 18

2.2.1 Phuong phâp nuôi cây dé thu sinh khoi tir chüng S cerevisiae 18

2.2.2 Phuong phâp tu thuy phân tao acid amin tiï sinh khoi S cerevisiae 18

2.2.3 Phuong phâp thuy phân protid trong sinh khoi S cerevisiae sü dung enzym 18

2.2.5 Phuong phâp tinh che acid amin bàng côt trao doi ion 19 2.2.6 Phirong phâp dinh tînh và dinh luong acid amin bàng sac

kÿ long hiêu nâng cao (RP-HPLC) 20 2.3 KÊT QUÂ VÀ BÀN LUÂN 21

2.3.1 Khâo sât ânh huong cüa môi trucmg nuôi cây S cerevisiae

tôi khâ nàng tao sinh khoi 21 2.3.2 Khâo sât ânh huong cüa nông dô saccarose toi khâ nàng tao sinh khoi 23 2.3.3 Khâo sât ânh huong cüa nhiêt dô và thôi gian dén quâ

trinh tu thuy phân giâi phong acid amin tù" sinh khoi S cerevisiae 24

2.3.4 Khâo sât ânh hirông cüa ty lê nirôc dén quâ trinh tu phân 26

2.3.5 So sânh khâ nàng thuy phân sinh khoi S cerevisiae giüa

hai quâ trînh: tu phân và tu phân cô enzym 27 2.3.6 Khâo sât hàm luong papain dùng cho quâ trînh thuy

phân sinh khoi S cerevisiae 29

2.3.7 Tinh che acid amin bàng phuong phâp trao doi ion 31 2.3.8 Dinh tmh và djnh lirong acid amin trong dich tinh che bàng kÿ thuât sac kÿ long hiêu nàng cao (RP-HPLC) 33 KÊT LUÂN 36 A- Ket luân 36

Bâng 1 : Thành phân acid amin cüa protein à S cerevisiae 5

Bâng 2: Sân xuât acid amin tù câc tiên chat sinh tong hop 11

Bâng 3: Câc diêu kiên RP-HPLC dé tâch và xâc dinh 18 acid amin 21

Bàng 4: Thành phân pha dông chay sâc kÿ cô gradient 21

Bâng 5: Hàm luçmg sinh khoi khô à câc môi trucmg nuôi cây S cerevisiae 22

Bâng 6: Khôl luçmg sinh khoi khô S cerevisiae à câc nông dô

saccarose 23

Bâng 7: Hàm luçmg nito amin bien doi theo nhiêt dô và thdi gian tu

phân 25

Bâng 8: Hàm luong nito amin biên doi theo nhiêt dô và tÿ lê tu phân 26

Bâng 9: Hàm luçfng nito amin biên doi theo thdi gian cüa hai quâ

trînh: tu phân và tu phân cô papain 28

Bâng 10: Hàm luong nito amin biên doi theo khôl luçmg nhua du dû

tuoi dùng thuy phân sinh khoi S cerevisiae 30

Bâng 11: Hàm luçmg nito amin tinh ché qua côt trao doi ion 31

DANH MUC CAC BANG

DANH MUC HÏNH VÀ SO DO

Hînh 1 : Câ'u tao cüa té bào Saccharomyces cerevisiae 2

Hînh 2: Khoi luçmg sinh khoi S cerevisiae bién doi theo nông dô Saccarose 23

Hinh3: Dô thi biëu diën hàm luçmg nitcf amin bién doi theo nhiêt dô và thdi gian tu phân 25

Hînh 4: Hàm luçmg nito amin bién doi theo nhiêt dô và tÿ lê nuôc 27

Hînh 5: Hàm luçmg nito amin bién doi theo khôl luçmg nhua du dû tuai dùng thuy phân sinh khoi S cerevisiae 30

Hînh 6: Sâc dô 17 acid amin trong sinh khoi S cerevisiae 34

Set dô 1: Qui trinh sân xuât sinh khôl S cerevisiae tùr ri ducmg 6

Sa dô 2: Qui trînh sân xuât thu nghiêm acid amin tir S cerevisiae 35

DANH MUC CÂC CHÜ VIÊT TAT

AQC : 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamateECD : Công két diên tur

FID : Ion hoâ ngon lira

S cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae.

TCD : Detector dân nhiêt

DAT VAN DE

Sân xuât protein dcfn bào tù vi sinh vât dé cung câp nguon protein cho ngudi tù lâu dâ duçfc quan tâm và ûng dung vào dcfi sông Ngay trong thcfi ki

dai chién thé gidi lân thû nhâ't, à Duc nam men dâ duçfc dua vào qui trinh sân

xuât công nghiêp de phuç vu mue dfch dinh duàng Dén dai chién thé gidi lân thu" hai, khoâng 15.000 tan nam men dâ duçfc sân xuât môi nam nhàm phuc vu nhu càu protein cho binh lfnh và dân thudng Sau dô, Mÿ và Anh cüng quan tâm dén sân xuât sinh khoi nam men de phuc vu nhu càu chân nuôi công nghiêp Protein dcfn bào duçfc ûng dung trong chân nuôi làm thùc ân cho gia suc, gia câm thay thé câc nguon thirc ân chira protein cd chat luçfng cao nhu bot câ, bôt dâu tuorng dë sân xuât ra trirng, thit bô, lçm, gà dû tiêu chuàn mang lai hiêu quâ kinh té cao, ha gia thành sân phâm

Câc công trinh nghiên curu vè acid amin trong nam men dâ chirng minh ràng trong nam men cô chira dén 17 acid amin, trong do cd dày dû câc acid amin thiét yéu Diêu này rât cd y nghîa khi sü dung chüng làm thirc ân cho chân nuôi hay nghiên curu dé ché tao câc thuôc b6 duông phuc vu công dong Ngucfi ta không chî khi dm dau, bênh tât mà ngay câ khi khoè manh vân càn

bo sung acid amin dë dâm bâo duy tri sire khoè Vi vây nghiên cùu de sân

xuât acid amin tù sinh khoi nam men dâc biêt là sinh khdi S cerevisiae dë ùng

dung vào mue dfch y hoc vân côn là vân dê thdi su, hâp dân

Dê tài “Nghiên curu chiét xuât acid amin tù S cerevisiae” duoc tién

hành vdi câc nôi dung sau:

1 Khâo sât câc diêu kiên thuy phân té bào S cerevisiae tao acid amin.

2 Tâch chiét, tinh ché và xâc dinh thành phân, hàm luçfng câc acid amin trong dich thuy phân

3 Xây dung quy trînh sân xuât thir nghiêm acid amin tù S cerevisiae

PHAN I - TÔNG QUAN

1 Dai ciïong vè Saccharomyces cerevisiae

1.1 Câu tao, sinh sân và phât triën cüa Saccharomyces cerevisiae:

Saccharomyces cerevisiae cô càu tao don bào, phân bô' rông rai trong tir

nhiên, nhât là trong câc môi trucmg cô chuta ducmg, pH thâp nhu trong hoa

quâ, rau dua Te bào S cerevisiae cô dang hînh câu, hînh trumg, hînh ô

van, kfch thuôc té bào khoâng 2-15|j.m [5];[24], cô thành té bào câu tao bai

glucan và mannan giüp S cerevisiae chông chiu tôt vai diêu kiên ngoai cânh.

Chüng cô khâ nâng lên men nhiêu loai ducmg khâc nhau nhu saccarose, maltose, fructose và lactose câ trong diêu ki khf và hiéu khi

Hînh 1: Câu tao cüa té bào Saccharomyces cerevisiae.

Nhîn chung S cerevisiae sinh sân nhanh, té bào lai chira nhièu vitamin,

acid amin không thay thé, hàm luçfng protein chiém tôi 50% trong luçmg khô

té bào

* Phuong thüc sinh sân cüa S cerevisiae:

Nây chêi: là hînh thüc sinh sân don giân, phé bién nhâ't cüa S cerevisiae,

té bào me nây sinh ra mot chôi nhô roi lôn dân lên sau dô tâch ra, dôi khi té bào con vân cô thé dmh trên té bào me và lai tiép tue nây chôi; [5]

Sinh sân hûu tinh: do hai té bào cüa S cerevisiae két hop vôi nhau hînh

thành hop tü Hop tü phân chia thành câc té bào nâm trong nang, nang chm

duoc phât tan ra ngoài Néu hai té bào S cerevisiae cô hînh thâi, kich thuôc

giông nhau tiép hop vôi nhau goi là tiép hçfp dang giao, néu hai té bào cô hînh thâi, kich thuôc khâc nhau duoc goi là tiép hop di giao [5]

1.2 LJng dung cüa Saccharomyces cerevisiae:

1.2.1 Nhûrng ufng dung chung:

Nâm men và câc sân phâm cüa nô duofe sü dung trong câc ngành công

nghiêp, dâc biêt là trong công nghiêp thuc phâm và y hoc S cerevisiae duçfc

sü dung phé bién nhâ't vi nô cô dô an toàn sinh hoc cao Té bào S cerevisiae

cô hàm luçfng protein, vitamin cao, cô giâ tri dinh duông dac biêt nên thuefng duoc bo sung truc tiép vào thüc ân cho dông vât

Tù xa xua, loài nguôfi dâ biét sü dung S cerevisiae dë sân xuât câc loai

dô uông cô côn (ruou, ruçfu mùi, ruçfu vang, bia và nuôc giâi khât lên men, )

và trong công nghiêp sân xuât bânh mî, bânh ngot

S cerevisiae duçfc dùng dë sân xuât protein don bào vôi giâ thành thâp

làm thüc ân chân nuôi gia suc, gia câm thay thé câc nguon protein dât tiên nhu: bot câ, bot dâu tucmg dë cung câp thuc phâm dinh duông cao cho con nguefi mot câch giân tiép

1.2.2 Üng dung trong llnh vue Y-Duçrc.

Sinh khoi S cerevisiae duoc sü dung trong ngành Duoc dë ché tao ra

nhîîng duoc phâm qui giâ dùng diêu tri mot s6 bênh nhu chê' phâm dông khô

Bioflor, Ultra-Levue dë diêu tri môt sô bênh îa chày, rô'i loan tiêu hoâ à trè

em Nuôi cây S cerevisiae trong diêu kiên dâc biêt cô thé sân xuât câc hop

chât cô chüa selen hûu co sü dung trong y hoc dë chüa hàng loat bênh kë câ bênh ung thu [24]

Trong công nghê sinh hoc, té bào S cerevisiae duoc sü dung nhu mot

vector dë tâch dông nhân câc gen chuyên biêt sân xuât câc sân phâm sinh hoc

cô hoat tmh cao dë diêu tri câc bênh hiëm nghèo nhu: insulin, interferon, albumin huyét tuong nguôi, cytocrom P450 [4] Công trînh nghiên cüu phâ

vô té bào S cerevisiae dë thu nhân enzym superoxide dismutase - mot enzym

oxy hoâ khü cô tâc dung don câc gôc tu do, chông stress và chong lâo hoâ dang duçfc thuc hiên

1.3 Câc phuong phâp nuôi cây dë thu sinh khoi tiï Saccharomyces

cerevisiae

Trong công nghiêp dë sân xuât sinh khoi nâm men thucmg dùng S

cerevisiae Tuÿ theo diêu kiên hiéu khi hay ki khi mà ta cô câc sân phâm khâc

nhau Khi lên men ki khi S cerevisiae tao ra alcol ethylic, bién doi duông theo

phân üng: [11]

CnH22On + h2o - * C2H5OH + c o 2 + h2o

Trong diêu kiên lên men hiéu khi phuong trînh bién doi duông nhu sau:

1.3.1 Sân xuât sinh khoi S cerevisiae tir glucose.

Phuong trînh biëu diên su sinh truông cüa S cerevisiae trên glucose là:

732glucose +831 NADPH2+17 0 2+230 C 02 ► 100 g chât khô

S.cerevisiae+ 1408 NADH2 -1986 ATP +471 C 02

Hydrat carbon, protein, câc acid nucleic, lipid và câc muoi vô co tao nên gân nhu toàn bô vât chât té bào.

Hydrat carbon chiém 39,1% trong luong khô cüa té bào Trong dô cô mot disaccarit cô tên là trehaloza vôi hàm luçmg là 5%, côn lai là câc polisaccarit nhu glucan, glycogen, polimannan chiém 34,1%

Hàm luçmg protein trong té bào nâm men khoâng 39% bao gôm câ câc

axit amin tu do nâm à dang du trü Giâ tri trung bînh cüa câc axit amin trong

thành phân protein cüa nâm men duoc trinh bày ô bâng 1; [11]

Bâng 1 : Thành phân acid amin cüa protein à S cerevisiae

Acid amin

mmol/lOOgprotein

S.cerevisiae

Acid amin

mmol/lOOgprotein

S cerevisiae cô chüa trung bmh 10,8% axit nucleic và câc thành phân

nucleotid cüa chung Hàm luçmg ADN thâp, khoâng 0,3% nguyên lieu té bào, phân côn lai là câc loai ARN khâc nhau và câc nucleotid hoà tan

Hàm luçmg lipid toàn phân cüa nâm men là 8%, duoc chia thành câc lipid trung tmh(2,5%); glycerol phospholipid(4-5%), câc sterol tu do và câc este cüa chüng

1.3.2 Sàn xuât sinh khoi S cerevisiae tùr rî duômg.

Qui trînh sân xuât sinh khôi S cerevisiae tù rî ducmg nhu sau:

Sa do 1: Qui trinh sân xuât sinh khoi S cerevisiae tù rî ducmg.

Rî ducmg là phân ducmg không két tinh duoc sau khi dâ két tinh saccarose trong công nghê sân xuât ducmg tù mia hoâc tù cü câi ducmg

Rî ducmg duoc dùng làm nguyên lieu cho nhièu quâ trînh lên men, do giâ

thành rê so vôi câc nguyên lieu khâc, ngoài saccarose nô con chüa mot s6 chât

vô co, h Cru co và vitamin cô giâ tri, rî ducmg chüa 50% saccarose dao dông tù 3,5% dén 4,5% tuÿ theo nguyên liêu dùng ché ducmg [3]

Rî ducmg càn duoc xü lÿ truôc khi pha ché môi trucmg dë nuôi cây S

cerevisiae thu sinh khôi Thucmg duoc acid hoâ bàng acid sunfuric pH=4 và

nâng nhiêt dô lên 120-125°C trong 1 phüt dë giâm tap (chât màu, acid sunfuro, nitrat và nitrit, ) là nhûng chât cô hai cho nâm men Dông thôi bo sung thêm nhûng thành phân cân thiê't cho nâm men phât trién Rî dudng cüng

là môi trucmg tôt cho mot sô vi sinh vât la phât triën làm hông quâ trînh lên men nên môi trucmg pha chê' xong cân phâi duçrc khü trùng

1.4 Thu hôi sinh khoi Saccharomyces cerevisiae.

Trong công nghiêp dë thu hôi sinh khô'i S cerevisiae thucmg sù dung

phuong phâp loc ép hay li tâm vat dë loai môi trucmg, sau dô rüa bâng nuôc sach 2-3 lân dë loai toàn bô môi truông côn dmh bâm vào tê' bào nhâm không

cho câc tê' bào S cerevisiae côn cô thë lên men tiê'p.

2 Acid amin

Acid amin là don vi xây dung nên phân tù protein, trong câu tao phân tü

cô chüa nhôm -NH2 và -COOH

Câc acid amin trong tu nhiên dêu là acid L-amino acid trong dô câ hai nhôm chüc dêu gân vào carbon a.[15]

Dua vào dâc tmh acid, base câc acid amin duoc phân biêt làm 3 nhôm: Nhôm acid amin trung tmh nhu: leucin, isoleucin, valin Nhôm acid (câc aminoacid dicarboxylic) nhu: acid aspartic, acid glutamic, glutamin, Nhôm base (câc aminoacid diamin) nhu: arginin, lysin, histidin Khi hoà tan trong nucfc, acid amin ton tai trong dung dich duôi dang ion luông eue và cô thë tâc dông nhu mot acid (chât cho proton) hay mot base (chât nhân proton)

2.1 Vai trô cüa acid amin trong doi song

Protein là thành phân hûu cor chrnh, chiém khoâng 60-75% trong luçmg khô cüa ccf thë (Halver, 1998) Cô rât nhiêu loai protein khâc nhau, mâc dù chüng khâc nhau vê câu trüc, chüc nâng, thành phân hoâ hoc, kich thuorc phân tü, nhung khi bi thuy phân dêu giâi phông câc acid amin Nhu vây, acid amin là don vi câu tao cüa protein, tham gia vào quâ trinh sinh tong hop protein phuc vu cho quâ trînh sinh trucmg, sinh sân và duy tri su song cho co thë Cô khoâng 20 loai acid amin trong dô cô 8 acid amin thiét yéu (bât buôc phâi duorc cung câp tü thüc ân) dô là isoleusin, leusin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan, valin và lysin Côn câc acid amin khâc duçfc goi là acid amin không thiét yéu co thë tu tong hop duoc

Ngoài chüc nàng làm nguyên lieu cho tong hçrp protein, câc acid amin con là nguyên lieu sinh tong horp nhiêu chât cô chüc nàng sinh hoc khâc trong

co thë nhu câc base purin, base pyrimidin, mot so vitamin Câc acid amin vào

co thë néu không duoc sü dung hét dë tong hop protein và câc chât khâc thî cô thë bi thoâi hoâ Câc con ducmg thoâi hoâ cüa acid amin thuông dài và phüc tap, tao ra mot so chât trung gian cô chüc nâng doi vôi té bào

Câc acid amin cüng tham gia vào nhiêu quâ trînh chuyën hoâ trong co thë và giü câc chüc nàng sinh hoc quan trong nhu tong hop câc chât dân truyên thàn kinh, dâm bâo süc khoè và tâng cuômg chüc nàng bînh thucmg cüa tim, phuc hôi cor quan bâo vê tu nhiên cüa cor thë, nhât là hê thông tiêu hoâ, cung câp nguon nàng luçmg Ngucri ta dâ chüng minh duoc vai tro cüa mot sô acid amin eu thë Acid glutamic giü vai trô quan trong trong chuyën hoâ té bào thàn kinh và nâo Methionin cô tâc dung bâo vê dâc hiêu té bào gan, ha

lipid mâu Arginin tham gia vào chu trînh ure à gan nên cô tâc dung diêu hoà,

tong hçrp protid trong co thë Cystein giüp làm dep da và toc, lysin giüp co thë

tâng trucmg, phât triën do hô tro hâp thu canxi và phospho à hê tiêu hoâ, thüc

dây quâ trînh tâng truông cüa trè

Vôi nhûng vai trô sinh hoc quan trong trên, acid amin ngày càng duoc üng dung rông râi trong viêc bâo vê và tàng cuông sûc khoè cho con nguôi Câc loai thûc ân giàu acid amin thiét yéu duoc sü dung nhu câc liêu phâp chüa bênh Theo David Kessler trong "Thüc ân chüa bênh" thi bf dô chüa câc vitamin và chât khoâng cùng nhûng acid amin cân thiét nhu alanin, glycin, glutamin, cô thë giâm triêu chüng cüa bênh phi dai tuyên tiên liêt Ngày nay câc sân phâm tù dâu nành dang duoc dânh giâ cao vê khâ nâng dinh duông Trong dâu nành cô casein gàn giông casein cüa sûa bô, vôi su hiên diên cüa câc acid amin quan trong nhu lysin, glycin, histidin, alanin, arginin, acid aspartic và cystein trong khi dô cystein không cô trong sûa bô Câ hôi, bào ngu trô thành nhûng thûc ân quÿ giüp tâng cuông thë lue, giâm stress, tàng sûc dê khâng và cùng cô tinh thân nhô hàm luçmg acid amin cao

Ngành công nghiêp Duoc dang cô gang dâp üng nhu câu chüa bênh bâng acid amin vôi hàng loat câc duoc phâm tù acid amin Biêt duoc Lobamin (hoat chât là methionin) rât duoc ua chuông dë giâi dôc gan Thuôc bô chüa câc acid amin duofe dùng nhàm bô sung câc acid amin thiét yéu mà co thë thiéu hut Dynamogen là sân phâm phôi hofp hai hoat chât glutodin và arginin aspartat cô khâ nàng ngân chân suy nhuçrc co thë và kich thich ân ngon miêng Riêng lysin - môt acid amin cô trong nhiêu loai thuôc bô, dâc biêt duofe bô sung vào sûa bôt, ché phâm dinh duông, nô không chî dông vai trô bô trçr chât dinh duông mà côn tham gia vào nhiêu phân üng chuyën hoâ trong co thë dë câi thiên tinh trang goi là suy nhuoc chüc nâng Hiên trên thi truông xuât hiên nhiêu loai thuôc chüa hôn hofp acid amin nhu Lysivit, nutroplex, Hydrosol

cô tâc dung kich thich su thèm ân cüa trè, câc dang dich truyên morianmin Forte, morihepamin, glucema, nevamiyu chûa dây dü câc acid amin

2.2 Câc phiromg phâp sân xuât acid amin.

2.2.1 Phuomg phâp tong horp hoâ hoc.

Phuong phâp này dua trên câc phân üng hoâ hoc dë tông hop câc acid amin tù nguôn khi thâi công nghiêp dâu hoâ hoâc môt sô ngành khâc

Vf du: à Nhât nàm 1932 dâ tong hop duoc 300 tan acid glutamic, prolin

v.v tù cracking dâu hoâ, tù furfurol tong hçrp ra prolin, lysin[7]

Uu diëm cüa phuong phâp này là cô thë sü dung nguon nguyên liêu không phâi thuc phâm dë sân xuât và tân dung câc phé liêu cüa công nghiêp dâu mô Sân xuât 6n dinh, cô thë tiêu chuân hoâ dièu kiên sân xuât và dâm bâo hiêu suât ft thay d6i Tuy nhiên, nô cô nhuoc diëm tao ra câc acid amin dang racemic (hôn hop câ hai dang D và L) mà trong dô co thë chî sü dung acid amin dang L nên viêc phân riêng dông phân DL thành D và L rât phüc tap

2.2.2 Phircmg phâp chiét xuât tùr nguon nguyên liêu thiên nhiên

Là phuong phâp sü dung tâc nhân xüc tâc là câc hoâ chât hoâc enzym dë thuy phân mot nguon nguyên liêu chüa protid nào dô tao ra mot hôn hofp acid amin

Phuong phâp này cô uu diëm dê không ché quy trinh sân xuât và âp dung duçfc vào câc co sôf thü công hoàc câc dây chuyën thiét bi hoàn chînh Nhung lai cô nhuofc diëm là hiêu suât thâp dua dén giâ thành cao

2.2.3 Phuorng phâp lên men.

Phuong phâp này sü dung môt sô vi sinh vât cô khâ nâng siêu tong hop câc acid amin tù câc nguon glucid và dam vô co Dây là phuong phâp sân xuât hiên dai, giâ thành thâp

Nguyên tâc cüa phuong phâp là nuôi cây mot vi sinh vât nào dô trong môi truôfng thfch hop, vi sinh vât cô khâ nâng sinh tong hofp acid amin vôi hiêu suât cao trong câc thiét bi lên men Sau dô chiét xuât dë thu acid amin

Vf du: nâm 1956 Shukuo và Kinoshita sü dung chüng Micrococcus sân xuât glutamat tù môi truôfng cô chüa glucose và amoniac Hiên nay, mot sô

loài vi sinh vât khâc cüng duçfc sü dung nhu nuôi vi khuân Corynebacterium

dë tao acid aglutamic, Micrococcus glutamicus cho lysin, tryptophan [7]

Uu diëm chfnh cüa phuong phâp là chî cho acid amin dang dông phân L

là dang acid amin cô giâ tri sinh hoc cao Ngoài ra so vôi hai phuong phâp

trên, phucmg phâp lên men con cô nhiêu uu diëm noi trôi hom là không sü dung nguyên liêu protid, không cân sir dung nhiêu hoâ chât và thiét bi ân mon Cho hiêu suât cao, giâ thành ha.

2.2.4 Phirong phâp kët hop

Dây là phuong phâp két hçrp giùa tong hop hoâ hoc và vi sinh vât hoc Trong dô ngudi ta sur dung câc chât tiên chât cua acid amin bàng phuong phâp tong hçrp hoâ hoc roi sau dô chuyën chât này thành acid amin tucmg ûng nho

câc vi sinh vât nhât dinh Acid amin thu duoc là câc acid amin à dang L là chu

yéu

Theo Soda nâm 1983 mot sô acid amin duçrc sân xuât bàng phuong phâp

két hop chî ra à bâng 2 [3].

Bâng 2: Sân xuât acid amin tù câc tiên chât sinh tong hop

Isoleucin Serratia marcescens

Bacillus subtilis Corynebacterium sp

Serratia marcescens Brevibacterium, Corynebacterium

M icrococcus,Enterobacter

DL- a-Aminobutirat DL- a-Aminobutirat DL- a-Aminobutirat D-Threonin

DL- a-Bromobutirat DL- a-hydroxybutirat

Methionin Pseudomonas denitrifficans

2-hydroxy-4-methyl-tiobutiratPhenylalanin Pseudomonas denitrifficans 2- hydroxy-3-

phenylpropionatSerin Corynebacteriumglycinophilum

Pseudomonas sp Arthrobacter globiformis Sarcina albida,N ocardia butanica

GlycinGlycinGlycinGlycin

Bacillus subtilis Proteus rettgeri

GlycinL-HomoxerinL-HomoxerinTryptophan Enterobacter

Claviceps purpure Hansenula anomala

DL-HomoxerinIndol

Acid antranilic

Co sô khoa hoc cüa phuong phâp này dira vào trong quâ trinh trao doi chât cüa vi sinh vât cô khâ nâng tfch luÿ acid a -cetonic trong môi truông.

Phuong phâp dùng vi sinh vât dé chuyén tièn châ't cüa acid amin thành acid amin tirong üng là mot phuong phâp cô nhiêu triën vong vi nguyên liêu don giân, ré tiên, nguyên liêu ban dàu dâ duoc tiêu chuân hoâ, quy trînh xây

ra nhanh voiï hiêu suât cao, sân phâm thuân nhât

2.2.5 Phuong phâp chiét xuât tir sinh khô'i nam men.

Là phuong phâp thuÿ phân sinh khôi nam men (cô thé nuôi cây tao sinh khôi tir S cerevisiae hoac lâ'y truc tiép sinh khôi cüa nhà mây bia) thu duoc môt hôn hop dày dü câc acid amin Câc acid amin duoc tao nên tù dich thüy

phân à dang hoà tan sau dô dùng phuong phâp thich hop dé tâch và chuyén thành dang tinh thé, dang bôt hay chê' phâm thô tuÿ thuôc à mue dfch sü dung Phuong phâp này cô uu diém hon han câc phuong phâp khâc à chô

nguyên liêu sinh khôi nam men rât giàu acid amin dâc biêt chiia dày dü câc acid amin thiét yêu, chi phi rè, ft gâp khô khân trong quâ trinh sân xuât do không phu thuôc nhiêu vào khi hâu, thôi tiêt

2.3 Phuong phâp tâch chiét và tinh che acid amin.

Dé tâch câc acid amin ngueti ta cô thé sü dung phuong phâp:

* Sac ky giây : dô là phuong phâp dua vào su khâc nhau vê hê sô phân bô

câc chât tan gifla hai pha long không trôn lân Hôn hop acid amin duoc châm

à dàu bân giây sâc kÿ Trong quâ trinh di chuyén trong hê dung môi câc acid

amin së chuyén dông vôi vân tôc khâc nhau Kê't quâ cüa quâ trînh tâch dô ta thu duoc câc acid amin tinh khiét Tôc dô di chuyén cüa câc acid amin này tuÿ thuôc vào diên tfch, trong luong phân tü, tinh chât vât lÿ cüa môi acid amin Câc acid amin sê bi kéo theo vôi tôc dô khâc nhau roi tâch ra [16] Dây là

phuong phâp cô dién hiên nay ft duoc dùng vi su xuât hiên cüa nhiêu phuong

phâp hiên dai hon vôi dô nhay cao hon

* Sac kÿ khi (GC): cüng là mot trong nhûng phuang phâp duac üng dung

rông râi dé tâch acid amin bai tmh uu viêt cüa nô là nàng lue phân giâi, dô nhay cao, dé thuc hiên và ré tiên Trong sâc kÿ khf pha dông thucmg là khf tra, mâu phân tfch duac dua vào côt và quâ trînh rüa giâi duac thuc hiên nhô dông khf tra qua côt sàc kÿ Chât phân tfch trong dông pha dông khi dê'n detector duac phât hiên dua trên su thay doi tmh chât vât lÿ, tmh chât riêng biêt nào dô khi rûa giâi Nguôi ta cô thé sur dung: Detector dân nhiêt TCD (Thermal Conductivity Detector);- ion hoâ ngon lira FID (Flame Ionisation Detector); nita phospho NPD (Nitrogen Phosphorus Detector ); công két diên tü ECD (Electron Capture Detector) [20]

* Trong gàn 40 nàm qua, chiét tâch acid amin dâ duac thuc hiên phân lôn

bàng phuang phâp “sac ky trao doi ion Sàc kÿ trao doi ion dua vào lue hut cüa chât tan và vi tri mang diên tfch trên pha tmh Chât trao doi anion cô nhôm mang diên tfch duang trên pha tïnh hüt anion chât tan Chât trao doi cation cô nhôm mang diên tfch âm hüt cation chât tan Nhua trao doi ion duac

sü dung là loai trao doi anion hay trao doi cation, tuÿ thuôc vào thành phân và bân chât cüa câc acid amin Rüa giâi bang câch thay doi hàm luang muôi hoàc

pH cüa dung dich Dây là loai quy trînh tuang doi tiên tien, cô chu kÿ thô ché acid amin tuang dôl ngàn, thiét bi ft tiêp xüc vôi môi trucmg acid manh, dâm bâo vê sinh thuc phâm và an toàn lao dông Tuy nhiên tinh chê' bàng phuang phâp trao doi ion lai gàp khô khàn trong viêc sân xuâ't cationit, yêu câu kÿ thuât lai cao môi dâm bâo hiêu suât thu hôi acid amin cao Hiên nay, nuôc ta chua cô diêu kiên âp dung vào sân xuât công nghiêp nhung dâ duçfc âp dung

rông râi à mot sô nuôc nhu Trung Quôc, Nhât Bân, [19]

* Phuang phâp truyên thông duac Moore và Stein dua ra và phât trién dé

tâch và xâc dinh câc acid amin bang “sac kÿ trao doi ion dùng dân xuât sau

côt” (Ninhydrin hoàc O-phtalaldehyd) dâ duac üng dung trong 40 nàm qua

Phuang phâp này sau này duac phât trién và üng dung nhiêu han trong câc nhà mây nhô üng dung sâc kÿ long hiêu nàng cao pha dâo (RP-HPLC) [17];[18];[21]

Ngoài nhîîng phuong phâp trên cô thë sur dung nhîîng phuong phâp khâc nüa dë chiêt tâch và tinh che acid amin nhu phuong phâp dua vào diëm dang diên, phuong phâp ly tâm, phuong phâp diên d i Môi phuong phâp cô nhîîng

uu diëm và han chê' riêng trong dô phuong phâp trao doi ion vân duoc lua chon nhiêu nhàt dë chiêt tâch acid amin boi nhîîng uu diëm noi trôi cûa nô

2.4 Dinh tînh và dinh luong acid amin:

* Cô thë sûr dung “phuong phâp diên di ” và “sac kÿ giâÿ ” dë dinh tmh

câc acid amin Nhîîng phuong phâp này hiên nay ft duoc su dung do khâ nàng tâch thành tùng acid amin riêng biêt trong hôn hop acid amin côn yëu

* Trong nhûng nâm gàn dây, viêc dinh tmh và dinh luofng acid amin chu

yëu duçfc thuc hiên trên “phuong phâp sâc ky long hiêu nâng cao (HPLC)” Trong kÿ thuât HPLC, cân bàng dông xây ra à trong côt tâch sâc kÿ giüa pha

tînh và pha dông Nô là su vân chuyën và phân bô cüa chât tan (hôn hofp mâu) theo tùng lôp qua chât nhôi côt (pha tînh) Trong quâ trînh dô chât tan luôn duçfc phân bô lai giüa hai pha khi pha dông luôn chay qua côt vôi toc dô nhât dinh Khi mâu phân tich duçfc bom và di qua côt, tai côt do su tuong tâc giüa pha tînh (chât trong côt) pha dông và chât phân tich làm cho câc chât phân tich ra khôi côt vôi thôi gian khâc nhau Sau khi ra khôi côt câc chât duçfc dinh tmh và dinh luçfng thông qua hê thô'ng detetor và bô phân xü lÿ kët quâ [25]; [22] Pha dông trong sâc kÿ long hiêu nàng cao thucfng là hai dung môi hoà tan vào nhau dë cô khâ nâng tâch vôi dô phân giâi phù hofp Cô hai câch dùng pha dông rüa giâi: thành phân pha dông không thay doi trong quâ trînh sâc kÿ (dang dông) hoàc pha dông là hôn hofp dung môi, thucfng là 2-4 loai duofe dung trong câc bînh khâc nhau, tÿ lê câc thành phân thay doi trong quâ trînh sâc kÿ theo chucfng trînh dâ dinh (gradient) Phât hiên chât phân tich dua vào detector Trong phân tich acid amin bàng HPLC chü yëu sü dung detector huÿnh quang Loai detector này chon loc và nhay hcfn (cô thë dën 1000 lân

chât thcrm da vông, dân chât quinoline, steroid, alkaloid Cô thé dùng thuoc thü tao huÿnh quang dé làm dân chât hoâ ( truôc côt hoac sau côt) cüa chât phân tfch Phuong phâp dân xuât truôc côt duoc âp dung dé phân tfch acid amin két hçfp vôi sâc kÿ long pha dâo (RP-HPLC) dâ dem lai nhiêu loi fch quan trong và mot phân thay thé cho câc phuong phâp phân tfch câc acid amin

co diën Üu diëm noi bât cüa nô là dô nhay cao, linh dông, cho két quâ cô dô tin cây cao Nguôi ta dâ sü dung môt sô thuôc thü de tao dân xuât truôc côt vôi acid amin nhu: 4-(aminosulfonyl), OPA (O-phthaldialdehyde), 9- fluoenylmethyl Chloroformate (FMOC-C1) [17],[22],[25]

Nhîn chung, hiên nay trong câc Labor cüa câc viên nghiên cüu cüng nhu câc bô phân kiëm nghiêm sân xuât hâu hét dèu sü dung dân xuât truôc côt két hop phuong phâp RP-HPLC dé phân tfch dinh tfnh và djnh luçmg acid amin nôi riêng và câc hoat chât khâc nôi chung Phuong phâp dâ mang lai rât nhiêu thành công to lôn cho nghiên cüu và sân xuât