TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ------------------------- NGUYỄN THỊ KIM DUNG XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ GIỮA GIỐNG CHO (KC25) VÀ GIỐNG NHẬN (OM6976) QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền học Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo.Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Đăng Khánh là ngƣời thầy đã hƣớng dẫn tận tình, tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Nhƣ Toản và các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2, những ngƣời đã truyền đạt cho tôi những kiến thức và phƣơng pháp nghiên cứu quý báu trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị tại Viện Di truyền Nông nghiệp, bộ môn Kĩ thuật di truyền đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện giúp tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu tại viện. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và những ngƣời luôn quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua. Trong thời gian hoàn thành khóa luận, do lần đầu tiên tiếp cận với nghiên cứu khoa học và hạn chế về mặt thời gian nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Kim Dung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận này đƣợc hoàn thành là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, những số liệu trong khóa luận là trung thực, không sao chép, không trùng lặp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Kim Dung DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MAS Marker Assisted Selection QTL Quantitative Trait Locus PCR Polymerase chain reaction ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic RADP Random Amplified Polymorphic DNA AFLP Aplified Fragment Length Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single nucleotide polymorphism RGA Resistance Gene Analog SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Site NST Nhiễm sắc thể CTAB Cetyl trimetyl ammonium bromit DANH MỤC BẢNG Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .......................................................... 25 Bảng 2.3. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR......................................... 26 Bảng 3.1. Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống OM6976 và KC25.......... 33 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1. Một số hình ảnh kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp CTAB trên gel agarose 0,8%. ............................................................................ 30 Hình 3.2. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM2108; RM10916; RM24865 ................................................ 31 Hình 3.3. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM22825 .............................................. 32 Hình 3.4. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345.................................................................. 33 Hình 3.5 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM3482; RM3628; RM3625; RM3654; RM3753 .................... 34 Hình 3.6 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11745; RM11799; RM11874; RM20163; RM20192 .......... 35 Hình 3.7 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM31; RM 148; RM 296; RM 247; RM282 ............................. 35 Hình 3.8 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM10115; RM10649; RM10681; RM10694A;RM10694; RM10720 ......................................................................................................... 36 Hình 3.9 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM10741; RM10782; RM10806; RM10815; RM10820 .......... 36 Hình 3.10 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM16589; RM16820; RM17391; RM17411; RM09034 .......... 37 Hình 3.11 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11438; RM12769; RM13197; RM13332; RM14795; RM14820 ......................................................................................................... 37 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1.Lí do chọn đề tài. .................................................................................... 1 2.Mục đích nghiên cứu................................................................................ 2 3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 1.1. Nguồn gốc, phân bố địa lý và vai trò của cây lúa................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố địa lý ............................................................ 3 1.1.2. Vai trò của cây lúa............................................................................ 3 1.2. Chỉ thị phân tử ..................................................................................... 4 1.2.1 Khái niệm ........................................................................................ 4 1.2.2.Phân loại chỉ thị ................................................................................ 5 1.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền .......... 12 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ......................................... 14 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc: .................................................. 14 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .................................................... 20 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................ 23 2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................... 23 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 23 2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số ............................................. 23 2.3.2. Phƣơng pháp PCR với mồi thí nghiệm............................................ 25 2.3.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% .................................... 26 2.3.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính .................. 27 2.4. Điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ........................................... 29 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 30 3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA.............................................................. 30 3.2. Khảo sát đa hình trên 12 NST giữa giống cho và nhận QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông ......................................................... 31 3.3 Thảo luận ........................................................................................... 37 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 40 MỞ ĐẦU 1.Lí do chọn đề tài. Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực chính của 2/3 dân số thế giới, đóng vai trò đảm bảo an ninh lƣơng thực toàn cầu.Tình hình sản xuất lúa gạo nƣớc ta ngày càng phát triển, chất lƣợng và sản lƣợng tăng đều qua từng năm do cải thiện nguồn giống, nâng cao kĩ thuật trồng trọt và có nhiều biện pháp phòng chống sâu bệnh. Tuy nhiên, dƣới áp lực của bùng nổ dân số, đô thị hóa, công nghiệp hóa, diện tích đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp. Thêm vào đó, biến đổi khí hậu cũng đang là mối đe dọa lớn của nhân loại trong thế kỷ 21. Biến đổi khí hậu dẫn đến sự thay đổi thất thƣờng của các yếu tố thời tiết cực đoan (hạn hán, lũ lụt, mƣa đá,...) ảnh hƣởng trực tiếp đến sản lƣợng lúa gạo của Việt Nam trong tƣơng lai. Chính vì vậy, trong các nghiên cứu về lúa gạo hiện nay việc xác định tính trạng liên quan đến năng suất lúa đƣợc quan tâm, đặc biệt là tính trạng tăng năng suất ở lúa. Yếu tố cấu thành năng suất đƣợc quy định bởi một số nhân tố chính: Số bông trên khóm; số hạt trên bông và khối lƣợng nghìn hạt. Trong đó, tính trạng số hạt trên bông của lúa là một tính trạng số lƣợng chịu ảnh hƣởng của nhiều gen khác nhau và ảnh hƣởng của tƣơng tác môi trƣờng. Bởi vậy việc chọn lọc các giống tính trạng cải tiến tăng số hạt trên bông bằng phƣơng pháp truyền thống là vô cùng khó khăn, tốn kém và không có hiệu quả cao. Những năm gần đây, do sự phát triển không ngừng của Công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã thiết lập đƣợc một số bản đồ phân tử cho các tính trạng số lƣợng của lúa. Đối với tính trạng số lƣợng hạt trên bông bằng chỉ thị phân tử, các QTL (Quantitative Trait Locus – các locut gen của tính trạng dựa trên liên kết với marker phân tử) trên gen quy 1 định tính trạng tăng số hạt trên bông đã đƣợc định vị trên bản đồ NST ở lúa và đã đƣợc thiết lập cùng với hơn 400 chỉ thị phân tử khác nhau. Phƣơng pháp chọn tạo giống theo hƣớng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS (Marker Assisted Selection) sử dụng chỉ thị phân tử (marker) liên kết chặt với gen quan tâm có nhiều ƣu điểm hơn so với những phƣơng pháp truyền thống. Tiềm năng của việc sử dụng chỉ thị phân tử đã rút ngắn đƣợc thời gian chọn tạo giống, đánh giá đƣợc đa dạng di truyền, nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng khó, có thể loại bỏ đƣợc ảnh hƣởng của nhân tố môi trƣờng trong quá trình chọn lọc. Do đó để góp phần bổ đóng góp vào các nghiên cứu về cải tiến tiềm năng năng suất lúa, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài : “Xác định chỉ thị phân tử giữa giống cho (KC25) và giống nhận (OM6976) QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông”. 2.Mục đích nghiên cứu. Xác định chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho (KC25) và giống nhận (OM6976) QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông góp phần trong chọn tạo và cải tiến giống lúa tăng năng suất. 3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Xác định các chỉ thị phân tử đa hình giữa dòng/giống cho gen và dòng/giống nhận gen trên 12 nhiễm sắc thể phục vụ chọn lọc nền di truyền giống nhận gen, để làm cơ sở cho việc chọn tạo các giống lúa năng suất cao. Ý nghĩa thực tiễn Sau khi nghiên cứu sẽ xác định đƣợc các chỉ thị cho đa hình giữa giống cho QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông giữa dòng choKC25 và dòng nhận gen (OM6976). Các chỉ thị đa hình này sẽ đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền của các cá thể con lai trong các quần thể nghiên cứu tiếp theo. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Nguồn gốc, phân bố địa lý và vai trò của cây lúa 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố địa lý Quê hƣơng của cây lúa (Oryza sativa L.), không nhƣ nhiều ngƣời vẫn thƣờng nghĩ là ở Trung Quốc hay Ấn Độ, mà là ở vùng Đông Nam Á, vì vùng này khí hậu ẩm và là điều kiện lí tƣởng cho phát triển nghề trồng lúa. Theo kết quả khảo cổ học trong vài thập niên qua, quê hƣơng đầu tiên của cây lúa là vùng Đông Nam Á và Đông Dƣơng, những nơi mà dấu ấn của cây lúa đã đƣợc ghi nhận là khoảng 10.000 năm trƣớc Công Nguyên [1]. Từ Đông Nam Á, nghề trồng lúa đƣợc du nhập vào Trung Quốc, rồi lan sang Nhật Bản, Hàn Quốc, những nơi mà cƣ dân chỉ quen với nghề trồng lúa mạch. Đối với việc phân loại lúa trồng, nhiều nỗ lực đã đƣợc tiến hành tập trung chủ yếu vào loài lúa trồng châu Á, bởi nó là nguồn lƣơng thực chính của hơn một nửa dân số thế giới. Đây là loại cây lƣơng thực chính có lịch sử trồng trọt lâu đời tại châu Á. Ngày nay lúa đã đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều vùng trên thế giới; kể cả Bắc và Nam Mỹ, châu Âu và châu Phi, trải rộng từ vùng xích đạo cho đến các vùng thuộc vĩ tuyến 50 0 Bắc và xa hơn nữa. Lúa có thể trồng thậm chí tại những vùng có độ cao tới 2.600m. Chính những điều kiện môi trƣờng tự nhiên khác biệt này cùng với các phƣơng thức trồng trọt khác nhau đã góp phần tạo ra các kiểu sinh thái mới và các giống lúa mới có khả năng thích nghi khác nhau. 1.1.2. Vai trò của cây lúa Lúa là một trong năm loại cây lƣơng thực chính của thế giới, cùng với ngô (Zea Mays L.), lúa mì (Triticum sp. Tên khác: tiểu mạch), sắn (Manihot esculenta Crantz, tên khác: khoai mì) và khoai tây (Solalum tuberosum L.). Theo quan niệm xƣa, lúa cũng là một trong sáu loại lƣơng thực chủ yếu trong 3 Lục cốc. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, thế giới có khoảng 1561 triệu ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lƣợng là 6979 triệu tấn, 90% diện tích này thuộc các nƣớc Châu Á với 651 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản lƣợng lúa gạo trên thế giới. Ở việt Nam, lúa là nguồn lƣơng thực chủ yếu của hơn 89 triệu dân với diện tích khoảng 6493 triệu tấn đứng thứ 2 thế giới về xuất khẩu gạo sau Thái Lan. Ƣớc tính năm 2001 sản xuất khoảng 41,05-41,5 triệu tấn. Nƣớc ta có 2 vùng trồng lúa chính là Đồng bằng Sông Cửu Long diện tích 3,79 triệu ha chiếm 50% sản lƣợng và Đông bằng Sông Hồng diện tích 1,18 triệu ha 17% sản lƣợng.[2] 1.2. Chỉ thị phân tử 1.2.1 Khái niệm Trong một vài thập kỷ vừa qua, chúng ta đã chứng kiến sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, đặc biệt là quá trình phát triển nhanh chóng trong lĩnh vực di truyền học phân tử đã cho ra đời nhiều kỹ thuật phân tích biến dị di truyền đạt kết quả cao. Trong đó, chỉ thị phân tử đƣợc xem là công cụ rất hiệu quả để đánh giá đa dạng sinh học phục vụ công tác chọn giống cây trồng [6]. Chỉ thị phân tử có thể hiểu đơn giản chúng nhƣ những “cột mốc” nằm trên trình tự ADN trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tƣơng đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống, loài trong một quần thể. Sinh vật có khả năng nhân bản ADN của chúng với độ chính xác cao nhƣng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm thay đổi cấu trúc ADN, đơn giản nhƣ sự thay đổi bắt cặp hoặc phức tạp hơn nhƣ sự đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc mất đoạn… Do đó chỉ thị phân tử đƣợc xem là công cụ cực kì hiệu quả trong việc đánh giá tính đa dạng sinh học phục vụ cho công tác nghiên cứu di truyền và chọn giống cây trồng. 4 Chỉ thị phân tử cho phép xác định đƣợc các đặc điểm trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định trình tự nhất định của gen hoặc các trình tự liên kết chặt với các gen mang tính trạng mong muốn. Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen trên, con ngƣời đã đi thẳng vào bản chất di truyền của các tính trạng, khắc phục đƣợc ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng, theo dõi và phát hiện các gen mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ ngay cả khi chƣa có sự biểu hiện ra kiểu hình. 1.2.2. Phân loại chỉ thị Trƣớc kia, khi số lƣợng các chỉ thị di truyền còn rất hạn chế, ngƣời ta phân loại chỉ thị di truyền thành 2 nhóm. Đó là: 1/Chỉ thị hình thái 2/Chỉ thị phân tử Tuy nhiên, từ cuối thế kỷ 20, khi mà chỉ thị ADN ngày càng trở nên phổ biến và lấn át các chỉ thị di truyền khác, ngƣời ta phân loại lại chỉ thị di truyền thành 3 nhóm cụ thể: 1/Chỉ thị hình thái 2/Chỉ thị hóa sinh 3/Chỉ thị phân tử ADN (hay gọi tắt là chỉ thị phân tử). 1.2.2.1 Chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy hoặc đo đếm đƣợc. Những tính trạng hình thái thƣờng do những gen đơn lẻ điều khiển. Một số kiểu hình đột biến nhƣ bệnh bạch tạng, siêu lùn hay những ảnh hƣởng có hại về mặt nông học là những đặc tính cần phải nhận biết và loại bỏ trong chƣơng trình chọn giống. Chỉ thị hình thái thƣờng dễ nhận biết ở dạng trội - lặn. Biểu hiện của chúng phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn sinh trƣởng phát triển của cá thể. Việc lập bản đồ gen và chọn lọc nhờ marker hình thái nhƣ vậy sẽ rất chậm. Số lƣợng marker quá ít và chỉ có ở quy mô hình thái (cơ quan). Vì thế 5 cho đến nay các nhà chọn giống ít sử dụng loại chỉ thị này mà chuyển sang sử dụng các chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN [3]. 1.2.2.2. Chỉ thị sinh hóa Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị cơ bản, đa hình protein bao gồm chỉ thị isozym và các loại protein dự trữ. Các protein khác nhau có khối lƣợng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau, vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện di trƣờng một chiều hay hai chiều tạo ra những đặc điểm đặc trƣng trên gen điện di và có thể hiển thị bằng phƣơng pháp nhuộm. Những chỉ thị sinh hoá chỉ thể hiện ở những giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển cá thể tuỳ thuộc vào cơ chế phức tạp của sự đóng mở gen. Cơ chế này cũng đƣợc điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN. Bất kỳ một protein nào có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai đoạn nào của sự phát triển cá thể thì cũng chỉ là sản phẩm của gen thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN ARN - Protein [4]. Chỉ thị protein và isozym thuộc loại đồng trội, có độ tin cậy cao. Tuy nhiên do có số lƣợng ít và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của cá thể, nên các chỉ thị protein và isozym đƣợc ứng dụng tƣơng đối hạn chế. 1.2.2.3 Chỉ thị phân tử ADN Bert Collard & David Mackill đã trình bày về chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử, dựa trên cơ sở khoa học là tất cả cơ quan sống đƣợc hình thành từ các tế bào đƣợc điều khiển bằng vật liệu di truyền gọi là ADN. Chỉ thị phân tử không xem xét nhƣ các gen bình thƣờng khi chúng không có ảnh hƣởng sinh học mà xem xét nhƣ các mốc điểm trong hệ gen. Chúng ta có thể nhận biết trình tự ADN truyền đạt di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác dựa vào kiểm tra ADN phản ảnh đƣợc chỉ thị hình thái. ADN là cơ sở nhận biết các tính trạng bằng chỉ thị sinh hóa là cơ sở gen tạo ra protein, số marker này có 6 thể dò tìm toàn bộ genom và thông tin cung cấp cho nhà tạo giống phụ thuộc vào marker sử dụng, mỗi marker có ƣu và nhƣợc điểm khác nhau[15]. Trong thực tế, số lƣợng các chỉ thị ADN là rất lớn. Cây trồng có khoảng 108 - 1010 nucleotit trong ADN tổng số. Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN. Về mặt nguyên tắc, một chỉ thị ADN lý tƣởng là chỉ thị thoả mãn các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong gen, tập tính chọn lọc trung tính, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần nhƣ không thể tìm đƣợc một chỉ thị phân tử hoàn hảo nào có thể thoả mãn tất cả những điều kiện trên. Ƣu điểm của chỉ thị ADN so với chỉ thị hình thái và chỉ thị sinh hoá là:  Đo lƣờng trực tiếp các vật liệu di truyền  Có nhiều chỉ thị trong quần thể  Đo lƣờng không chi phối ảnh hƣởng của môi trƣờng và ảnh hƣởng có tính chất phát triển. Chỉ thị phân tử đƣợc chia làm 3 loại chính: - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: chỉ thị RFLP - Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: RADP, AFLP, SNP, STS, RGA) - Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Nhóm chỉ thị này thực ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhƣng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng (tiểu vệ tinh, SSR).  Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN  RFLP marker (Restriction Fragment Length Polymorphism – Đahình chiều dài đoạn phân cắt) Chỉ thị RFLP đƣợc di truyền đơn giản theo quy luật Menden. Trong kỹ thuật RFLP, enzym giới hạn đƣợc sử dụng để cắt ADN genom thành nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau. Qua quá trình tiến hóa, trong phạm vi trình 7 tự nhận biết của một loại enzym giới hạn có thể xảy ra sự tái sắp xếp ADN, các đột biến điểm, sự thêm hoặc mất đoạn ADN, điều này tạo nên sự đa hình giữa các cá thể và có thể phát hiện đƣợc đa hình này khi sử dụng kỹ thuật RFLP. Các chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ di truyền và đến nay vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về genom nhờ những ƣu điểm của nó. Chỉ thị này đƣợc các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh của ngƣời [9]. Các đa hình RFLP sinh ra bởi các đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ nhƣ đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, ngƣời ta có thể nhận biết những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò. Đây là nguyên lý của kỹ thuật đa hình chiều dài các mảnh phân cắt giới hạn RFLP.  Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction - PCR) đƣợc Kary Mullis và ctv phát minh năm 1985. Với một tiềm năng to lớn, phƣơng pháp này đã nhanh chóng đƣợc sử dụng ở hầu hết các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. Tuỳ theo bản chất của mỗi đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trƣng gồm chỉ thị RAPD, SSR, AFLP…  Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Chỉ thị RAPD là sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN genom với những nhóm mồi đơn (khoảng 6-10 nucleotide) [22]. 8 Sự đa hình phát hiện đƣợc khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ nucleotit ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuếch đại. Do đó, đa hình RAPD thƣờng là trội, biểu hiện sự có mặt hay vắng mặt của 1 sản phẩm khuếch đại từ một locut đơn. Ƣu điểm chính của chỉ thị này là không đòi hỏi thông tin về trình tự ADN, kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp và nhiều chỉ thị có thể đƣợc phân tích trong một thời gian ngắn. Chúng đƣợc sử dụng nhƣ những chỉ thị phân tử để xác định liên kết gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng. Do vậy, kỹ thuật này đƣợc sử rộng rãi trong việc lập bản đồ di truyền, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể đ ể phục vụ trong công tác lai tạo hoặc phân loại. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là RAPD thƣờng là các chỉ thị trội cho nên khi các sản phẩm đƣợc khuếch đại có kiểu dị hợp tử thì không thể phân biệt đƣợc. Ngoài ra, độ nhạy và độ tin cậy của RAPD còn phụ thuộc vào điều kiện phản ứng [2].  Chỉ thị AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism) Loại chỉ thị này đƣợc sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra loại chỉ thị này đƣợc gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification = SRFA). Phƣơng pháp linh hoạt này có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào. Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lƣợng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lƣợng ADN tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này rất ít. Đây là một phƣơng pháp có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên, hạn chế của loại chỉ thị này là chỉ thị di truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp tử và dị hợp tử, giá thành cho nghiên cứu tƣơng đối cao. 9  Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphism) SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN đƣợc tìm thấy với tần suất cao nhất trong genom ngƣời. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong genom, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp bazơ khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 5001000bp. Một cặp bazơ ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp bazơ khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí. Nếu cặp bazơ ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, ngƣời ta định nghĩa vị trí cặp bazơ đó là một SNP. Hiện nay, ngƣời ta đã công bố 3 triệu SNP trong genom ngƣời, nhiều hơn bất cứ chỉ thị phân tử nào đã đƣợc công bố trƣớc đó. Kỹ thuật SNP đƣợc áp dụng vào đầu những năm 2000, từ genom ngƣời cho đến genome các sinh vật khác nhƣ cây Arabidopsis, cây lúa. SNP có những ƣu điểm nổi bật sau: - SNP có tính chất “diallelic” trong quần thể và tần suất alen của nó có thể đƣợc ƣớc đoán dễ dàng trong bất cứ quần thể nào, thông qua một loại xét nghiệm kỹ thuật.  Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site) STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60-1000bp và có thể phát hiện đƣợc bằng kỹ thuật PCR. Hai đoạn mồi đƣợc thiết kế dựa trên các trình tự nucleotit đã biết giúp ta xác định đƣợc vùng ADN cần tìm kiếm. Các đoạn mồi STS thƣờng chứa khoảng 20 nuleotit (dài hơn mồi của RAPD) nên có tính đặc hiệu cao. Mỗi một STS đƣợc xác định tại một điểm trên bản đồ nhƣ là một mốc trong genom. Ở cây lúa, các STS đƣợc coi nhƣ là mốc chuẩn. Kỹ thuật này cũng rất thuận lợi cho việc nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài [7].  Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog) 10 Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, ví dụ nhƣ vùng nhắc lại giàu leucin, vùng vị trí liên kết nucleotit và vùng protein Kinaza[12]. Những vùng này đã đƣợc sử dụng trong việc xây dựng một kỹ thuật dựa trên PCR, đó là kỹ thuật RGA. Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN đƣợc xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã đƣợc dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và mô tả đa dạng di truyền [11].  Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại Chuỗi lặp lại có trật tự là những chuỗi có trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thƣờng đƣợc gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tùy thuộc vào số lƣợng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi.  Chỉ thị tiểu vệ tinh (Minisatellite) Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm 6 nucleotit trở lên (thƣờng có khoảng 15 bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3 kb. Không giống nhƣ ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh đƣợc tìm thấy ở những vùng nhiễm sắc thể thực và thƣờng thay đổi nhiều về kích thƣớc. Khi sử dụng những ADN tiểu vệ tinh làm mẫu dò có thể phát hiện đồng thời nhiều alen. Chúng là những chỉ thị tốt cho những nghiên cứu đa hình ADN cũng nhƣ lập bản đồ di truyền.  Chỉ thị SSR: Vi vệ tinh, hay ở thực vật còn gọi là Lặp lại trình tự đơn giản Simple Sequence Repeats (SSR). Vi vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotit trở lên thƣờng vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng 11 từ 0,5 đến 30 kb. Không giống nhƣ ADN vệ tinh, vi vệ tinh đƣợc tìm thấy ở những vùng nhiễm sắc của hệ gen và thƣờng thay đổi rất nhiều về kích thƣớc [25]. Những chỉ thị vi vệ tinh đã đƣợc ứng dụng khá thành công từ năm 1995 đến nay. Nó đƣợc dùng để phát hiện các bệnh ung thƣ thƣờng gặp trên ngƣời. Nó cũng đƣợc dùng để phát hiện các gen có ích trong thực vật, sự liên hệ về huyết thống. SSR đã đƣợc nghiên cứu lần đầu tiên trên ngƣời [13], cho đến nay nó đƣợc tìm thấy trong các hệ gen của cơ thể Eukaryot khác nhƣ các gia cầm, động vật có vú, cá và trên các loài cây một lá mầm và hai lá mầm. Bản chất đa hình của SSR có thể đƣợc nhân ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Giá trị của SSR là sinh ra đa hình từ nhiều vùng tƣơng ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở động vật và thực vật. Vùng có ADN lặp lại thƣờng kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá thể khác nhau, trình tự đó đƣợc lặp lại với số lần khác nhau. Nhƣ vậy vùng “vi vệ tinh” thƣờng có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác. Ngƣời ta lợi dụng đặc điểm này để thiết kế mồi SSR nằm ở 2 đầu gần kề với đoạn lặp lại. 1.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền Một trong những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống là phân tích tính đa dạng di truyền. Dựa vào chỉ thị phân tử có thể xác định tính đa dạng di truyền giữa các giống, các loài, giữa các cá thể trong cùng loài... Những chỉ thị phân tử phản ánh những thay đổi có thể di truyền trong trình tự chuỗi ADN ở cả những vùng mã hóa và không mã hóa. Bởi vậy nó cung cấp những công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu đa dạng di truyền giúp cho việc khám phá sự biến đổi loài và mối quan hệ chủng loại phát sinh giữa các quần thể và giữa các loài. 12 Không chỉ có vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền còn giúp đánh giá nguồn tài nguyên di truyền của các tập đoàn giống cây trồng, vật nuôi, giúp cho việc sử dụng nguồn tài nguyên di truyền hiệu quả hơn. Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ƣu thế lai giữa các cặp bố mẹ. Cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thƣờng sẽ cho ƣu thế lai lớn hơn.  Lập bản đồ phân tử Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là lập bản đồ di truyền. Bản đồ di truyền hiện đại đƣợc thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP...). Trong quá trình giảm phân, các gen trên cùng nhiễm sắc thể (NST) thƣờng đƣợc phân ly cùng nhau nhƣ một nhóm liên kết gen. Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn do kết quả của quá trình trao đổi chéo giữa các NST tƣơng đồng. Kết quả của hiện tƣợng này là sự tái tổ hợp giữa các gen trong một cặp NST. Tần số trao đổi chéo giữa hai gen nào đó phản ánh khoảng cách tƣơng đối giữa chúng. Nhƣ vậy bản đồ di truyền của NST biểu thị vị trí tƣơng đối của các gen. Sự liên kết của những gen nằm trên cùng một NST đƣợc trình bày thành một bản đồ liên kết hay bản đồ NST thể hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng. Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên kết đƣợc coi là đơn vị bản đồ, nó đƣợc xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ hợp, trong đó 1cM tƣơng đƣơng với 1% tái tổ hợp. Bản đồ di truyền hiện đại đƣợc lập trên cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm soát các tính trạng nghiên cứu. Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể đƣợc biểu hiện ở kiểu hình. Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ thị liên kết gen. Khoảng cách giữa các chỉ thị và gen đƣợc thể hiện bằng tần số tái tổ hợp giữa chúng. 13 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước: Ngày nay Công nghệ sinh học trên thế giới đang ngày càng phát triển, cùng với đó việc nghiên cứu chọn tạo những giống lúa có năng suất cao đã có những bƣớc tiến rõ rệt. Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng đang đƣợc nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới triển khai rộng rãi. Các nhà khoa học ở Trƣờng ĐHTH Cornel (Mỹ) là những ngƣời đầu tiên định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa. Trong chƣơng trình genom lúa do Nhật chủ trì, các nhà khoa học đã phát hiện và tách dòng hơn 3000 đoạn ADN bổ trợ. Đến nay đã có khoảng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã đƣợc phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng [14]. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền lúa đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu. Cho đến nay, hàng nghìn QTL/gen liên kết với hầu hết các tính trạng ở lúa đã đƣợc xác định. Trong đó nhiều QTLs/gen quy định tính trạng có ý nghĩa kinh tế quan trọng đã đƣợc xác định lập bản đồ và ứng dụng trong cải tiến giống. Hiện nay có khoảng 27 QTL/gen kháng bệnh bạc lá, 30 QTL/gen kháng đạo ôn, 27 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo đã đƣợc phát hiện [5], [24]. Ngoài ra các QTL/gen quy định năng suất và yếu tố cấu thành năng suất, gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trƣởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa nhƣ chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, nhiệt độ, gen tƣơng hợp rộng... cũng đƣợc phát hiện hay đƣợc lập bản đồ phân tử để đƣa vào sử dụng 14 trong chọn giống. Ngoài ra, ứng dụng chỉ thị phân tử thông qua việc đánh giá đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền, chỉ thị phân tử còn giúp các nhà chọn giống xác định gián tiếp các cặp lai có khả năng cho ƣu thế lai [4], [5]. Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) đã thành công trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử và phƣơng pháp lai trở lại để chuyển QTL/gen chịu ngập (Sub1), chịu mặn (Saltol), chịu hạn trên cùng 1 giống lúa IR64 nhƣng không làm thay đổi tính trạng của giống gốc. Yếu tố cấu thành năng suất ở lúa là một tính trạng phức hợp gồm: Số bông trên khóm, số hạt trên bông và trọng lƣợng nghìn hạt. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phƣơng pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locut gen quy định tính trạng di truyền số lƣợng (QTL) hay gen vào giống mới. Sử dụng chỉ thị phân tử ADN cho phân tích di truyền và những tính trạng nông học quan trọng, yếu tố cấu thành năng suất là một công cụ rất hiệu quả trong chọn giống lúa. Việc ứng dụng chỉ thị phân tử vàò nghiên cứu các tính trạng cấu thành năng suất đang thể hiện những ƣu thế hơn hẳn so với các phƣơng pháp nghiên cứu truyền thống. Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen. Với sự ra đời của hàng loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên kết đến các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất. Trong nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL/gen điều khiển một tính trạng năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất. Đây là một việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di truyền số lƣợng, nó là tổ hợp tính trạng nhƣ: số hạt chắc trên bông, số bông trên khóm, khối lƣợng nghìn hạt. Những nằm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã đƣợc xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai 15 giữa giống hay các loài phụ. QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất đƣợc xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa. Ở đây chúng tôi tập hợp lại những kết quả xác định QTL/gen liên kết năng suất và yếu tố cấu thành năng suất trên cây lúa. Nhiễm sắc thể số 1: Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định đƣợc nhiều tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 nhƣ: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283RM259 [20], và RG810-RG331 [18]. Một QTL liên kết tính trạng số hoa trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490 và một QTL liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông đã đƣợc xác định từ tác giả [20] tại vị trí giống QTL liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt RM283-RM259. Một QTL liên kết tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM265-RM315 [20]. Vị trí chỉ thị phân tử RZ730RZ810, một QTL cho tính trạng số bông trên khóm cũng đã đƣợc xác định [18]. Locut quy định trực tiếp với tính trạng năng suất đƣợc xác định tại vị trí gần RM230-RM532 [18]. Nhiễm sắc thể số 2: QTL quy định khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định từ các tác giả khác nhau với cùng vị trí chỉ thị phân tử RM240-RM266 [20]. Ba QTL liên kết tính trạng tổng số hạt trên khóm, tại các vị trí gần tâm động [20], vị trí chỉ thị RM263 [10] và vị trí chỉ thị RZ123-RZ446 [22]. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định từ bốn tác giả tại vị trí chỉ thị phân tử RZ123-RZ446 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 2 [18]. Hai QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động [18]. Hai QTL liên kết tính trạng năng suất đƣợc xác định gần tâm động [20] và nằm trên vai dài của nhiễm sắc thể 2 [18]. Nhiễm sắc thể số 3: Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3. Một trong số đó là QTL đƣợc xác định tại vị trí tâm động [20], tác giả Li và cs. (2004) đã lập bản đồ QTL 16 liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt với khoảng cách 98kb. QTL thứ hai đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 3 tại vị trí chỉ thị phân tử RM16-RM168 [18]. QTL thứ ba đƣợc xác định trên vai ngắn [20]. Hai QTL liên kết tổng số hạt trên bông trên vai dài của nhiễm sắc thể 3 [20]. Một QTL liên kết số hạt trên bông [20]. Gần chỉ thị phân tử RM282, một QTL cho số hạt chắc trên bông cũng đƣợc xác định. Bốn QTL liên kết số bông trên khóm đƣợc xác định tại vai dài [22], RZ598-RM16[20]. QTL quy định năng suất cũng đƣợc xác định trên vai dài [20]. Nhiễm sắc thể số 4: Ba QTL/gen liên kết với tính trạng khối lƣợng nghìn hạt đƣợc các nhà khoa học xác định hai QTL tại vị trí gần chỉ thị phân tử CDO244-RG864 [22] và một tại vị trí RG143 [10]. Hai QTL quy định tổng số hạt trên cây đƣợc xác định tại vị trí RM303-RM317 [22]. Ba QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định bởi các tác giả [21]. Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động [22], một tại vị trí RG214RG620 [10]. Nhiễm sắc thể số 5: Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 5, gần tâm động liên kết chỉ thị RZ296 [22], và RM26-C147 [10]. Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RG360-R3166 trên vai ngắn, và tại RG13-RG470 [20]. Bốn QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RZ390-RM153 [20], RZ296 [22]. Ba QTL quy định số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RG360-RG9, và C734B, nằm trên vai dài tại vị trí CDO1083 [22]. Nhiễm sắc thể số 6: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định một tại vị trí R2869-C226A [22], một tại C751A-RZ667, và một tại R2549-C962 . Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6, liên kết với chỉ thị phân tử 17 R2869 [22], và RG138-RM253, và G122-R2549. Tác giả Brondani và cs. (2002) đã xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử OG32. Trong khi đó, Thomson và cs. (2003) xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM276. Ba QTL số bông trên khóm đƣợc xác định tại vị trí Wx-RG213, RM3-CDO78, RG653 [22]. Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định bởi một số tác giả tại vị trí chỉ thị phân tử RZ398-RM204 [20], và RG653-G342 [22]. Nhiễm sắc thể số 7: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng 1000 hạt liên kết chỉ thị phân tử RG128-C1023 trên vai ngắn, RM125 gần tâm động, và RM11-RZ626 [22]. Ba QTL quy định tính trạng số hạt chắc trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị RG128-C1023 trên vai ngắn, C1023B-R1440 gần tâm động, RZ471-RZ624 [22]. Ba QTL quy định tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động trên vai ngắn [22], RG650-C285, và gần chỉ thị STSG3 trên vai dài [10]. Hai QTL quy định tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử R2401 tại vị trí gần tâm động, RZ471-RM234 [20]. Bốn QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RG128-C1023 trên vai ngắn, Brondani và cs. 2002, RZ471-RZ753 và RZ753-RZ263. Ghd7 là gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông đã đƣợc phát hiện từ giống lúa Minghui 63. Ghd7 nằm gần tâm động, trên nhiễm sắc thể số 7. Ghd7 làm tăng (65.8%) số hoa trên bông trên giống Zhenshan97. Gpa7 đƣợc phát hiện từ giống lúa hoang O. Rufipogon.Gpa7 làm tăng số hạt trên bông trên giống lúa Indica Guichao 2. Gw9.1 là QTL liên kết tính trạng tăng khối lƣợng 1000 hạt, đã đƣợc phát hiện từ lúa hoang Oryza Rufipogon. Gw9.1 đƣợc phát hiện nằm trên nhiễm sắc thể số 9. Gw11 liên kết tính trạng khối lƣợng hạt, đã đƣợc các nhà chọn giống ở trƣờng đại học tổng hợp quốc gia Chungnam Hàn Quốc phát hiện từ giống lúa hoang O. grandiglumis. Ashikari và cs.(2005) đã 18 xác định đƣợc gen Gn1a, gen tăng số hạt trên bông trên nhiễm sắc thể 1. Linh và cs (2008) đã lập bản đồ QTL yd7 liên kết tính trạng tăng năng suất từ lúa hoang O. minuta trên nhiễm sắc thể số 7. Sự có mặt của yd7trên giống lúa trồng đại trà Hwaseongbyeo làm tăng 15 đến 20% năng suất. Nhiễm sắc thể số 8: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử C1121-RZ562 gần tâm động, RM223-RZ28 [10], và RM284-RM210. Bốn QTL quy định số hạt chắc trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RG333-C1121, RM25-RG978, RM210-RZ66 [20] và CDO99. Hai QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM25, RZ28 [22]. Một QTL quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RM210 [10]. Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động [22], và một tại vị trí liên kết chỉ thị phân tử RZ66-RG598. Nhiễm sắc thể số 9: Một QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RM257-RG667 [20]. Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RM422-RM215 [22]. Bốn QTL quy định tính trạng hạt chắc trên bông đƣợc xác định bởi tác giả Thomson và cs. (2003) tại vị trí RM215. Một QTL quy định tính trạng số bông trên khóm tại vị trí RG667-RM404. Ba QTL quy định tính trạng năng suất liên kết chỉ thị phân tử C1232-R1164 và RM219-RZ698, và một tại vị trí RZ12-RM215 [20]. Nhiễm sắc thể số 10: Bốn QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử C153A-RM222 trên vai ngắn nhiễm sắc thể 10, RG257-RM311 [22], RG241-RZ500, và RM561-C371. Hai QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RM239-RZ561, C405C371 trên vai dài [22]. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM147 [20]. Hai QTL quy định tính trạng số hạt chắc trên bông 19 liên kết chỉ thị phân tử RZ892-RZ561 [22], C677-RG134. Hai QTL quy định tính trạng độ dài hạt liên kết chỉ thị phân tử RG257-RG241 và RM228. Nhiễm sắc thể số 11: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RM20B-RM167 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 11 [10], G44-G257, và RG103-RZ536. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM224 [22]. Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông liên kết chỉ thị phân tử RM20-C104, RZ537-RZ900, và RM254-C950 [20]. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM286 [18], Xiao và cs. (1996) xác định một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt trên nhiễm sắc thể số 11. Bốn QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20B tại vị trí vai ngắn gần tâm động [10], RM167-RM202 [18], STSG34 (khoảng chỉ thị phân tử RM202-RM209) [10], và RZ537-RZ900 [18]. Bốn QTL quy định tính trạng năng suất hạt đƣợc xác định bởi các tác giả [10]. Nhiễm sắc thể số 12: Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử R887-G1128a, RM235 [20]. Hai QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RG574 [22] và RG341 hay RG869 [20]. Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B, RG869 [20], CDO459-RG235. Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động của nhiễm sắc thể số 12 [22]. Hai QTL quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RM341, CDO344-RG181 [22]. Hai QTL quy định tính trạng năng suất hạt đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử C966-G1128a và RG235 [22]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong những năm gần đây, công tác nghiên cứu, chọn tạo thử nghiệm và đƣa vào sản xuất các giống có năng suất cao rất đƣợc chú ý quan tâm. 20 Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (nhƣ kỹ thuật chuyển gen, kỹ thuật sinh học phân tử...) thực tế đã đƣợc triển khai từ những năm cuối của thế kỷ trƣớc tại một số viện nghiên cứu và trƣờng đại học. Tuy nhiên, các kỹ thuật công nghệ này mới thực sự phát triển và đƣợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu vào những năm gần đây. Phần lớn các nghiên cứu xác định chỉ thị liên kết gen và lập bản đồ gen của các tác giả Việt Nam đƣợc tiến hành trên đối tƣợng cây lúa trong khuôn khổ các dự án nghiên cứu và dự án hợp tác quốc tế. Nghiên cứu về đa dạng di truyền và lập bản đồ gen, QTL bằng việc sử dụng chỉ thị RAPD, RGA, SSR, AFLP, RFLP... là những công cụ hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống. Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống cũng đƣợc triển khai và thu đƣợc những kết quả khả quan. Một số công trình nghiên cứu sử dụng chị thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ gen kháng đối với một số cây trồng chính, trong đó có nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá đối với cây lúa đã đƣợc triển khai tại một số viện nghiên cứu và trƣờng đại học trong nƣớc (Đại học Nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện công nghệ sinh học, Viên lúa ĐBSCL...).Nghiên cứu đầu tiên của Viện nghiên cứu lúa ĐBSCL và Viện KHKTNN Miền nam về phân tích di truyền tính kháng rầy nâu của giống lúa hoang nhờ chỉ thị phân tử. Các nhà nghiên cứu đã xác định đƣợc hai gen mới kháng rầy nâu ở một loài lúa dại (O. officinalis) định vị trên NST số 3 và số 7 liên kết với 2 chỉ thị tƣơng ứng là RM168 và RM18. Gần đây, đề tài nghiên cứu tại trung tâm Tài nguyên Thực vật do Lã Tuấn Nghĩa và cs (2011) đã quy tụ và chọn lọc đƣợc dòng lúa mang cả hai gen kháng bệnh đạo ôn P1-1 vàP15 qua sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với các gen để chọn lọc. Để phục vụ cho chƣơng trình nghiên cứu lúa lai tại Việt Nam, nghiên cứu lập bản đồ gen kiểm soát tính bất dục đực nhạy cảm nhiệt độ cũng đã đƣợc tiến hành. Các tác giả 21 thuộc Viện Di truyền NN đã tìm đƣợc bốn chỉ thị phân tử AFLP liên kết gen tgms-vn1 (gen bất dục đực nhân nhạy cảm với nhiệt độ) với khoảng cách gần nhất là 3,5cM trên vai ngắn của NST số 2 của hệ gen lúa. Bùi Chí Bửu và ctv (2000) đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F 3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28 /Đốc Phụng. Các tác giả xác định 10 SSR marker cho thể đa hình của các sản phẩm PCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ. Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8. RM223 nhân bản đoạn ADN kích thƣớc 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn. Từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thƣớc 160 bp từ giống nhiễm IR28. Nguyễn Thị Lang và ctv (2001) đã báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1. Marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách di truyền là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 . Riêng với tính trạng số hạt trên bông, việc áp dụng chỉ thị phân tử để xác định QTL/ gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông là một lĩnh vực nghiên cứu mới, chƣa đƣợc thực hiện nhiều ở nƣớc ta. Do vây, đây là nghiên cứu góp phần bổ sung vào công cuộc nghiên cứu chọn tạo các giống lúa có năng suất cao. 22 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Các giống lúa nghiên cứu + Giống KC25 (giống cho gen): Mang QTL/ gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông, đƣợc nhập nội từ một số viện nghiên cứu lúa Quốc tế. + Giống OM6976 (giống nhận gen): OM6976 là giống lúa có khả năng thích nghi trên diện rộng chủ yếu đƣợc trồng ở các vùng phía nam: đặc tính đẻ nhánh khỏe, chịu phèn, bông chùm dài 25-26 cm, năng suất cao 6-7 tấn, kháng sâu bệnh, chống chịu rầy nâu và bệnh vàng lùn khá, kháng bệnh đạo ôn, thời gian sinh trƣởng 90-100 ngày,cây cao 100-110 cm, hạt gạo trong, dài 7mm, mềm cơm, trọng lƣợng 26-27 gr/1000 hạt. 2.2. Nội dung nghiên cứu Xác định các chỉ thị phân tử đa hình giữa dòng OM6976 và dòng cho QTL tăng số hạt trên bông dòng KC25 trên 12 nhiễm sắc thể.  Gieo trồng vật liệu  Thu mẫu lá 2 tuần tuổi  Tách DNA tổng số  Kiểm tra độ tinh sạch của DNA trên gel agarose 0,8%  Tiến hành phản ứng PCR với các chỉ thị thí nghiệm  Kiểm tra kết quả phản ứng PCR trên gel polyacrylamide 4,5%  Phân tích kết quả. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số ADN lúa đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phƣơng pháp của Shagai – Maroof (năm 1984).  Các bước tiếnhành 23  Lá của các giống lúa nghiên cứu đƣợc cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3 tuần. Mẫu đƣợc lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN.  Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.  Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% - Mercaptol ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50µl SDS 10%.  Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 65 0C, thỉnh thoảng đảo cho dịch đƣợc trộn đều.  Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút.  Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 4 0C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tƣợng kết tủa muối.  Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.  Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dƣới đáy eppendorf. Cho 400µl đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0)cho vào tủ 65 0C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bƣớc này có thể giữ ở 4 0C qua đêm.  Cho 3µl Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng.  Thêm 400µl đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 65 0C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều.  Cho và tủ hút, thêm vào 8ml chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.  Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một 24 eppendorf mới. Nếu chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1).  Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200C).  Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng ở đáy ống.  Rửa tiếp bằng 400µl cồn 70% rồi đƣa vào máy ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100µl TE (10:1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.  Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 200C) để sử dụng cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo. 2.3.2. Phương pháp PCR với mồi thí nghiệm Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR đƣợc chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lƣợng của các chất trong mỗi phản ứng nhƣ trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần STT Thể tích (l) 1 H2O cất khử trùng 8.95 2 Buffer 10X 1,5 3 MgCl2 (50mM) 0,45 4 dNTP (1mM) 1,0 5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1 6 Primer forward 5M 0,5 7 Primer Revert 5M 0,5 8 ADN (35ng/ l) 2,0 Tổng thể tích: 15 25 Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lƣợng các chất cần thiết, tiến hành đặt chƣơng trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR nhƣ sau: Bảng 2.3. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR Bƣớc 1 Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 94 5 phút 94 30 giây 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1 2 1 35 (*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi thí nghiệm 2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%  Các bước tiến hành  Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác.  Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất.  Để nguội đến khoảng 50 - 60 0C, thêm 5µl ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.  Chuẩn bị khay và lƣợc. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.  Rút lƣợc, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm.  Tra sản phẩm PCR đã đƣợc trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5µl Xylen cyanol /15µl mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thƣớc của cặp mồi thí nghiệm cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. 26  Soi gel trên máy soi cực tím. 2.3.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính  Chuẩn bị kính  Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.  Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.  Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.  Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) đƣợc tạo thành bằng cách thêm 2µl Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.  Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.  Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.  Chuẩn bị gel polyacrylamide Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nƣớc)  Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1)vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.  Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.  Cài lƣợc vào giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lƣợc.  Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.  Điện di  Tháo lƣợc và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính.  Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dƣới. 27  Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.  Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W.  Biến tính các sản phẩm PCR ở 95 0C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.  Sản phẩm PCR lúc này đã đƣợc trộn với 4µl Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).  Tra vào mỗi giếng 5µl sản phẩm PCR đã đƣợc làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.  Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều.  Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 50 0C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thƣớc từng mồi sử dụng. + Chuẩn bị các dung dịch  Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nƣớc cất.  Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO 3) vào 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO)37%.  Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất và làm lạnh ở -200C. Chú ý. (Trƣớc khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO)37% và 200µl natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O). + Tiến hành nhuộm Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bƣớc sau:  Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hƣớng lên 28 trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bƣớc sau.  Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nƣớc cất trong 5 - 10 giây.  Đƣa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả. 2.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu -Địa điểm:Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, bộ môn Kĩ thuật di truyền. - Thời gian: 08/2014-04/2015. 29 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN Tách chiết ADN là bƣớc đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu đƣợc thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN đƣợc minh hoạ ở hình 3.1 1 2 3 4 5 6 Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp CTAB trên gel agarose 0,8%. Giếng số 1- Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), giếng số 4 – OM6976, giếng số 6 – KC25 30 Kết quả tách chiết ADN cho thấy phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ ARN bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo. 3.2. Khảo sát đa hình trên 12 NST giữa giống cho và nhận QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông Đa hình giữa hai giống lúa có thể đƣợc phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại đƣợc khuếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với các chỉ thị SSR trên 12 NST nhằm phục vụ chọn lọc nền di truyền giống nhận gen và chọn lọc các cá thể con lai. Dòng KC25 có mang QTL quy định tính trạng tăng số hạt trên bông Yd7. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng xác định nền di truyền trong các cá thể con lai, tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa OM6976; KC25. Sử dụng 156 chỉ thị SSR trên 12 nhiễm sắc thể đã xác định 58/156chỉ thị cho đa hình giữa giống OM6976 và KC25 một vài kết quả chạy đa hình đƣợc thể hiện qua Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4 Hình 3.2. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thịRM2108; RM10916; RM24865 L.Marker;3.KC25; 5.OM6976 31 Quan sát Hình 3.2 ta thấy các chỉ thị RM1208, RM10916, đƣờng chạy số 3(mẫu DNA của giống KC25) xuất hiện băng ADN cao hơn các băng ở đƣờng chạy số 2 đƣờng chạy số 5 (mẫu ADN của giống OM6976). Chỉ thị RM24865 ở đƣờng chạy số 3 xuất hiện băng ADN thấp hơn băng ADN ở đƣờng chạy số 5. Sự chênh lệch về vị trí các băng ADN ở đƣờng chạy 5 với 3 thể hiện đa hình giữa các giống OM6976 với giống KC25. Hình 3.3. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM22825 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 Kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy chỉ thị RM19199, RM22825 có vị trí mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 cao hơn các đƣờng chạy số 2, 4, 5. Ở chỉ thị RM19238 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 2, 4 lên mờ, đƣờng chạy số 3 và 5 lên rõ, có sự khác biệt vị trí ở đƣờng chạy số 3 và số 5. Chỉ thị RM21471 ở tất cả các giếng không xuất hiện băng vạch nào có thể do mồi không hoạt động hoặc do làm phản ứng sai. 32 Hình 3.4. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 Chỉ thị RM6, RM3, RM345 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 có vị trí thấp hơn đƣờng chạy số 5 do vậy chỉ thị RM6, RM3, RM345 cho đa hình giữa các giống OM6976 và KC25. Sau khi phân tích các kết quả chạy điện di kiểm tra chúng tôi xác định đƣợc 58/156 chỉ thị cho đa hình giữa OM6976 với KC25. Kết quả tổng hợp đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống OM6976 và KC25 Tên chỉ thị cho phân tử đa hình STT Số lƣợng RM10115, RM10136, RM10741, RM10800, RM10815, 1 RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, 14 RM3412b, RM493, RM5365, RM7075 2 RM207, RM526, RM5356, RM6, RM7355 5 3 RM14795, RM14820, RM282, RM3297, RM3654, RM5480 6 33 4 RM16589, RM16820, RM280, RM349, RM551 5 5 RM19199; RM31 2 6 RM19238, RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434 7 7 RM11, RM21769, RM7338 3 8 RM22825, RM331, RM447 3 9 RM296, RM11874, RM1208 3 10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628 4 11 RM19840, RM341, RM3625 3 12 RM1194, RM247, RM7102 3 Tổng 58 Các chỉ thị cho đa hình giữa giống cho gen KC25 và giống nhận gen OM6976 sẽ đƣợc sử dụng để đánh giá xác định nên di truyền ở các thế hệ con lai. Kết quả khảo sát đa hình trên 12 NST của các giống nghiên cứu với các chỉ thị SSR đƣợc minh họa bởi một số hình ảnh sau đây: Hình 3.5 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM3482; RM3628; RM3625; RM3654; RM3753 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 34 Hình 3.6 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11745; RM11799; RM11874; RM20163; RM20192 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 Hình 3.7 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM31; RM 148; RM 296; RM247; RM282 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 35 Hình 3.8 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM10115; RM10649; RM10681; RM10694A;RM10694; RM10720 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 Hình 3.9 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM10741; RM10782; RM10806; RM10815; RM10820 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 36 Hình 3.10 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM16589; RM16820; RM17391; RM17411; RM09034 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 Hình 3.11 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11438; RM12769; RM13197; RM13332; RM14795; RM14820 L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976 3.3 Thảo luận Ở Trung quốc các nhà khoa học đã thành công quy tụ các QTL/gen quy định yếu tố cấu thành năng suất vào một giống [8]. Những giống lúa cải tiến này đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp cả hai phƣơng pháp chọn giống truyền thống 37 và hiện đại. Bƣớc đột phá trong việc chọn giống lúa siêu cao sản trở nên có thể thực hiện đƣợc sau khi locut điều khiển tính trạng tăng năng suất (QTL) đƣợc xác định. Bằng việc sử dụng phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại đã đẩy nhanh quá trình quy tụ các gen đó vào những giống mới năng suất cao [21], [17], [19]. Ngày nay, với công nghệ sinh ho ̣c phân tƣ̉ đƣơ ̣c phát triển nhanh chóng trong giải trình tự hệ gen , phân tích chức năng gen và so sánh hệ gen đã dẫn đến phát triển đƣợc một số lƣợng lớn chỉ thị phân tử . Lập bản đồ QTL , xác đinh ̣ QTL liên quan đến tính trạng năng suất. Đồng thời phát triển kĩ thuật chỉ thị phân tƣ̉ kiểm tra QTL nhằm giải thích cơ chế di truyền của các tính trạng năng suất. Các nỗ lực hợp tác trong phân tích chức năng gen đã dẫn tới việc xác định đƣợc 23 gen và QTL quan tâm [16]. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về tính trạng tăng năng suất lúa, nhƣng vẫn còn nhiều thách thức cần phải chứng minh về cơ chế phân tử quy đinh ̣ tí nh hình thành các tính trạng năng suất. Hầu hết tất cả các tính trạng năng suất bao gồm số bông trên khóm, số hạt trên bông, và khối lƣợng hạt biểu hiện nhiều biến dị liên tục trong quần thể di truyền hoặc ngay giữa các giống đã đƣợc thƣơng mại, là tính trạng đó do nhiều gen hay QTL quy định. Cơ sở dữ liệu Gramene, đã lƣu trữ và xác định hàng ngàn QTL/gen liên quan đến tính trạng năng suất từ nghiên cứu lập bản đồ chi tiết và đa số các QTL này có hiệu ứng di truyền nhỏ, gây nhiều khó khăn xác định thông qua phân tích đột biến. 38 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận. 1/ Đã kiểm tra đa hình ADN giữa giống cho QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông KC25 với dòng nhận QTL/gen OM6976 trên 12 NST với 156 chỉ thị ADN. 2/Xác định đƣợc 58/156 chỉ thị cho đa hình giữa giống OM6976 và KC25 nằm trải đều trên 12 NST. 4.2. Kiến nghị. 1/ Sử dụng 58 chỉ thị đa hình giữa giống OM6976 và KC25 cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm sàng lọc nền di truyền của các cá thể con lai. 2/ Tiến hành lai tạo, tạo quần thể BC1 F1 , BC2 F1 ... xác định các cá thể QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông và có nền di truyền giống cây nhận gen nhất. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Ngọc Anh (2005), “Chiến lược bảo vệ và sử dụng hợp lý dòng chảy kiệt đồng bằng sông Cửu Long”, Báo cáo hội thảo Khai thác và sử dụng hợp lý tài nguyên nƣớc khu vực đồng bằng sông Cửu Long, Cần Thơ, ngày 21/4/2005. 2. Nguyễn Duy Bảy, Bùi Chí Bửu và Bùi Bá Bổng (2001), Chọn giống nhờ Marker và Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr. 44-58. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng, Di truyền phân tử I, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, N.X.B Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Trí Hoàn (2009), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc chọn tạo dòng bố, mẹ phục vụ chọn tạo giống lúa lai siêu cao sản ở Việt Nam, Chƣơng trình KC.04/06 – 10. 2009 6. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Bài giảng công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, Viện Sinh học Nông nghiệp, tr.61 7. Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn tạo giống thực vật, Nxb ĐHQG Hà Nội. 40  Tài liệu tiếng Anh 8. Bai, Bi Wu and Yong zhong Xing (2012), Yield-related QTLs and Their Applications in Rice Genetic Improvement, Article first published online: 17 MAY DOI: 10.1111/j.1744-7909.2012.01117. 9. Botstein, D., R.L. White, M. Slkolnick, and R.W. Davis. (1980), Construction of a genetic lickage map in man using restriction fragment length polymorphisms, Amer. J. hum. Genet 32:314-331. 10. Brondani C, Rangel PHN, Brondani RPV, Ferreira ME (2002) QTL mapping and introgression of yield-related traits from Oryza glumaepatula to cultivated rice (Oryza sativa) using microsatellite markers. Theor Appl Genet 104:1192–1203 11.Chen D., D.V.M., et al (1999), Molecular mapping of the blast resistance gene, Pi-44(t), in a line derived from a durably resistance rice cultivar, Theor. Appl. Genet 97:345-355. 12.Grant, M.R., and e. al. (1995), Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance, Science 269:843-846. 13.Hamada, H., and T. Kakunaga. (1982), Potential Z-DNA forming sequences are highly dispersed in the human genome, Nature 298:396398. 14.Linh L.H., Jin F.X., Kang K.H., Lee Y.T., Kwon S.J., Ahn S.N.(2006), Mapping quantitative trait loci for heading date and awn length using an advanced backcross line from a cross between Oryza sativa and O.minuta, Breeding Science 56: 341 – 349. 15.Mackill et al (2006), QTLs in rice breeding; examples for abiotic stresses, Paper presented at the Fifth International Rice Genetics Symposium. 16.Miura K, Ashikari M, Matsuoka M. 2011. The role of QTLs in the breeding of high-yielding rice. Trends Plant Sci, 16(6): 319-326. 17.Septiningsih EM., Pamplona AM., Sanchez DL., Maghirang-Rodriguez R, 41 Neeraja CN, Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ. (2009), Development of submergence-tolerant rice cultivars: The Sub1 gene and beyond, Ann. Bot. 103:151-160. 18.Septiningsih EM, Prasetiyono J, Lubis E., Tai TH, Tjubaryat T, Moeljopawiro S and McCouch SR (2003) Identification of quantitative trait loci for yield and yield components in an advanced backcross population derived from the Oryza sativa variety IR64 and the wild relative O. rufipogon. Theor Appl Genet. 107:1419-1432 19.Singh S, Mackill DJ, Ismail AM. (2009), Responses of SUB1 rice introgression lines to submergence in the field: Yield and grain quality, Field Crops Res, 113: 12-23. 20.Thomson MJ, Tai TH, McClung AM, Lai XH, Hinga ME, Lobos KB, Xu Y, Martinez CP and McCouch SR (2003) Mapping quantitative trait loci for yield components and morphological traits in an advanced backcross population between Oryza rufipogon and the Oryza sativa cultivar Jefferson. Theor Appl. Genet. 107:479-493 21.Thomson MJ, Ismail AM, McCouch SR, Mackill DJ. (2009),Marker Assisted Breeding, In: Pareek A, Sopory SK, BohnertHJ, Govindjee (eds);Abiotic Stress Adaptation in Plants: Physiological, Molecular and Genomic Foundation. Chapter 20. Springer, Dordrecht. 22.Xiao J, Li J, Yuan L, Tanksley SD (1996) Identification of QTLs affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross. Theor Appl Genet 92:230–244 23.William, J.G., and e. al. (1990), Polimophism amplified by arbitrary primers ate useful as genetic marker, Nucleic Acid Research 18:65316535. 24.Zhang G., Bharaj., Virmani S.S. and Huang N. (1997), Mapping of the 42 RFLP – 3 nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD and RFLP markers, Theor, Appl. Genet. 83, 495 – 499. 25.ZArmour, J.A.L., and A.J. Jefferys. (1992), Biology and application of human minisatellite loci, Curr. Opin. Genet 2:850-856. 43 [...]... kết chỉ thị phân tử RZ66-RG598 Nhiễm sắc thể số 9: Một QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RM257-RG667 [20] Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RM422-RM215 [22] Bốn QTL quy định tính trạng hạt chắc trên bông đƣợc xác định bởi tác giả Thomson và cs (2003) tại vị trí RM215 Một QTL quy định tính trạng số bông trên. .. Hai QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RG574 [22] và RG341 hay RG869 [20] Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B, RG869 [20], CDO459-RG235 Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động của nhiễm sắc thể số 12 [22] Hai QTL quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ. .. thể số 11 [10], G44-G257, và RG103-RZ536 Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM224 [22] Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông liên kết chỉ thị phân tử RM20-C104, RZ537-RZ900, và RM254-C950 [20] Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM286 [18], Xiao và cs (1996) xác định một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt trên nhiễm sắc thể số 11... C405C371 trên vai dài [22] Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM147 [20] Hai QTL quy định tính trạng số hạt chắc trên bông 19 liên kết chỉ thị phân tử RZ892-RZ561 [22], C677-RG134 Hai QTL quy định tính trạng độ dài hạt liên kết chỉ thị phân tử RG257-RG241 và RM228 Nhiễm sắc thể số 11: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RM20B-RM167 trên. .. [10], và RM284-RM210 Bốn QTL quy định số hạt chắc trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RG333-C1121, RM25-RG978, RM210-RZ66 [20] và CDO99 Hai QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM25, RZ28 [22] Một QTL quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RM210 [10] Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động [22], và một... C751A-RZ667, và một tại R2549-C962 Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6, liên kết với chỉ thị phân tử 17 R2869 [22], và RG138-RM253, và G122-R2549 Tác giả Brondani và cs (2002) đã xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử OG32 Trong khi đó, Thomson và cs (2003) xác định QTL quy định tính trạng. .. đồ QTL 16 liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt với khoảng cách 98kb QTL thứ hai đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 3 tại vị trí chỉ thị phân tử RM16-RM168 [18] QTL thứ ba đƣợc xác định trên vai ngắn [20] Hai QTL liên kết tổng số hạt trên bông trên vai dài của nhiễm sắc thể 3 [20] Một QTL liên kết số hạt trên bông [20] Gần chỉ thị phân tử RM282, một QTL cho số hạt chắc trên bông cũng đƣợc xác định. .. số 11 Bốn QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20B tại vị trí vai ngắn gần tâm động [10], RM167-RM202 [18], STSG34 (khoảng chỉ thị phân tử RM202-RM209) [10], và RZ537-RZ900 [18] Bốn QTL quy định tính trạng năng suất hạt đƣợc xác định bởi các tác giả [10] Nhiễm sắc thể số 12: Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử R887-G1128a,... suất trên cây lúa Nhiễm sắc thể số 1: Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định đƣợc nhiều tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 nhƣ: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283RM259 [20], và RG810-RG331 [18] Một QTL liên kết tính trạng số hoa trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490 và một QTL liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông. .. Ba QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định bởi các tác giả [21] Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động [22], một tại vị trí RG214RG620 [10] Nhiễm sắc thể số 5: Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 5, gần tâm động liên kết chỉ thị RZ296 [22], và RM26-C147 [10] Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân ... phân tử giống cho (KC25) giống nhận (OM6 976) QTL/ gen quy định tính trạng tăng số hạt bông 2.Mục đích nghiên cứu Xác định thị phân tử đa hình giống cho (KC25) giống nhận (OM6 976) QTL/ gen quy định. .. Hai QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết thị phân tử RM25, RZ28 [22] Một QTL quy định tính trạng số khóm liên kết thị phân tử RM210 [10] Hai QTL quy định tính trạng suất đƣợc xác định. .. Hai QTL quy định tính trạng tổng số hạt liên kết thị phân tử RM239-RZ561, C405C371 vai dài [22] Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết thị phân tử RM147 [20] Hai QTL quy định tính trạng