bai 4 cndt 2 chuy n gen t b o ng v t

• Phương pháp bắn gen có thể được áp dụng đối với các tếbào được nuôi cấy hay mô cũng như các ứng dụng in vivo cho tế bào da.. • Ở một phần nhỏ của các tế bào được chuyển nhiễm, DNA có t

Công nghệ di truyền 2

Chuyển gen ở động vật

• Động vật biến đổi gen (ĐVBĐG) được sử dụng trong nghiên cứu chức năng gen in vivo và làm mô hình

nghiên cứu bệnh ở người.

• ĐVBĐG được tạo ra ở các loài động vật có vú, chim, lưỡng cư, động vật không xương sống.

• Chuyển gen ở động vật thường được thực hiện trên

chuột nhằm tạo ra các mô hình bệnh ở người.

Giới thiệu

•Phân tích điều hòa biểu hiện gen ở tế bào động vật là mộttrong những hướng nghiên cứu chính của sinh học phân tửhiện nay.

•Khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai của tế bào động vật có

vú và sự biểu hiện gen trong đoạn DNA chèn vào được pháthiện vào năm 1962 bởi Szybalska và Szybalski

- DNA ngoại lai hình thành đồng kết tủa với calcium phosphate; đi vào tế bào qua cơ chế thực bào (phagocytosis).

Giới thiệu

3

Sinh học

• Virus

Hóa học

• Cation polymer

• Calcium phosphat

Hóa chuyển nhiễm (chemical transfection): DNA và

calcium phosphate đồng kết tủa trên màng tế bào và được

tiếp nhận qua cơ chế nội nhập bào (endocytosis)

Hình 1 DNA ngoại lai được đưa vào tế bàobằng phương pháp hóa chuyển nhiễm

Đồng kết tủa calcium phosphate thường độc, một số loại tếbào không hấp thu kết tủa rắn

→sử dụng hợp chất polycation (poly – L – lysine,

polyamides, DEAE-dextran)

→hỗn hợp liplid tích điện dương tạo phức hợp với DNA

lớn như YAC.

Các phương pháp chuyển gen ở động vật

7

• xung điện cũng được sử dụng rộng rãi, một cách hiệu quảtrên nhiều loại tế bào và in vivo (da, cơ hay tế bào ung thư)

Ưu điểm: dễ sử dụng và khả năng áp dụng trên nhiều loại

tế bào.

• Phương pháp vi tiêm mang lại hiệu quả cao nhưng đòi hỏinhiều công sức và áp dụng trên một số loại tế bào nhất định,như là giao tử cái, trứng, tế bào phôi sớm

• Phương pháp bắn gen có thể được áp dụng đối với các tếbào được nuôi cấy hay mô cũng như các ứng dụng in vivo

(cho tế bào da)

9Các phương pháp chuyển gen ở động vật

Phương pháp vật lí

Hình 3 Vi ảnh thể

hiện cấu trúc màng của tế bào hồng cầu được đông lạnh ở các thời điểm khác nhau (t),

truyền xung điện, (a) t= 0,5 ms, (b) 2,5 ms, (c) 40ms, (d) 5s, (e) 10s (Chang & Reese, 1990).

Hình 4 Thao tác vi tiêm thực hiện trên hợp tử ở giai

đoạn sớm

11

• DNA không tái bản, không được xác nhập sẽ bị phân hủy,

và chỉ dẫn đến biểu hiện tạm thời (transient expression)

• Ở một phần nhỏ của các tế bào được chuyển nhiễm, DNA

có thể xác nhập vào bộ gen tế bào nhận, tái bản và tạo

các dòng tế bào biến đổi gen bền vững (stable

expression) Các tế bào này được chọn lọc bằng các

marker

Sự xác nhập DNA

http://blog.addgene.org/ plasmids-101-mammalian-vectors13

• Dihydrofolate reductase (DHFR) và tính khángmethotrexate.

Các dòng tế bào hoang dại nhạy cảm với Mtx 0,1 µg/mL, trong khi các dòng kháng (Mtx – resistant) được chọn lọc.

• Rodent CAD (carbamyl-P synthetase/aspartate

transcarbamylase/dihydro-orotase genes)

CAD protein là enzyme đa chức năng tham gia vào các bước đầu tiên trong quá trình sinh tổng hợp uridine Một trong các bước này bị ức chế bởi N-phosphonacetyl- L – aspartate (PALA) Các tế bào động vật có vú sản xuất lượng lớn CAD từ các bản sao của gen CAD.

Marker chọn lọc

• XGPRT (xanthine – guanine phosphoribosyltransferase):mycophenolic acid resistance

Enzyme từ E coli này tương tự HGPRT ở động vật có

vú Môi trường chọn lọc được bổ sung adenine, mycophenolic acid và xanthine Hiệu quả chọn lọc tăng lên khi bổ sung thêm aminopterin để khóa con đường nội sinh tổng hợp purine.

• Neomycin phosphotranferase: kháng G418

Mã hóa bởi Transposon Tn5 và Tn601, thể hiện tính

kháng các kháng sinh aminoglucoside (Kanamycin,

neomycin và G418) – các chất ức chế sinh tổng hợp

protein, hoạt động ở tế bào nhân sơ và nhân thật

15

Marker chọn lọc

• Hệ thống biểu hiện gen (cassette) của các plasmid pSV

và pRSV điều khiển biểu hiện gen chloramphenicolacetyltransferase (CAT) từ vi khuẩn E coli (Tn9), mã hóa

tính kháng chloramphenicol, phục vụ phân tích biểu hiệngen tạm thời Protein này không hoạt động trong tế bàonhân thật

• Luciferase là repoter gen được sử dụng rộng rãi ở các hệthống động vật và thực vật Xúc tác sự oxi hóa luciferintrong phản ứng cần khí oxi và ATP và tỏa ánh sáng vàng– xanh lá

Gen chỉ thị (reporter gene)

• Để chọn giống vật nuôi cần phải chọn lọc qua nhiều thế hệ, tốn nhiều chi phí và công lao động.

• Sự đưa vào dòng thuần một tính trạng mới có thể gây hại/giảm năng suất của con vật và cần nhiều thời gian để tái lập dòng thuần mới.

• Sự thành công của việc chuyển gen vào tế bào động vật có vú và của việc cấy chuyển nhân sinh dưỡng vào tế bào trứng mất nhân cho phép thực hiện tạo dòng vô tính động vật biến đổi gen.

Sự tạo dòng vô tính ở động vật có vú

17

Gen nhân dòng được tiêm vào hợp tử

Hợp tử (được tiêm) được cấy vào con

cái để hoàn thành quá trình phát triển

https://phys.org/news/2013-03-mouse-clones.html

Hình 5 Các bước tạochuột chuyển gen.Tiền nhân đực (malepronucleus) ở hợp tử(fertilised egg) được

vi tiêm DNA;Hợp tử được biến đổiđược chuyển vào ốngdẫn trứng (oviduct)của chuột cái mang

(pseudopregnant).Hợp tử này phát triểnthành chuột chuyểngen

Hình 6 Các bước tạo chuột chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc.

Tế bào gốc phôi với gen mục tiêu được biến đổi được vi tiêm vào phôi nang (blastocyst) Phôi nang này được cấy vào

tử cung của chuột mẹ mang thai giả Phôi sẽ phát triển thành chuột chuyển gen mang đặc điểm di truyền từ các tế bào trong phôi ban đầu

và từ tế bào gốc.

21

• Thiết lập mô hình động vật phục vụ nghiên cứu các bệnh

ở người (Phương pháp “gene knock-out”)

• Sản xuất các protein quí

Sử dụng tuyến vú cho sản xuất các protein dược phẩm

có trong sữa (yếu tố IX giúp đông máu) Sữa có thể đượctái tạo liên tục, lượng lớn, quá trình tinh chế protein cầnthiết đơn giản hơn

Vector retrovirus được chuyển

vào tế bào giai đoạn phát triển

phôi sớm

Vi tiêm vào nhân nguyên đực đã

trương to của trứng thụ tinh

Đưa các tế bào gốc phôi đã cải biến vào phôi giai đoạn sớm, trước khi chuyển vào con cái nhận.

Tạo chuột chuyển gen sử dụng Retrovirus

23

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/retroviruses/

Hình 8 Vector retrovirus có vị trí tạo dòng (cloning site) nằm trong vùng DNA có nguồn gốc từ retrovirus Vector tái tổ hợp được tạo ra (mang đoạn chèn - màu đỏ)

và nhân lên trong tế bào E coli.

DNA tái tổ hợp được đưa vào tế bào ĐVCV dưới hình thức chuyển nhiễm Một số tế bào tiếp nhận DNA và tạo virus tái tổ hợp Các virus tái tổ hợp này tiếp tục xâm nhiễm và biểu hiện gen ở các tế bào mới.

25

- Không an toàn cho các sản phẩm chuyển gen là thực phẩm

Tạo chuột chuyển gen sử dụng retrovirus

Kích thích con cái rụng trứng hàng

loạt (35 trứng thay vì 5 – 10 trứng ở

điều kiện bình thường)

Cho giao phối và thu trứng đã thụ tinh

Vi tiêm được tiến hành ngay sau khi thu trứng Gen được tiêm thường ở dạng DNA mạch thẳng.

Tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

27

Ở động vật có vú, sau khi tinh trùng đi vào trứng, nhântinh trùng (nhân nguyên đực, male pronucleus) và nhântrứng là những thực thể riêng biệt Nhân nguyên đực lớnhơn nhân nguyên cái, có thể phân biệt dưới kính hiển vi.

Hình 9 Vi ảnh huỳnh quang của trứng/phôi được thụ tinh in

vitro (A, B) hay in vivo (C,D) được nhuộm Hoechst cho

thấy tiền nhân pronuclei hay nhân (mũi tên không tô), cácthể cực (đầu mũi tên), và tinh trùng (mũi tên tô đậm) Thanh

ngang = 50 μm A) Noãn với 2 nhân nguyên và 1 thể cực,

và tinh trùng ở vùng trong suốt B)Phôi giai đoạn 2 tế bào với 2 nhân, 2 thể cực và tinh trùng C) Phôi giai đoạn 2 tế

bào , 2 nhân và 2 thể cực D) Phôi ở giai đoạn 4 tế bào với

4 nhân và 2 thể cực

Tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

Hình 9 Vi ảnh huỳnh quang của trứng/phôi được thụ tinh

in- vitro (A, B) hay in vivo (C,D) được nhuộm Hoechst

(http://www.biolreprod.org/content/67/1/256/F1.expansion) 29

Sau vi tiêm, 20 - 30 trứng được cấy vào chuột mẹ nuôi cóchữa giả (giao phối với chuột đực đã cắt ống dẫn tinh) Ởchuột, giao phối là phương pháp duy nhất để chuẩn bị tửcung cho việc cấy tiếp theo 3 tuần sau khi cấy chuột mẹnuôi sẽ sinh ra chuột con từ trứng được tiêm vào.

Xác định DNA chuyển ở chuột con DNA từ chóp đuôi chuộtcon được phân tích bằng Southern Blot hay PCR để pháthiện gen chuyển Chọn lọc cá thể mang gen chuyển trong tếbào sinh dục

Tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

Hạn chế

- Đoạn DNA chuyển vào gắn ngẫu nhiên

- Nhiều bản sao của gen gắn cùng một chỗ gây biểu hiện gen quá mức, rối loạn sinh lý.

Hiệu quả

66% hợp tử sống sót sau khi tiêm

25% hợp tử phát triển thành chuột con

25% chuột con là chuột chuyển gen

Trong 1000 trứng thụ tinh được tiêm, khoảng 30 – 35 chuột con chuyển gen.

Tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

31

Các tế bào ở giai đoạn túi phôi của phôi chuột đang phát triển có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy

và có khả năng biệt hóa (kể cả phát triển thành tế bào dòng sinh dục) được gọi là tế bào gốc phôi (Embryonic stem, ES)

Tính năng của tế bào ES không thay đổi khi được dùng trong thao tác gen Gen chuyển có thể được cài vào các vị trí đặc biệt trong bộ gen của tế bào ES.

Tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp Cải biến tế bào gốc phôi

Hình 10 Chuyển gen vào tế bào gốc phôi ở chuột

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=cooper&part=A483

1 Thiết lập dòng tế bào gốcphôi (ES) được nuôi cấy

2 Vector mang gen mục tiêuđược chuyển vào tế bào gốcphôi được nuôi cấy

3 Tế bào gốc phôi mang trình tự gen

chuyển trong nhiễm sắc thể được tiêm

vào phôi nang của chuột

4 Phôi nang trên được chuyển vào chuột

mẹ mang thai hộ Chuột con thể khảm

được sinh ra, giao phối với chuột thường

và sinh ra chuột con mang tính trạng qui

định bởi gen từ tế bào gốc phôi

33

Chọn lọc dương – âm tính

•Hệ tái tổ hợp Cre – loxP xuất xứ từ yếu tố di truyền của thực khuẩn thể P1.

•Sự cài nhập của bộ gen P1 tùy thuộc vào sản phẩm

recombinase), cắt đặc hiệu và tái tổ hợp DNA của loxP (locus of crosing over [x] in P1)

•Kỹ thuật này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu ảnh hưởng của sự bất hoạt gen đặc hiệu mô nhằm thiết lập mô hình về các bệnh ở người

Biến đổi gen bằng hệ tái tổ hợp Cre - loxP

Quá trình tạo tế bào ES với 1 gen bị bất hoạt.

39

Thymidine kinase (tk)

• Marker chọn lọc âm tính cho phép chọn lọc các tế bào không thể hiện hay mang các gen marker này.

• Mã hóa bởi gen tk virus herpes phosphoryl hóa các

dạng nucleoside rất hiệu quả như ganciclovir Nucleotide được tạo ra có thể được sử dụng bởi DNA polymerase và đóng vai trò như dấu hiệu kết thúc chuỗi.

• Các tế bào biểu hiện gen tk có thể bị loại khi nuôi

trong môi trường chứa ganciclovir

Chuyển gen với các vector dung lượng lớn

• BAC – NST nhân tạo vi khuẩn

• PAC - dẫn xuất từ thực khuẩn thể P1

• YAC – NST nhân tạo nấm men

• MAC – nhiễm sắc thể của động vật có vú

Các NST này có thể mang DNA bộ gen từ 100 tới hơn 1000 kb.

Phương pháp chuyển gen: vi tiêm