bai 3 cndt 2 th c v t bi n i gen

Các phương pháp đưa DNA vào tế bào thực vật• Chuyển gen qua trung gian plasmid Ti• Bắn vi đạn• Vector virus• Chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần• Vi tiêm• Tạo lỗ bằng điện• Dung hợp lip

Công nghệ Di truyền 2

Chuyển gen ở thực vật

Tình hình cây trồng biến đổi gen toàn cầu

Diện tích cây trồng biến đổi gen toàn cầu 1996 - 2015

4

Diện tích cây trồng biến đổi gen toàn cầu 1996 – 2014

theo loại cây trồng

Diện tích cây trồng biến đổi gen toàn cầu 1996 – 2014

theo tính trạng

6

Diện tích cây trồng công nghệ sinh học chính (triệu hecta) năm 2015

Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu: xếp hạng theo quốc gi a

8

Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm 2014 và 2015

Các phương pháp đưa DNA vào tế bào thực vật

• Chuyển gen qua trung gian plasmid Ti

Những vấn đề có liên quan: vector, promoter, marker chọn lọc

(Steward, S.N 2010 Transformation technology

Wiley-Blackwell)

10

Các vị trí mục tiêu chuyển gen ở tế bào thực vật bao gồmnhân, lạp thể (plastid) và ty thể (mitochodrion)

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

Kỹ thuật chuyển gen thông qua túi phấn

( Pollen Transformation Technologies )

• Chuyển gen thành công vào nhân tế bào khi

DNA được chuyển tiến vào nhân và xác nhập

vào vật liệu di truyền của tế bào mục tiêu.

• Cây biến đổi gen được tạo ra từ tế bào mang gen được chuyển một cách trực tiếp hay thông qua

giao tử được biến đổi di truyền (vd hạt phấn).

• Hiệu quả

vật phát triển thành cây hoàn chỉnh thông qua quá trìnhnuôi cấy mô

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT QUA

TRUNG GIAN Agrobacterium

▪ Vi khuẩn G(-) sống trong đất, gây bệnh bướu rễ ở thực vật, có khả năng tấn công một số vùng của cây, bám vào những kiểu tế bào thực vật nhất định

và chèn vào một phần DNA của chúng (T-DNA) vào bộ gen thực vật

▪ Cây bị nhiễm khuẩn mang bướu ở thân được tạo từ các tế bào tăng sinh mang DNA vi khuẩn.

▪ T-DNA được bao bọc bởi các protein vi khuẩn giúp

nó không bị phân hủy,

▪ T-DNA nằm trong Ti plasmid Ở vi khuẩn dạng hoang dại, T-DNA chứa các gen cho sự tổng hợp các opine và các hormone thực vật.

Agrobacterium tumefaciens

Cấu trúc một số opine Thành phần cơ bản

của opine là các amino acid.

20

Tế bào biến đổi gen có thể được tạo ra thông qua đồng nuôi

cấy tế bào sinh dưỡng với tế bào A tumefaciens biến đổi

(T-DNA mang gen tạo bướu được thay thế bởi gen mongmuốn)

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT QUA TRUNG GIAN

Agrobacterium

Các gen ở vùng “virulence” (gen vir) thuộc cùng một opreron

virABCDEFG, mã hóa cho các enzyme chịu trách nhiện

chuyển T-DNA vào tế bào thực vật

• virA mã hóa cho receptor phản ứng với các hợp chất

• virB mã hóa các protein tạo thành cấu trúc dạng lỗ/pilus.

• virC bám vào trình tự được chuyển

• virD1 và virD2 tạo các endonuclease nhận biết và cắt ở các

vùng biên của T-DNA, bắt đầu ở RB

• virG hoạt hóa sự biểu hiện gen vir sau khi bám vào một

vùng trình tự bảo tồn (consensus sequenence) khi nó được

phosphoryl hóa bởi virA

Ti plasmid ở Agrobacterium tumefaciens

22

Sơ đồ mô tả sự vận chuyển

Sự vận chuyển T-DNA từ Agrobacterium sang tế bào thực vật

24

Sự hình thành bướu rễ ở thực vật bởi A tumefaciens

A tumefaciens xâm nhập vào mô thực vật thông

qua các vết thương trên cây.

Các vết thương có 2 chức năng: giải phóng và cho phép vi khuẩn xâm nhập vào nhiều loại mô khác nhau.

Các thao tác trên vật liệu cấy mô thường tạo đủ vết thương;

Có thể tạo thêm vết thương bằng lưỡi dao mổ

hoặc kim tiêm để tăng khả năng xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn.

Các phương pháp lây nhiễm Agrobacterium

26

Các bước tạo cây chuyển gen nhờ Agrobacterium

Chọn lọc mô sẹo kháng phosphinothricin và tái

sinh cây

1- mô sẹo được tạo ra từ phôi trưởng thành 2- mô sẹo sau 21 ngày ở

điều kiện sáng.

3- mô sẹo được sàng lọc qua tính kháng PPT 4- Cây kháng PPT hình

thành rễ 5- Sự tái sinh cây kháng

PPT

28

Sequential stages during the genetic transformation of common

• Ti plasmid dạng tự nhiên không phù hợp cho chuyển gen vì

nó tạo nên sự phát triển vô tổ chức của các tế bào thực vật

• Để tăng hiệu quả chuyển gen, vùng mã hóa các oncogenes (các gen tạo ung thư) ở T-DNA phải được loại bỏ

(disarmed)

• Zambryski và cs (1983) đã thay thế T-DNA của pTiC58

bằng các trình tự của pBR322, chỉ để lại các trình tự vùng

biên (LB, RB) và gen nos, tạo nên plasmid pGV3850.

• Các marker chọn lọc là các gen mã hóa các enzyme phângiải các nhóm chức năng của kháng sinh,

- Ở thực vật: kanamycin và G418

- Ở vi khuẩn: hydromycin, methotrexat, trimethoprim

Plasmid Ti trong chuyển gen ở thực vật sử dụng Agrobacterium

30

Sơ đồ cấu trúc plasmid pGV3850 với

vùng T-DNA đã được điều chỉnh

Binary vectors (vector nhị thể)

Vector chuyển gen ở thực vật thông qua Agrobacterium

32

➢ Binary plasmid còn được gọi là “shuttle vector” do nó có thể

tái bản ở các loại tế bào chủ khác nhau (vd như E coli và

Agrobacterium).

➢ Plasmid hỗ trợ mang trình tự gen vir mã hóa các protein liên

quan đến quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật

Hệ thống vector nhịthể gồm 2 plasmid: binary plasmid vàplasmid hỗ trợ (helper plasmid)

Vector đồng cài nhập

Glick và Pasternak 2007, trg 597

Vector đồng cài nhập

Vector chuyển gen ở thực vật thông qua Agrobacterium

36

Vector đồng cài nhập (tt)

Vector chuyển gen ở thực vật thông qua Agrobacterium

DNA có thể được chuyển ở dạng

➢plasmid,

➢các đoạn được phân lập hay các sản phẩm PCR,

➢binary vector mang gen cần chuyển.

Bằng phương pháp chuyển gen trực tiếp thì có thể sử dụng DNA ở bất kì hình thức nào.

Trong quá trình bắn gen, DNA được kết tủa trên các vi đạn bằng vàng hay tungsteng (0,4 – 1,2 μm) Các vi đạn di chuyển với tốc độ cao về phía tế bào thực vật và

đi qua thành tế bào, có thể vào vị trí nhân hay cận nhân.

Chuyển gen ở thực vật bằng cách bắn gen (Biolistics)

Các yếu tố ảnh hưởng hiệu quả chuyển gen

• Sự toàn vẹn của tế bào Phải đảm bảo sự toàn vẹn của tếbào khi chuyển DNA kích thước lớn Nếu các vi đan kếtdính thành cụm và đi vào cùng 1 tế bào sẽ gây tổn thươngcho mô

• Sự chuyển gen có thể được theo dõi bằng các biểu hiệngen tạm thời ở các tế bào sống (các tế bào chết hay bị tổnthương nặng không có biểu hiện này)

• Các yếu tố cần quan tâm khi tối ưu hóa việc chuyển DNAthông qua phân tích biểu hiện gen tạm thời: nồng độDNA, khoảng cách từ vi đạn đến mô mục tiêu, điều kiệnkết tủa DNA và kích thước vi đạn

Chuyển gen ở thực vật bằng cách bắn gen (Biolistics)

40

Promoter là vùng DNA nằm trước gen mã hóa (vùng upstream) mang các trình tự chuyên biệt được nhận biết bởi các protein tham gia vào quá trình khởi đầu phiên mã.

• Promoter thường trực (constitutive promoter)

CaMV35S là loại promoter phổ biến nhất có nguồn gốc

từ virus khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus)

(tissue-specific/development – stage-specific promoter)

RbcS promoter (ribulose small subunit) promoter đặc hiệu cho biểu hiện gen ở lục lạp

bởi các yếu môi trường

tự chính có nguồn gốc khác nhau

Các loại promoters

42

Gen đánh dấu chọn lọc và gen chỉ thị

- Selective marker gene

- Reporter gene

Tham khảo Bảng 17.4, trg 602, Glick và Pasternak 2007

Chloroplast transformation

Schematic representation of the chloroplast-specific expression cassette.

The map of the chloroplast expression vector shows the integration sites determined by the particular flanking plastid DNA used, promoters, selectable marker genes, regulatory elements, and genes of interest used in different crop species Figure taken from Verma

Quá trình nuôi cấy mô thực vật – Hệ thống tái sinh

Quá trình nuôi cấy mô thực vật – Hệ thống tái sinh