bai 1 cndt 2 m u chuy n gen vi khu n

Mục tiêu môn họcLí thuyết• Nhớ được thành phần của các cấu trúc DNA tái tổ hợp và chứcnăng của từng thành phần; • Hiểu được các phương pháp chuyển cấu trúc DNA này vào tếbào vi khuẩn, nấ

TÔN BẢO LINH

tonbaolinh@hcmuaf.edu.vn

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

2/2019

Mục tiêu môn học

Lí thuyết

• Nhớ được thành phần của các cấu trúc DNA tái tổ hợp và chức năng của từng thành phần;

• Hiểu được các phương pháp chuyển cấu trúc DNA này vào tế

bào vi khuẩn, nấm men, tế bào thực vật và tế bào động vật và

• Hiểu được các ứng dụng của công nghệ gen

• Ý thức được lợi ích và rủi ro trong thực tế của sinh vật biến đổi gen

Nội dung đánh giá:

✓ Chuyên cần ( 10% ): hiện diện trên lớp (70%), bài kiểm tra

cá nhân (20%), tích cực tham gia trên lớp (10%).

✓ Bài tập nhóm ( 15% ): nộp đủ số lượng, đúng thời hạn và hình thức đẹp (30%), nội dung (70%).

✓ Thực hành ( 15% ): Hiện diện (10%), thái độ học tập và làm việc nhóm (10%), nội dung báo cáo (60%), thi thực hành (20%)

✓ Kiểm tra - đánh giá cuối kì ( 60 % ).

Đánh giá

Tài liệu tham khảo

• Glick B and Pasternak J J., 2007 Công nghệ sinh học phân

tử-Nguyên lý và ứng dụng DNA tái tổ hợp NXB Khoa học và kỹ thuật

Hà Nội.

Phần I.2 Các hệ thống sinh học dùng trong CNSH phân tử

Phần I.6 Thao tác biểu hiện gen ở các sinh vật nhân sơ

Phần I.7 Sản xuất protein dị chủng trong các tế bào nhân chuẩn

Phần III.17 Cải biến gen thực vật: phương pháp luận

Phần III.19 Động vật chuyển gen

• OLD R.W and Primrose S.B., 1994 Principles of Gene Manipulation Blackwell Science.

• Madigan M.T., Martinko J M., Parker J., 2003 Brock Biology of

Microorganisms (10 th ed) Prentice Hall Pearson Education

International.

5

Tạo vi sinh vật BĐG và biểu

hiện gen ở sinh vật nhân sơ

Sản xuất protein dị chủng

trong các tế bào nhân chuẩn

Cải biến gen thực vật

Giới thiệu môn học

Nuôi tế bào

Tạo dòng trình

tự DNA Tạo sinh vật biến đổi gen

Công nghệ di truyền/công nghệ gen là gì?

Genetic engineering is the manipulation of genetic material by either molecular biological techniques

or by selective breeding (Schildkraut, 2001).

The term ‘genetic engineering’ stands for human alteration of the genetic code of an organism, so that its biosynthetic properties are changed The major applications are for the industrial production

of desired peptides or proteins, or to alter the

2001).

Công nghệ di truyền hay biến đổi di truyền là việc tác động lên bộ gen của sinh vật bằng các kỹ thuật phân tử hoặc bằng cách chọn giống.

Gen được đưa vào được gọi là “gen chuyển” (transgene);

sinh vật nhận gene chuyển vào bộ gen một cách bền vững

được gọi là sinh vật biến đổi gen (transgenic organism hay transformed organism).

CNDT được sử dụng trong các ứng dụng thực tế (cải tạo giống cây trồng, vật nuôi hay tạo các sinh vật biến đổi gen),

Giới thiệu môn học

Quá trình biến đổi di truyền gồm

2 bước cơ bản:

(1) chuyển cấu trúc DNA đã biến

đổi vào một tế bào tạo tế bào

biến đổi gen,

(2) nhận sinh vật biến đổi gen từ

một tế bào biến đổi.

Sự xác nhập (integration) gen vào

bộ gen tế bào nhận có thể có

định hướng hay ngẫu nhiên.

NGUYÊN TẮC BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

Tiếp hợp (conjugation): phổ biến ở vi khuẩn, sự truyền thông tin di

truyền thông qua sự tiếp xúc trực tiếp giữa 2 tế bào

Chuyển nạp (transduction): là quá trình DNA ngoại lai được chuyển

vào tế bào bởi virus hay vector của virus Gen ngoại lai được xác nhậpbền vững vào bộ gen tế bào chủ

Chuyển nhiễm (transfection): quá trình chuyển nucleic acid (hay protein) tự do vào tế bào Thường dùng để nói đến chuyển gen ởsinh vật nhân chuẩn

Biến nạp (Transformation): thường được dùng để mô tả quá trình

chuyển vật liệu di truyền mới vào tế bào vi khuẩn, tế bào động vật vàthực vật

CÁC HÌNH THỨC CHUYỂN GEN

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

CÁC HÌNH THỨC CHUYỂN GEN

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

Tế bào trần lục mô (mesophyll

Phương pháp chuyển gen sử dụng PEG (Polyethylene glycol)

Sự biểu hiện gen tín hiệu(reporter gene) GUS (A) vàGFP (B) ở tế bào trần lục môcủa cây Arabidopsis

Đối tượng áp dụng: mô, tế bào, bào quan

Mục tiêu biểu hiện gen: phôi côn trùng và cá, tế bào động –

thực vật, phấn hoa, tảo, nấm sợi, mô thực vật - động vật, ti thể

và lục lạp.

Trạng thái mẫu sử dụng: in situ, in vitro, in vivo, và ex vivo.

Phương pháp bắn gen (Biolistics)

Hệ thống biolistics (Biorad PSD – 1000/He)

Các bộ phận của buồng bắn gen (Biorad PSD – 1000/He)

Quá trình bắn vi đạn (Biorad PSD-1000/He)

Thành phần của rupture disk với nắp đậy (bên trái) và thành phần của microcarrier (bên phải) (Biorad PSD – 1000/He)

Các thông số cảnh hưởng đến quá trình chuyển gen sử dụng hệ thống PDS-1000/He

Các điều kiện ưu tiên khảo sát nhằm tối ưu hóa các dạng

hệ thống sinh học khi sử dụng hệ thống PDS-1000/He

MicroPulser Electroporator

Đối tượng áp dụng:

vi khuẩn, nấm men và

protoplast thực vật

Phương pháp dùng xung điện (Electroporation)

Cuvette bằng thủy tinh/nhựa

với 2 điện cực bằng nhôm Thể

tích cuvette khoảng 400 µL

1 Sự tăng trưởng của tế bào

- Vi khuẩn: giữa giai đoạn tăng trưởng (mid-log)

- S cerevisiae: tăng dần từ giai đoạn đầu đến cuối giai đoạn tăng

- Ở Candida, Pichia và Tetrahymena DNA dạng thẳng cho hiệu

quả chuyển gen cao hơn dạng plasmid siêu xoắn tích hợp

(supercoiled integrating plasmids)

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen bằng

xung điện

3 Môi trường điện biến nạp:

Tế bào phải được tách ra khỏi môi trường nuôi và được rửa ítnhất 3 lần với nước hoặc các dung dịch không chứa ion như

glycerol, sucrose, glucose, sorbitol hay polyethylene glycol

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen bằng

xung điện

Đây là một kỹ thuật cho hiệu quả

cao nhưng rất tốn nhiều công

(4) Floating table (5) Remote-control Hydraulic Microdrive (6) Auxiliary light-weight manipulator (7) Microneedle holder

Phương pháp vi tiêm (Microinjection)

TẠO VI SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở

SINH VẬT NHÂN SƠ

•Khả nạp (Competence) Tế bào có thể tiếp nhận một phân tử DNA và

bị biến đổi được gọi là có tính khả nạp (competent) Tính chất này quiđịnh bởi di truyền qui và chỉ một số chủng nhất định có tính khả nạp

•Tế bào khả nạp nhân tạo (artificial competent cell).

- Tạo tế bào E coli khả nạp với nồng độ cao Ca2+ và bảo quản lạnh

- Tế bào E coli khả nạp có thể tiếp thu DNA sợi đôi → chuyển DNA

plasmid khá hiệu quả

CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO VI SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN

Phương pháp tiếp hợp

(conjugation)

Phương pháp điện biến nạp

(Electroporation) Phương pháp hóa biến nạp

Phần lớn vi khuẩn G(-) có khả năng trao đổi vật liệu di truyền (plasmid) bằng cách tiếp hợp với tần số cao.

Các hệ thống chuyển gen với phổ tế bào nhận rộng được sử dụng gồm 2 thành phần: plasmid vector mang vật liệu di truyền sẽ được chuyển vào tế bào nhận và plasmid hỗ trợ

Hệ thống này còn được gọi là hệ thống “binary vector”.

F plasmid đóng vai trò quyết định

F plasmid của E.coli 99,159 bp

oriT: điểm khởi đầu sự chuyển

gen trong quá trình tiếp hợp

Vùng màu vàng: transposable

elements, có thể cài nhập vào NST ở những vị trí tương đồng tạo thành các chủng Hfr

*Hfr (high frequency of

recombination): tần số tái tổ

Sự chuyển DNA plasmid trong quá trình tiếp hợp

Sự kết hợp của F plasmid vào NST và hình thành Hfr

CHUYỂN GEN SỬ DỤNG TÁC NHÂN HÓA LÝ

Tạo tế bào khả nạp (electro-/chemical

competent cell) dùng trong chuyển gen

bằng cách sốc nhiệt hoặc dùng xung điện

Chuyển gen bằng cách sốc nhiệt hoặc dùng

xung điện

Sàng lọc tế bào mang gen chuyển trên môi

trường chọn lọc

• Chọn khuẩn lạc trên “masterplate” ly trích

SÀNG LỌC VI KHUẨN CHUYỂN GEN

Tế bào E.coli sau khi tăng sinh được

chọn lọc trên môi trường LB chứakháng sinh, IPTG và X-gal

Khuẩn lạc đơn màu trắng và xanhđược chọn để phân tích

SÀNG LỌC VI KHUẨN CHUYỂN GEN

Phân tích bằng enzyme

giới hạn

Vector tái tổ hợp

PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN

1

• Cảm ứng biểu hiện gen với thời gian tăng dần

(vd, Isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside, IPTG)

2 • Ly trích, tinh sạch protein, điện di

3 • Chuyển protein lên màng, Western blot

A Protein dịch chiết thô tế

bào E coli

B Protein dịch chiết bào E

coli sau tinh sạch

Tank transfer apparatus for Western blotting Schematic showing the

assembly of a typical Western blot apparatus with the position of the

position of the gel, transfer membrane and direction of protein in

relation to the electrode position.

• SURE cell: {e14–(McrA–) Δ.(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1

supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]} (Stratagene, La Jolla, CA).

• DH5α: [Fˉφ80lacZΔM15 Δ.(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rkˉ, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-] (Invitrogen, Carlsbad, CA).

• TOP10F’: F′ {lacIq, Tn10(TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)

Φ80lacZΔM15 ΔlacΧ74 recA1deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG (Invitrogen, Carlsbad, CA).

• BL21(DE3)pLysS: Fˉ, ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)

CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ PHỔ BIẾN TRONG CHUYỂN GEN Ở VI KHUẨN

Vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong biểu hiện gen

41

VECTOR BIỂU HIỆN GEN

Vector biểu hiện gen pRSET

VECTOR BIỂU HIỆN GEN

Các vector với các chức năng khác nhau đã được cải tiến phù hợp với nhiều ứng dụng như:

• dùng trong biểu hiện protein

• phát hiện các tín hiệu điều hòa

• Chọn lọc trực tiếp các vector tái tổ hợp

• Với các vị trí cắt bổ sung

• Với các marker chọn lọc bổ sung

• Phục vụ giải trình tự DNA

• Cho phép giải phóng protein

VECTOR DÙNG TRONG CHUYỂN GEN Ở E.COLI

Thực khuẩn thể và cosmid vector

Thực khuẩn thể lamda có bộ gen gồm một DNA mạch thẳng, sợi đôi kích thước khoảng 45 kb Lamda DNA trong tự nhiên có 2

đầu đính để tạo thành vị trí cos

Trong quá trình chuyển nhiễm, DNA lamda sẽ kết hợp với DNA ngoại lai tạo thành cosmid.

VECTOR DÙNG TRONG CHUYỂN GEN Ở E.COLI

45

để chèn các phân đoạn lên đến 15 –

20 kb

• Tế bào khả nạp luôn được giữ lạnh trong khi thao tác

• Sự phù hợp giữa tế bào khả nạp và vector cần

chuyển cũng như các tác nhân chọn lọc (kháng

sinh, chất chỉ thị màu)

• Vector dùng trong tạo dòng thường có trọng

lượng thấp, mang tính trạng có thể chọn lọc

được ở tế bào chủ và các vị trí cắt duy nhất đối

với nhiều enzyme cắt giới hạn.

MỘT SỐ LƯU Ý