bai 2 cndt 2 chuy n gen t b o n m men

HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN SINH VẬT TIỀN NHÂNProteinđược tổng hợp từ vi khuẩn thường không bền hoặckhông cóhoạt tính sinh học, do• 1 sự xoắn cuộn protein khác nhau thể vùi, inclusio

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

Chuyển gen ở nấm men

Tháng 2/2019

HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN

SINH VẬT TIỀN NHÂN

Protein được tổng hợp từ vi khuẩn thường không bền hoặc không có hoạt tính sinh học, do

• (1) sự xoắn cuộn protein khác nhau (thể vùi, inclusion body), tạo cầu nối disulfide không chính xác

• (2) ở tế bào nhân sơ không có các biến đổi sau dịch mã qua

đó các nhóm hóa học chức năng không được gắn vào vị trí amino acid đặc hiệu

• (3) không tổng hợp được protein gồm nhiều tiểu đơn vị

E coli chưa từng được sử dụng trong lên men công nghiệp

như các vi khuẩn Gram +, vd Bacillus (amylase, protease),

actinomycetes (kháng sinh) hay coryneforms (amino acid, steroid) Tuy nhiên, việc tạo dòng ở các vi khuẩn này không

hiệu quả như ở E coli.

Quá trình phiên mã, dịch mã

3

Sự hình thành mRNA chức năng ở tế bào nhân chuẩn

Quá trình glycosyl hóa ở nấm men

• Các glycans ở nấm thường chỉ

gồm mannose

• S cerevisiae là một trường hợp

ngoại lệ tạo nhiều phản ứng

mannose hóa, không diễn ra ở tất

• Liên kết α-1,3-Man ở cuối chuỗi

mang tính miễn dịch với vật thể lạ

ở động vật có vú.

5

Các hệ thống biểu hiện gen phổ biến ở eukaryote

Hệ thống biểu hiện gen ở tế bào nhân chuẩn đã được phát triểnnhằm khắc phục những hạn chế ở tế bào tiền nhân

• Tế bào thực vật/ bào quan (organs)

• Bào quan thực vật: lục lạp (chloroplasts)

• Protein tái tổ hợp từ tế bào nhân chuẩn có tính ổn định và hoạttính sinh học phù hợp cho các nghiên cứu hóa sinh, lý sinh vàcấu trúc,

vd các protein tái tổ hợp dùng trong y học như hormone tăng trưởng người( rHGH ), yếu tố VIII (điều trị bệnh máu khó đông).

• Yeast

ƯU ĐIỂM CỦA HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN

2 chủng nấm men thường được sử dụng là

Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris 7

• Sinh vật nhân chuẩn, đơn bào, đường kính khoảng

5 µm, có 16 nhiễm sắc thể (n)

• Bộ gen S cerevisiae gồm khoảng 1,2 x 107 cặp

base, nhỏ hơn bộ gen người 200 lần

• Nấm men có thể phát triển dễ dàng trong môi

trường nuôi cấy, thời gian phân chia khoảng 2 giờ

→ bộ gen có kích thước nhỏ, sinh sản nhanh (giống

vi khuẩn).

• Nấm men sinh sản bằng cách này chồi hay phân

chia trực tiếp (fission), hoặc có thể phát triển ở dạng sợi khuẩn ty (mycelium).

SINH HỌC NẤM MEN

Tế bào nấm men

Nguồn: www.bbc.co.uk

9

• Công nghiệp thực phẩm

• Sản xuất sinh khối (single-cell protein,

SCP)

• Nhiên liệu sinh học

• Tạo chất chuyển hóa sinh học (lipases,

dehydrogenases, or invertase)

• Mô hình nghiên cứu về di truyền và phân

tử và sinh vật nhân chuẩn

CÁC ỨNG DỤNG CỦA NẤM MEN

(Żymańczyk-Duda, 2017)

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN

cerevisiae ( nấm men không có thành tế

bào) được hòa cùng polyethylen glycol

tạo thành tế bào trong môi trường ổn định

chứa 3% agar.

• Kỹ thuật dùng xung điện (electroporation)

hiện nay thay thế cách dùng spheroplast

nấm men vì dễ thực hiện và nhanh hơn

lọc trên bề mặt môi trường rắn.

11

Các phương pháp chuyển gene

• Dùng hạt thủy tinh (glass bead method)

Chọn lọc tế bào biến đổi

• Dựa vào đột biến khuyết dưỡng (auxotrophic mutations)

Chủng mang một đột biến ở 1 trong các gen (ura3, leu2, trp1, his3) tương đương với các gen (URA3, LEU2,

TRP1, HIS3) có trong vector.

• Các marker chọn lọc: kháng G418, cyclohexamide,

formaldehyde, Cu2+

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN

(a) Yeast cells at stationary phase, (b) yeast cells at logarithmic phase, (c) spheroplasts obtained

by enzymatic treatment of cells, (d) nuclei (arrows) isolated from spheroplasts by osmotic shock for centrifugation onto a silicon chip (shown in e) according to Step 6A In all images, scale bar =

0.5 mm This figure demonstrates Saccharomyces cerevisiae cells In the case of Saccharomyces pombe, the initial cell differs in shape and is more 'rod-shaped'; however, the spheroplasts and isolated nuclei look very similar to S cerevisiae when visualized using the light microscope.

Tế bào Sacchromyces cerevisiae ở các pha khác nhau trong chu

kì tế bào.

Thanh ngang = 0,5 mm

13

Bốn loại vector biểu hiện chính ở S cerevisiae:

➢ vector dạng episome nấm men (YEp, yeast episomal plasmid),

➢ Vector mang trình tự ARS (YRp, yeast replicating

plasmid),

➢ vector cài nhập (YIp, yeast integration plasmid ),

➢ Vector mang trình tự tâm động (Ycp, yeast

centromere plasmid)

và các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC).

CÁC VECTOR CHUYỂN GEN CHÍNH Ở NẤM MEN

VECTOR E COLI - NẤM MEN

Điểm khởi đầu tái bản ở nấm men

15

Các tế bào bị biến đổi có thể được chọn lọc dựa vào đột biến khuyết dưỡng (auxotrophy) và đặc điểm của đoạn gen chèn vào

(gen qui định tính nhạy cảm với nhiệt độ, temperature-sensitive

CÁC VECTOR NẤM MEN

MARKER CHỌN LỌC

Các marker được sử dụng ở nấm men bao gồm URA3, HIS3, LEU2, TRP1 và LYS2 và bổ sung cho các chủng

nấm men đột biến khuyết dưỡng bao gồm ura3-52,

his3-D1, leu2-D1, trp1-D1 and lys2-201.

Các thể đột biến khuyết dưỡng ở nấm men đã được chọn bởi tỉ lệ hồi tính thấp của chúng.

Ngoài ra, các gen marker URA3, HIS3, LEU2 và TRP1

của nấm men có thể bổ trợ cho các đột biến khuyết

dưỡng chuyên biệt ở E coli.

17

YEAST VECTORS

YIp = yeast integrating plasmid,

• thường chỉ 1 bản sao

• Cài nhập vào bộ gen

YCp = yeast centromeric plasmid

• tự tái bản, 1-2 bản sao

• ví dụ: sử dụng trong nghiên cứu tổ hợp gen (complementation

study)

YEp = yeast episomal plasmid

• plasmid có số lượng bản sap cao

• Mang trình tự plasmid 2 µm

• dùng trong tạo protein tái tổ hợp

YRp= yeast replicating plasmid

• Mang trình tự ARS có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể nấm men

• Tái bản độc lập

• Kém bền

YEp plasmid

YEp được phát triển từ episom plasmid 2 µm của nấm men FLP: mã hóa cho recombinase

REP 1&2: mã hóa protein tham gia tái bản plasmid

D: vị trí phát huy sự tái bản plasmid

19

• Các vector YEp (Yeast episomal plasmid) tái bản tự do với sự hiện diện của một đoạn plasmid nấm men 2 µm đóng vai trò như vị trí khởi đầu tái bản (2 µm ori).

• Trình tự 2 µm ori giúp YEp vector có tần số chuyển gen cao

100 copies/cell).

• Hầu hết YEp plasmid không bền vững, lượng tế bào mất trung bình thấp nhất 10-2 nhiều hơn sau mỗi thế hệ Ngay cả khi ở điều kiện tăng trưởng chọn lọc, chỉ từ 60 – 95% tế bào còn mang YEp plasmid.

• Số lượng bản sao/tế bào: ~ 10 – 40 copy Tuy nhiên, plasmid không phân phối đều trong tế bào.

Vector YEp

21

YCp plasmid

Mang một phần trình tự ARS

và trình tự tâm động của NST

(quan trọng cho sự phối hợp giữa

plasmid và thoi vô sắc của tế bào).

Lượng bản sao plasmid ở mỗi

tế bào giới hạn từ 1 - 2

YCp tồn tại ổn định mà không cần xác nhập DNA

như YIp vector, là sự lựa chọn lí tưởng cho vector tạo dòng gen, xây dựng thư viện gen nấm men, và khảo

sát chức năng gen được thay đổi in vivo.

• YIp thiếu trình tự ARS nhưng mang trình tự cho phép kết hợp (intergrate) vào NST với tần suất cao

(homologous recombination, tái tổ hợp tương đồng)

• Sự kết hợp trình tự DNA vào NST nấm men làm chúng

có thể phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng và đạt đến mật độ cao mà không mất đi gen mong muốn

• Vì thế ở hệ thống này, sự biểu hiện protein cao phụ thuộc vào lựa chọn promoter hơn là lượng bản sao plasmid.

YIp (Yeast integrating plasmid)

23

YIp xác nhập với DNA bộ

gen bởi tái tổ hợp đồng

vững và gia tăng biểu hiện

của các gen chuyên biệt.

YIp (Yeast integrating plasmid)

• Các hệ thống tạo dòng YAC dựa trên plasmid mạch thẳng của nấm men, nổi bậc là YLp, chứa các trình

tự DNA có chức năng như telomeres (TEL) in vivo,

cũng như mang các đoạn ARS và CEN

• YAC vector có thể mang đoạn DNA lớn (lên đến 2 Mb), nhưng hiệu quả chuyển gen rất thấp.

Các thành phần chủ yếu của YAC:

• Centromeres (CEN), telomeres (TEL) và trình tự tái bản độc lập (ARS)

• Marker: ampr , TRP1 và URA3

• Vị trí nhận biết cắt giới hạn (như là EcoRI và

BamHI)

YAC (Yeast artificial chromosome)

25

CÁC VECTOR NẤM MEN – YAC (Yeast artificial

chromosome)

Promoter biểu hiện gen

29

Promoter biểu hiện gen

Thông thường, các promotor

cảm ứng có thể kiểm soát

chặt chẽ việc phiên mã,

được sử dụng để sản xuất

một lượng lớn protein tái tổ

hợp vào một thời điểm nhất

định trong nuôi cấy mô qui

Chẩn đoán

Protein virus viêm gan C Các kháng nguyên HIV-1

Các tác nhân chữa bệnh ở người

Tác nhân tăng sinh biểu bì Insulin

Proinsulin Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi Yếu tố đông máu XIIIa

Hyrudin Albumin huyết thanh người

Promoter biểu hiện gen

31

Một số đặc điểm của hệ thống biểu hiện nấm men

• Phần lớn gen dị chủng có một trình tự DNA mã hóa

cho 1 đoạn aa (trình tự tín hiệu, trình tự dẫn) →giải

phóng và bảo vệ protein tái tổ hợp, tăng lượng protein tiết, hỗ trợ việc tinh sạch protein

• VD Trình tự tín hiệu sử dụng trên S cerevisiae có

nguồn gốc từ gen nhân tố giao phối α

• Các hệ thống biểu hiện dựa trên plasmid thường

không bền trong các điều kiện sinh trưởng qui mô lớn (bồn lên men > 10 lít) kể cá dưới áp lực chọn lọc

→ gắn gen cần biểu hiện vào NST tế bào chủ, sử dụng YAC.

TẠO PROTEIN DUNG HỢP HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH GẤP

VÀ BÀI TIẾT PROTEIN

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIA TĂNG BÀI TIẾT PROTEIN Ở NẤM MEN

1 Phân lập các dòng đột biến siêu bài tiết

• Đã được phân lập nhiều

• Hầu hết không ảnh hưởng bài tiết

• Hầu hết là tính trạng lặn

2 Dung hợp protein tái tổ hợp với một protein nội sinh được bài tiết

tốt

Yếu tố Prepro – α, Hsp150

3 Loại bỏ gen kiểm soát chất lượng

CNE (dạng tương đồng calnexin) → protein gấp sai

4 Biểu hiện vượt mức bộ máy gấp protein mạng lưới nội chất

PDI1 (protein disulfide isomerase)

5 Biểu hiện vượt mức các thành phần của bộ máy bài tiết

SEB1; SSO1, SSO2

6 Tối ưu hóa các điều kiện sản xuất

37

Yeast media

YPAD medium or Also Called YPD plus Adenine

Yeast Extract - Peptone - Dextrose plus Adenine medium

• 6.0 gm yeast extract (Difco)

12.0 gm Peptone (Difco)

12.0 gm Glucose

60 mg adenine hemisulphate

600 ml distilled water

Bacto-agar (Difco) 10 g (added for agar medium)

• Sterilise by autoclaving at 121°C for 15 min

We always use a 1 liter flask and make 600 mls of media because it gives exactly 20 plates (1 Sleeve of plates) In addition this volume

of liquid is more easily handled when pouring after autoclaving.

http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/media.html

Synthetic Complete drop-out Medium

250 ml plastic bottle Add three or four clean glass marbles and shake vigorously to mix

This quantity will be sufficient for approximately 100 (600 ml) batches

of SC drop-out medium Some recipes call for 20 amino acids in the

SC mixture however most yeast strains do not need all of them In addition some recipes do not use homoserine due to the expense, it can

be replaced by the addition of serine and threonine (2 grams each)

Yeast media

39