Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm từ nguyên liệu cá sấu bằng kỹ thuật hóa sinh.
Tổng quan vềcásấu
Phân loại khoahọc
Cá sấu là loài bò sát lớn, thường cư trú ở các môi trường sông hồ với dòng nước chảy chậm Chúng có chế độ ăn uống đa dạng và phân bố rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới, bao gồm Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ và Châu Đại Dương.
Vị trí, phân loại và phân bố củacásấu
Cá sấu là động vật có xương sống thuộc lớp bò sát, được phân loại trong bộ cá sấu gồm ba họ chính: Alligatoridae, Crocodylidae và Gavialidae, với tổng cộng 21 loài Đặc điểm phân biệt giữa các họ này bao gồm kích thước cơ thể, hình dạng mõm, sự sắp xếp của răng, hình dạng tổ, đặc tính da và phân bố địa lý.
1.1.2.1 Cá sấu Hoa Cà ( crocodylus prosus )
Cá sấu nước lợ phân bố chủ yếu ở Australia, Bangladesh, Brunei, Myanmar, Cambodia, Indonesia, Philippines, Thailand và Việt Nam, với kích thước lớn, trung bình dài từ 6 đến 7m và có tính hung dữ, có khả năng tấn công người Chúng sống ở các khu vực ven biển nước lợ và vùng nước ngọt như cửa sông, đầm lầy, và từng có vùng phân bố rộng tại Đông Nam Á Tại Việt Nam, cá sấu nước lợ xuất hiện từ Vũng Tàu, Cần Thơ đến Kiên Giang, Côn Đảo, nhưng do tình trạng săn bắt quá mức, loài này đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng, hiện chỉ còn khoảng 70 con nuôi tại Cần Giờ Cá sấu Hoa Cà cái trưởng thành từ 6-10 tuổi, dài từ 2,2 đến 2,5m, làm tổ đẻ trứng vào mùa mưa với khoảng 40-60 trứng, ấp nở trong 80-90 ngày Bộ da của cá sấu Hoa Cà có giá trị thương phẩm cao nhất.
Cá sấu Xiêm, sống chủ yếu ở các vùng đầm lầy nước ngọt, hồ, sông và suối có dòng chảy chậm, có kích thước nhỏ, dài tối đa khoảng 4m và trung bình khoảng 3m Chúng giao phối từ tháng 12 đến tháng 3 và đẻ trứng từ tháng 4 đến tháng 10, với mỗi lần đẻ từ 20 đến 50 trứng, ấp nở sau 75 đến 85 ngày Trước đây, cá sấu nước ngọt phổ biến ở sông Đồng Nai, Tây Nguyên và khắp Nam bộ, nhưng do bị săn bắt quá mức, phạm vi sống của chúng đã thu hẹp, hiện chỉ còn thấy ít ở Kontum và Đaklak Loài cá sấu này dễ thuần hóa và nuôi dưỡng, đang được phát triển trong chăn nuôi để lấy da và thịt thương phẩm tại Việt Nam.
Tình hình chăn nuôi cá sấu trên thế giới vàViệtNam
1.1.3.1 Tình hình nuôi cá sấu trên thếgiới
Cá sấu là động vật quý hiếm, từng bị coi là có hại sau chiến tranh thế giới thứ hai, dẫn đến việc săn bắt tự do và sự khan hiếm của chúng Năm 1971, do nạn săn bắt, nhiều quốc gia đã đồng ý cấm xuất khẩu sản phẩm cá sấu, được bảo vệ bởi Công ước CITES Tuy nhiên, từ năm 1986, cá sấu nuôi được phép xuất khẩu Để bảo tồn và phát triển cá sấu, nhiều quốc gia như Thái Lan, Campuchia, Malaysia, Cuba, Hoa Kỳ và Việt Nam đã xây dựng các trại nuôi với hàng nghìn con cá sấu Ở Ấn Độ và Papua New Guinea, dự án nuôi cá sấu đầu tiên do FAO triển khai vào những năm 70 nhằm cứu loài cá sấu mõm dài sông Hằng khỏi tuyệt chủng Sau đó, FAO tiếp tục hỗ trợ nhiều quốc gia khác ở châu Á-Thái Bình Dương, châu Phi và Mỹ Latinh phát triển nghề nuôi cá sấu (theo Lê Trung Thiên, 2016).
Nhiều trại chăn nuôi cá sấu, bao gồm cá sấu sông Nile và cá sấu nước mặn, đang phát triển mạnh mẽ ở Úc, trong khi cá sấu Caiman, mặc dù có giá trị kinh tế thấp, vẫn được nuôi và gây giống tại miền nam nước Mỹ Tại Nam Phi, cá sấu (Crocodylus niloticus) đã được nuôi từ năm 1992 với 40 trang trại được cấp phép Ngành công nghiệp cá sấu tại Nam Phi không chỉ đóng góp vào thu nhập qua nguồn thịt cá sấu mà còn thông qua du lịch, tạo ra lợi ích kinh tế đáng kể cho khu vực.
Thái Lan nổi tiếng toàn cầu về ngành nuôi cá sấu, bắt đầu từ năm 1960 khi trại cá sấu đầu tiên chỉ xuất ra 150 con cá sấu nhỏ Hiện nay, số lượng cá sấu tại đây đã tăng lên hơn 40.000 con với đa dạng kích cỡ.
1.1.3.2 Tình hình nuôi cá sấu tại ViệtNam
Đến năm 2004, tại Tp.HCM, tổng đàn cá sấu của 4 doanh nghiệp xuất khẩu đạt khoảng 31.732 con, cùng với 23-25 trại nuôi cá sấu quy mô hộ gia đình với tổng đàn 4.796 con Mặc dù ngành nuôi cá sấu không phổ biến, nhưng do cá sấu dễ nuôi, dễ sinh sản và thích nghi tốt với khí hậu Việt Nam, ngành này đang phát triển nhanh chóng và mang lại lợi nhuận đáng kể, lên tới 10 tỷ đồng trong giai đoạn 2001-2004.
TạiTp.HCM,chươngtrìnhpháttriểnđàncásấugiaiđoạn2001-2010,phấnđấu đếnnăm2010đàncásấugâynuôiđạttiêuchuẩnxuấtkhẩutrongcáctrangtrạiđạt khoảng80.000–100.000con.Đếnnăm2011,tổngđàncásấuởTp.HCMđạt175.115con,trong khi đến tháng 10/2008 tổng đàn cá sấu là 168.922con.
Tính đến ngày 31/7/2015, thành phố Hồ Chí Minh có khoảng 176.086 con cá sấu nước ngọt được nuôi, nhưng hàng năm chỉ xuất khẩu hơn 20.000 con Tuy nhiên, sau hai năm giá cá sấu giảm mạnh, tổng đàn cá sấu vào năm 2020 chỉ còn 90.000 con (Theo UBND Tp.HCM, 2021).
Vào tháng 01/2019, giá cá sấu được thương lái thu mua dao động từ 165.000-185.000 đồng/kg, gấp gần 3 lần so với các năm trước, mang lại lợi nhuận cho người nuôi từ 70.000 đến gần 90.000 đồng/kg Tuy nhiên, từ khi dịch Covid-19 bùng phát, các quốc gia nhập khẩu cá sấu như Trung Quốc, Thái Lan và Nga chưa mở cửa trở lại, dẫn đến tình trạng bế tắc trong tiêu thụ cá sấu thương phẩm và giá cả khó có khả năng hồi phục Hiện tại, giá một con cá sấu thương phẩm từ ba đến năm kg chỉ còn khoảng 300.000 đến 400.000 đồng/con, trong khi loại 10 đến 15 kg có giá khoảng 700.000 đến 800.000 đồng/con, giảm một nửa so với trước đây (Theo UBND Tp.HCM, 2021).
Sản phẩm từcásấu
Dacásấu
Da cá sấu là nguyên liệu quý giá trong ngành công nghiệp thuộc da, được săn bắt và nuôi dưỡng vì giá trị kinh tế cao Da cá sấu mỏng hơn so với nhiều loại da khác, bao gồm hai phần chính: da và lớp vẩy Sau khi được xử lý bằng hóa chất, da cá sấu sẽ nổi vân óng ánh, trở thành nguyên liệu sản xuất các sản phẩm cao cấp như thắt lưng, ví xách tay, giày dép và áo khoác Những sản phẩm từ da cá sấu không chỉ đẹp mà còn có giá trị rất cao.
Thịtcásấu
Cá sấu thường có lớp mỡ dày, đặc biệt ở đuôi và những con nuôi trong chuồng Thịt cá sấu chứa lượng đạm cao và tỷ lệ phần trăm mỡ cũng khác biệt Để so sánh, thịt lợn có thành phần trung bình như sau: đạm 13%, mỡ 20%, nước 57% (theo Hoffman và cộng sự, 2000).
Các sản phẩm phụ khác củacásấu
Hai tuyến xạ ở dưới hàm cá sấu được sử dụng trong công nghệ chế biến nước hoa, mang lại mùi hương đặc trưng và bền lâu Một số bộ phận của cá sấu sấy khô còn được dùng trong y học truyền thống phương Đông, tuy nhiên thị trường tiêu thụ vẫn còn hạn chế Mật cá sấu có công dụng chữa bệnh ở đường hô hấp và tiêu hóa Ngoài ra, dầu cá sấu được chiết xuất từ mỡ của nó, trong khi xương sọ và toàn bộ xương cá sấu được sử dụng để nấu cao, làm đồ thủ công mỹ nghệ, hoặc xay thành phân bón cho gia súc.
Thành phần dinh dưỡng chính trong thịtcásấu
Mặc dù việc tiêu thụ thịt cá sấu đang ngày càng phát triển, nhưng thông tin về giá trị dinh dưỡng của loại thịt này vẫn còn hạn chế Một trong những nghiên cứu hiếm hoi về giá trị dinh dưỡng của cá sấu được thực hiện bởi Hoffman và cộng sự vào năm 2000, tập trung vào thịt từ đuôi, cổ, thân và chân của cá sấu (Crocodylus niloticus).
Theo Bảng 1-1, ở độ tuổi 36 tháng, không có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng protein và chất béo giữa các bộ phận cơ thể được nghiên cứu.
Bảng 1-1.Thành phần hóa học từ các bộ phận thịt của cá sấu sông Nile (g.kg -1 ) Đuôi Chân Thân Cổ Trung bình Độ ẩm 701,7±18,96 733,9 ± 7,57 670,7 ± 22,38 759,5 ± 13,21 716,4 ± 36,77 Protein 210,9 ± 8,09 224,0 ± 9,59 218,8 ± 7,02 229,4 ± 7,26 220,8 ± 10,09 Béo 88,5± 27,15 40,4 ± 11,63 91,1± 16,96 29,4± 8,41 62,3 ±3 2 , 1 7 Tro 5,9 ± 1,55 3,6 ± 0,78 6,5 ± 2,00 4,5 ± 1,63 5,1 ± 1,85
(Hoffman và ctv, 2000)Bên cạnh đó, trong thịt cá sấu còn chứa các amino acid thiết yếu, kết quả được trình bày Bảng 1-2.
Bảng 1-2 Hàm lượng amino acid của thịt nạc cá sấu (g.kg -1 , trên vật chất khô)
Tổng quanvềxương
Cấu trúccủaxương
Xương chủ yếu được cấu tạo từ các sợi collagen và khoáng xương vô cơ ở dạng tinh thể nhỏ, với 10% đến 20% là nước Trọng lượng khô của xương chứa khoảng 60 - 70% chất khoáng, chủ yếu là hydroxyapatite (canxi photphat hydrat), với tỉ lệ Ca:P dao động từ 1,37 đến 1,87, khác với tỉ lệ 5:3 trong hydroxyapatite Điều này cho thấy thành phần khoáng chất trong xương phức tạp hơn và chứa các ion như silicon, carbonate và kẽm Collagen trong xương có tỷ lệ tương đối cao của serine và glycine, cùng với tỷ lệ thấp của hydroxyproline và proline Xương cá sấu nổi bật với màu trắng và độ cứng cao.
Hình 1.1.Xương cá sấu đã loại tủy, chất béo và thịt
Xương đóng vai trò quan trọng trong việc nâng đỡ cơ thể và thực hiện nhiều chức năng khác trong cơ thể động vật Với độ cứng cao, khả năng phục hồi, tăng trưởng và tự sửa chữa, xương được coi là một kiệt tác của tạo hóa Nó là loại mô có cấu trúc phức tạp, bao gồm các chất vô cơ và mạng lưới chất hữu cơ, tạo nên tính bền cơ học và khả năng chịu nén vững chắc cho xương.
Một số ứng dụng của xươngcásấu
Công ty TNHH Cá Sấu Hoa Cà hiện đang hoạt động tại Việt Nam, chuyên sản xuất cao xương cá sấu để làm thực phẩm bổ sung Sản phẩm của công ty đã được phân phối ra thị trường, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng.
‘Kim Cương Tươi Đẹp’ thuộc Công ty TNHH Cá Sấu Hoa Cà được thành lập từ năm
Từ năm 2010, cao xương cá sấu đã được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh tạo xương bất toàn (xương thủy tinh) ở trẻ em với kết quả đầy hứa hẹn Phân tích các chất biểu hiện quá trình tạo xương trong serum cho thấy việc tiêu thụ cao xương cá sấu có thể thúc đẩy sự tổng hợp collagen trong xương, từ đó cải thiện sức khỏe xương, giảm đau nhức và tần suất gãy xương ở bệnh nhân (Tôn Thất Hưng và ctv, 2013) Ngoài ra, Viện Y Dược Học Dân Tộc Tp HCM cũng ghi nhận sản phẩm này có hiệu quả tích cực với một số bệnh nhân về xương khớp, và thông tin này cần được phổ biến rộng rãi Nghiên cứu của Gungormus và Kaya (2002) cho thấy collagen loại I khi được đắp vào xương trong phẫu thuật có thể tăng tốc độ lành xương.
Công ty TNHH Cá Sấu Hoa Cà hiện đang áp dụng phương pháp nấu-cô truyền thống để trích cao, trong đó xương được nấu sôi ở 100C và dịch collagen được thu thập sau mỗi ngày nấu Quá trình này lặp lại 6 - 7 lần trong khoảng 7 ngày, với nồi nấu hai tầng giúp cô đặc dịch collagen Mặc dù phương pháp này cho ra sản phẩm có màu nâu đen, nhưng cũng có thể dẫn đến những thay đổi không kiểm soát về mùi và chất lượng Hiện tại, chưa có nghiên cứu khoa học nào được thực hiện để cải tiến quy trình này, mặc dù các loại cao xương từ động vật khác cũng được chế biến theo cách tương tự.
Hiện nay, phương pháp chiết xuất collagen từ xương động vật và các bộ phận như da, gân đang được áp dụng phổ biến Quá trình này thường sử dụng axit acetic và pepsin, thực hiện ở nhiệt độ phòng để đạt hiệu quả tối ưu.
Từ năm 2008 đến nay, nhiều nghiên cứu như của Mokrejs và cộng sự (2008), Zhang và cộng sự (2009), Chen và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng chưa có bằng chứng rõ ràng nào xác nhận các tính chất có lợi cho sức khỏe từ cao xương cá sấu là do collagen hay còn có các thành phần khác với hàm lượng thấp Do đó, các thí nghiệm hiện tại tập trung vào việc cải tiến phương pháp chế biến bằng nhiệt truyền thống, không giống như các phương pháp ở nơi khác Mục tiêu của các thí nghiệm này là giảm mức sử dụng năng lượng, hạn chế tác động đến chất lượng sản phẩm, đồng thời đảm bảo hoặc thậm chí nâng cao hiệu suất thu hồi từ xương.
Tính ứng dụng của cao collagen cần được xem xét kỹ lưỡng Các sản phẩm cao collagen hiện nay có độ ẩm khoảng 35%, khó hòa tan trong nước và tạo ra huyền phù có độ đục cao, điều này hạn chế khả năng ứng dụng trong thực phẩm Thủy phân collagen bằng enzyme có thể cải thiện khả năng hấp thu và làm tăng độ trong của dung dịch Collagen loại I trong xương có cấu trúc ba sợi xoắn, gây khó khăn cho việc tiêu hóa hiệu quả trong đường ruột Nghiên cứu cho thấy pepsin không thể phá vỡ hoàn toàn cấu trúc xoắn ba của collagen, và trypsin cũng không thủy phân hoàn toàn collagen loại I.
Tổng quanvềcollagen
Giớithiệucollagen
Collagen là protein chủ yếu trong các mô liên kết, chiếm từ 25% đến 35% tổng lượng protein trong cơ thể động vật và là thành phần chính của khung mạng ngoại bào Loại protein dạng sợi xoắn này có mặt trong các mô liên kết của tim, mạch máu, da, giác mạc, sụn, dây chằng và xương, cũng như trong các mô của hầu hết các cơ quan Collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ bền cho mô và cơ quan, đồng thời duy trì cấu trúc của chúng Sự đa dạng về thành phần và cấu trúc của collagen rất phong phú.
Phânloạicollagen
Collagen là một protein quan trọng có mặt ở nhiều bộ phận trong cơ thể, với 28 loại khác nhau đã được phát hiện và công nhận trong các nghiên cứu khoa học Hơn 90% collagen trong cơ thể tồn tại dưới dạng loại I, đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì sức khỏe và độ đàn hồi của da, xương, và các mô liên kết.
I, II, III và IV (Shoulders và ctv,2009).
Collagen I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương.
Collagen II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn).
Collagen III: có trong bắp cơ (thành phần chính của bắp cơ).
Collagen IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào.
Cấutrúccollagen
Collagen là một cấu trúc protein quan trọng trong cơ thể động vật, chiếm 25-30% tổng số protein ở động vật có vú Loại protein này không có mặt ở thực vật và sinh vật đơn bào Trong động vật không xương sống, collagen xuất hiện trong thành cơ thể và lớp biểu bì Nó hiện diện ở nhiều bộ phận của cơ thể như giác mạc, xương, mạch máu, sụn và ngà răng.
Collagen, hay còn gọi là Tropocollagen, là một loại protein có cấu trúc phức tạp, bao gồm các sợi dài khoảng 300nm và đường kính 1,5nm Nó được hình thành từ ba chuỗi polypeptit xoắn lại với nhau, tạo nên cấu trúc xoắn đặc trưng của collagen Các chuỗi polypeptit này liên kết với nhau thông qua các liên kết hydro, và quá trình tổng hợp chúng diễn ra tương tự như các protein khác (theo Pataridis và cộng sự, 2009).
Thành phần amino acid của collagen có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc, nhưng vẫn giữ những tính chất chung Collagen không chứa cystein và tryptophan, nhưng lại có tỷ lệ cao glycine (Gly) chiếm khoảng 30%, proline (Pro) khoảng 12%, và hydroxyproline (Hyp) từ 12,8% đến 14,7% Ngoài ra, collagen còn chứa hydroxylysine, một trong những protein đặc trưng.
(Hyl),ngoàiratrongthànhphầncollagencònchứakhoángchiếmtỉlệ1%.Hyplàmột amino acid đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có và tùy theo nguồngốccollagenmàlượngHypkhácnhau(LêTrungThiên,2016).
Gần đây, đã xác định được 28 loại collagen với 46 chuỗi polypeptide riêng biệt, tất cả đều có cấu trúc xoắn ba đặc trưng Tuy nhiên, độ dài, kích thước và tính chất của các phần còn lại khác nhau giữa các loại collagen Theo nghiên cứu của Wood và cộng sự (2008), trong xương chủ yếu có hai loại collagen: loại I [α1(I)]2α2(I) và một ít loại V: α1(V), α2(V), α3(V).
Các loại collagen I, II, III, IV chiếm hơn 90% tổng lượng collagen trong cơ thể Collagen loại I hiện diện trong da, gân, mạch máu, cơ quan và xương; collagen loại II là thành phần chủ yếu của sụn; collagen loại III có mặt trong cơ; và collagen loại IV là thành phần chính cấu tạo nên màng tế bào (Silvipriya và ctv, 2015).
Hình 1.2Cấu trúc của collagen
Collagen loại I là thành phần chính trong cấu trúc mô cơ, với khối lượng phân tử khoảng 150.000 ĐVC Có 42 chuỗi polypeptit được xác định, mã hóa bởi 41 loại gen, tạo nên 28 loại collagen khác nhau Cấu trúc chuỗi polypeptit xoắn lại theo kiểu xoắn ốc, tạo thành bộ tropocollagen có chiều dài trung bình 300 nm và đường kính 1,4 nm nhờ vào các liên kết hydro Mỗi chuỗi polypeptide chứa khoảng 1.050 amino acid, với sự lặp lại của ba amino acid Gly - X - Y (X thường là Pro, Y là Hyp) Sự liên kết giữa các chuỗi tropocollagen tạo thành sợi collagen, được sắp xếp song song theo chiều dọc và liên kết với nhau bằng các liên kết ngang Các sợi này có đường kính từ 10 - 500 nm tùy thuộc vào giai đoạn phát triển, và chúng tạo thành bó sợi collagen, đặc biệt quan trọng trong cấu trúc xương, cung cấp độ bền kéo và độ cứng.
Nghiên cứu của Wood và cộng sự (2008) đã tiến hành trích ly collagen từ xương của cá sấu Alligator mississippiensis, cho thấy collagen thu được thuộc loại I với khối lượng phân tử là 359 kDa và 356 kDa, tương ứng với hai phương pháp trích bằng acid và pepsin Khi phân tích riêng từng chuỗi, khối lượng phân tử của chuỗi α1 là 124 kDa, chuỗi α2 là 111 kDa, và chuỗi β khoảng 200 kDa Collagen này có thành phần amino acid phong phú với 18 loại, trong đó nổi bật là glycine, proline, alanine và hydroxyproline.
Bảng 1-3.Hàm lượng amino acid tự do trong dịch trích từ xương cá sấu trích bằng phương pháp acid acetic và enzyme pepsin
Amino acid PP acid acetic PP Enzyme pepsin
(Nguồn: Wood và ctv, 2008) Theo tác giả Omokanwaye và ctv (2010) đã nghiên cứu các nguyên tố cơ bản của collagen: C, H, N trong xương gà và từ gân bò ở Bảng 1-4.
Bảng 1-4.Thành phần của collagen từ gân bò và xương gà
Một số tính chấtcủacollagen
Theo nghiên cứu của Slizyte và cộng sự (2009), hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào hàm lượng cao các amino acid kị nước, cấu trúc sắp xếp của các amino acid trong chuỗi peptid, và khối lượng của các peptid.
1.5.4.2 Khả năng trương nở và hòatan
Khả năng hòa tan của collagen bị ảnh hưởng bởi pH và nồng độ muối trong dung dịch Collagen từ da có độ hòa tan cao nhất ở pH = 2, trong khi collagen từ xương hòa tan tốt nhất ở pH = 5 Khi nồng độ muối vượt quá 3%, độ hòa tan của collagen giảm mạnh từ 90% xuống dưới 40% do sự gia tăng tương tác kị nước, làm giảm liên kết giữa collagen và nước Collagen không hòa tan trong nước mà hấp thụ nước để nở ra, nhờ vào sự hiện diện của các vùng kị nước và vùng phân cực trong cấu trúc polypeptid của nó.
1.5.4.3 Tác dụng với kiềm vàacid
Collagen có khả năng tương tác với acid và kiềm nhờ vào cấu trúc chứa nhóm carboxy và amin, quyết định tính chất của nó Trong môi trường acid, ion collagen tương tác với gốc amin, dẫn đến việc điện tích trên carboxyl bị ức chế và hình thành acid yếu với độ ion hóa thấp Ngược lại, gốc amin sẽ bị ion hóa tạo thành NH3+.
Dưới tác động của các chất hóa học như axit, muối, bazơ và các yếu tố vật lý như nhiệt độ cao, tia cực tím, cũng như tác động cơ học, các cấu trúc bậc II và III của protein bị biến đổi Sự biến đổi này dẫn đến việc phá vỡ các liên kết hydro, ion và cầu nối di-sulfua, trong khi đó, liên kết peptid bậc I vẫn được giữ nguyên, đảm bảo rằng cấu trúc bậc I của protein không bị ảnh hưởng (Lê Ngọc Tú và ctv, 2002).
1.5.4.5 Điểm đẳng điện(pI) Điểm đẳng điện (isoelectric point - pI) của protein là một thông số rất quan trọng, liên quan đến tỉ lệ các gốc acid nhóm chức amin hay carboxy Bình thường collagen có pI khoảng 8,4 cao hơn gelatin (khoảng 4,9) và collagen thủy phân có pI khoảng 4,6 (Zhang và ctv, 2005).
Các phương pháp tríchlycollagen
Hiện nay, có ba phương pháp chính để trích ly collagen: vật lý, sinh học và hóa học Trong đó, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào hai phương pháp hóa học và sinh học.
1.5.5.1 Trích ly collagen bằng phương pháp sinhhọc
Quá trình thu nhận collagen từ xương diễn ra thông qua cơ chế thủy phân bằng enzyme, sau đó collagen được kết tủa và tinh sạch Để đạt hiệu suất cao hơn, quá trình trích ly collagen được thực hiện ở nhiệt độ lạnh và có khuấy đảo Theo nghiên cứu của Li và cộng sự (2009), enzyme pepsin được sử dụng để trích ly collagen từ gân bò, trong khi Wood và cộng sự (2008) áp dụng enzyme pepsin để trích ly collagen từ xương cá sấu (Alligator mississippiensis).
1.5.5.2 Trích ly collagen bằng phương pháp hóa học
Collagen có thể được chiết xuất bằng cách hòa tan trong acid acetic, sau đó kết tủa và tinh sạch Mặc dù acid acetic thường được sử dụng để tách chiết collagen, nhưng nhiều loại acid khác cũng có thể áp dụng tùy thuộc vào nguyên liệu Theo nghiên cứu của Nagai (2000), collagen đã được trích ly từ da, xương và vây cá bằng 0,5M acid acetic trong 3 ngày Trần Thị Huyền và cộng sự (2012) cũng đã sử dụng phương pháp hóa học để tách chiết collagen từ da cá ba sa, với quy trình thực hiện trong 34 giờ bằng 0,5M acid acetic, tỷ lệ w/v = 1/10 Ngoài ra, acid citric 0,5M cũng được áp dụng để chiết xuất collagen từ da cá Tuyết Baltic (theo Sadowska, 2003).
1.5.5.3 Trích ly kết hợp giữa sinh học và hóahọc
Ogawa (2004) đã sử dụng acid acetic kết hợp với enzyme pepsin để trích ly collagen từ xương và vảy cá Tráp ở vịnh Mexico Tương tự, Kiew (2013) cũng tiến hành trích ly collagen từ da cá da trơn bằng cách sử dụng dung dịch 0,5 M acid acetic chứa pepsin (v/w) với tỷ lệ enzyme/cơ chất là 1:40 trong 20 giờ.
1.5.5.4 Trích ly collagen bằng phương pháp vậtlý
Phương pháp trích ly collagen từ xương chủ yếu dựa vào nhiệt độ, giúp thúc đẩy quá trình trao đổi chất giữa nước và collagen Mặc dù không có tài liệu khoa học nào đề cập đến việc sử dụng nhiệt độ cao để trích ly collagen từ xương, nhưng tại Việt Nam, nhiều người vẫn áp dụng phương pháp này, thường được gọi là nấu cao ngựa, cao mèo, cao trăn.
Ứng dụng kỹ thuật mới trong tríchlycollagen
Sóng siêu âm hoạt động dựa trên nguyên lý tạo và vỡ bọt trong môi trường chất lỏng Trong nửa chu kỳ đầu, bọt được hình thành, và trong nửa chu kỳ sau, bọt vỡ ra, giải phóng một lượng năng lượng lớn (Li và ctv, 2004).
Sóng siêu âm, được tạo ra từ các dao động cơ học với tần số trên 15kHz, khi truyền trong môi trường lỏng, làm cho các phần tử trong trường siêu âm trải qua chu trình nén và duỗi Khi năng lượng đạt đến mức đủ lớn, sự tương tác giữa các phân tử sẽ vượt qua lực hấp dẫn nội tại, dẫn đến sự hình thành các lỗ hổng nhỏ trong chất lỏng, hiện tượng này được gọi là sủi bóng Các bóng sủi này sẽ dần lớn lên nhờ quá trình khuếch tán một lượng nhỏ khí hoặc hơi từ pha lỏng trong suốt quá trình giãn nở, và không được hấp thụ hoàn toàn trong chu trình nén.
Khi đạt đến thể tích tối đa mà các phần tử không thể hấp thu thêm năng lượng, chúng sẽ vỡ ra một cách đột ngột, dẫn đến sự gia tăng nhiệt độ và áp suất lên tới khoảng 5000°K và 2000atm Thể tích chất lỏng bị gia nhiệt rất nhỏ, khiến nhiệt độ cao chỉ tồn tại trong vài mili giây Sự bùng nổ này tạo ra các gốc tự do như H* và OH*, góp phần vào quá trình trích ly hiệu quả Ứng dụng sóng siêu âm trong trích ly đã chứng minh là một phương pháp hiệu quả để tối ưu hóa quy trình này.
Sóng siêu âm là công cụ hiệu quả trong việc trích xuất các hợp chất tự nhiên từ thực vật và động vật Nghiên cứu của Li và cộng sự (2009) cho thấy việc sử dụng sóng siêu âm ở tần số 40kHz, công suất 120W trong 30 phút đã tăng hàm lượng collagen từ gân bò lên khoảng 124% so với phương pháp trích ly thông thường Tuy nhiên, hiện tại chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc sử dụng sóng siêu âm để trích ly collagen từ xương cá sấu bằng phương pháp nhiệt.
Vi sóng, hay còn gọi là sóng cực ngắn hoặc sóng siêu tần, có tần số từ 0,3 GHz đến 300 GHz, được phân loại là sóng UHF (Ultra High Frequency) Trong các lĩnh vực công nghiệp, khoa học và y học, các tần số vi sóng phổ biến được sử dụng là 915; 2450; 5800; và 24124 MHz, trong đó tần số 2450 MHz được áp dụng rộng rãi nhất trong công nghệ chế biến nông sản và thực phẩm Nguyên lý hoạt động của vi sóng dựa trên khả năng tương tác với các phân tử trong thực phẩm, tạo ra nhiệt từ bên trong, giúp làm nóng và nấu chín nhanh chóng.
Vi sóng được tạo ra từ bộ dao động điện từ và khuếch đại nhờ magnetron, hoạt động như một đèn điện tử 3 cực Năng lượng từ magnetron được truyền qua ống dẫn sóng đến quạt phát tán, giúp sóng lan tỏa đều Sóng được phản chiếu lên thành lò, tạo ra sự phân tán đồng đều Dưới tác dụng của điện từ trường, các nguyên tử hydro và oxy thay đổi cực 2,45 tỉ lần mỗi giây, gây ra sự cọ sát giữa các phân tử nước và tạo ra nhiệt Ứng dụng vi sóng không chỉ trong nấu ăn mà còn trong quá trình trích ly.
Giống như sóng siêu âm, vi sóng được sử dụng rộng rãi trong việc tách chiết hợp chất tự nhiên từ thực vật và sản phẩm động vật Nghiên cứu của Xing-wu và cộng sự (2012) cho thấy vi sóng có thể tăng cường hiệu quả trích ly collagen từ da heo, với hàm lượng collagen tăng lên đến 76,71% Tuy nhiên, tác giả không tìm thấy tài liệu nào đề cập đến việc sử dụng vi sóng trong việc trích ly collagen từ xương cá sấu.
Các phương pháp xác định hàmlượngcollagen
Collagen không thể được định tính và định lượng trực tiếp, mà thông qua amino acid đặc trưng là hydroxyproline Hydroxyproline chỉ có trong collagen và một lượng rất nhỏ trong elastin, do đó nó được xem là amino acid đặc trưng của collagen Nồng độ collagen được xác định bằng hàm lượng hydroxyproline nhân với hệ số chuyển đổi 14,7.
Ccollagen= Chydroxyprolinex 14,7 Trong đó: Ccollagen: Nồng độ collagen (mg/g)
Hydroxyproline là một amino acid quan trọng, và nồng độ của nó được đo bằng đơn vị mg/g Các phương pháp phân tích hydroxyproline hiện nay bao gồm đo mật độ quang OD, điện di và sắc ký, như đã được đề cập bởi Hồ Viết Quý (2006).
Phương pháp đo mật độ quang (OD) là một kỹ thuật nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm chi phí Tuy nhiên, độ chính xác của phương pháp này không cao và không thể áp dụng để đo nồng độ vết.
Phương pháp điện di là một kỹ thuật hiệu quả trong việc phân tích toàn bộ amino acid có trong mẫu, cho phép phát hiện cả những amino acid ở dạng vết, từ đó đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp một số nhược điểm như tốn nhiều thời gian và chi phí, yêu cầu thực hiện nhiều lần, đồng thời độ chính xác và độ nhạy vẫn chưa đạt mức cao.
Phương pháp sắc ký mang lại nhiều ưu điểm vượt trội, bao gồm khả năng phân tích với lượng mẫu rất nhỏ, tính tự động hóa cao, và độ chính xác cũng như chọn lọc tốt Phương pháp này cho phép phân tích đồng thời nhiều amino acid và có thể áp dụng cho các mẫu phức tạp.
Việc chọn phương pháp phân tích phù hợp phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể và điều kiện thiết bị Phương pháp sắc ký được ưa chuộng nhờ độ chính xác cao, đặc biệt là trong việc phân tích các mẫu phức tạp như nền mẫu cao xương (Hồ Viết Quý, 2006).
Ứng dụngcủacollagen
Collagen, với cấu trúc và tính chất hóa học đặc biệt, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như da liễu, sản xuất phim, mỹ phẩm, y học, dược phẩm, sinh học vật liệu và thực phẩm (Bae và ctv, 2008).
Collagen đóng vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa và cải thiện nếp nhăn, khi mà khoảng 70% cấu trúc da được hình thành từ collagen, chủ yếu nằm ở lớp hạ bì Collagen tạo ra hệ thống nâng đỡ, giúp duy trì sức căng, độ đàn hồi và độ ẩm của da, từ đó mang lại làn da mịn màng và trẻ trung Bên cạnh đó, collagen cũng được sử dụng trong một số sản phẩm chăm sóc tóc để phục hồi và cải thiện tình trạng tóc.
1.5.8.2 Ứng dụng trong dược phẩm và yhọc
Collagen là một vật liệu sinh học có khả năng phân hủy tự nhiên, với đặc tính tạo màng và gel, giúp hấp thụ tốt trong cơ thể con người Nó có mùi và vị trung hòa, không gây dị ứng, và tương thích sinh học cao, đồng thời có khả năng cầm máu Những đặc tính này cho phép collagen được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược và công nghệ dược phẩm (Aoe và ctv, 2004).
1.5.8.3 Ứng dụng trong công nghiệp thựcphẩm
Là tạo nên sự bền bọt, tham gia tạo cấu trúc, độ dai của sản phẩm…
1.5.8.4 Trong công nghệ sản xuấtkẹo
Trong sản xuất kẹo, hai chỉ số quan trọng của collagen hydrolysate là chỉ số Bloom và độ nhớt, với yêu cầu khác nhau tùy vào từng loại sản phẩm Chỉ số Bloom cao cho thấy độ bền gel của collagen hydrolysate lớn hơn ở cùng nồng độ, làm cho nó phù hợp cho các ứng dụng định hình sản phẩm Độ nhớt của collagen cũng ảnh hưởng đến quá trình cố định trong sản phẩm; cụ thể, khi sử dụng phương pháp tạo hình bằng khuôn tinh bột, độ nhớt cần thấp để dễ dàng chảy vào khuôn, trong khi phương pháp ép đùn yêu cầu độ nhớt cao để đảm bảo định hình sản phẩm.
1.5.8.5 Trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từsữa
Collagen hydrolysate được sử dụng như một phụ gia tạo cấu trúc trong công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa.
1.5.8.6 Trong công nghiệp sản xuất đồuống
Tác giả Cioca (1984) đã nghiên cứu việc bổ sung collagen vào thức uống có cồn Hiện nay, collagen hydrolysate được ứng dụng rộng rãi trong quá trình làm sạch rượu vang, bia và nước trái cây, giúp giảm độ đục và nâng cao giá trị cảm quan mà không làm ảnh hưởng đến hương vị sản phẩm Công ty cá sấu Hoa Cà hiện đã sản xuất rượu bổ sung collagen, minh chứng cho xu hướng này.
Tổng quan vềthủyphân
Các phương pháp thủyphânprotein
Acid clohydric (HCl) thường được sử dụng trong quá trình thủy phân, với acid sulfuric cũng là một lựa chọn Độ mạnh của acid ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân; HCl có hoạt độ cao, do đó được áp dụng phổ biến Phương pháp này sử dụng HCl 6N ở nhiệt độ 100 - 120 độ C trong 24 giờ Tuy nhiên, việc sử dụng acid nồng độ cao và nhiệt độ cao có thể dẫn đến sự phá hủy một số amino acid, trong đó tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, còn serine và threonine bị tổn hại một phần Glutamine và asparagine phân ly thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+, đồng thời hầu hết các vitamin cũng bị tiêu hủy (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Amino acid có thể được thu nhận qua quá trình thuỷ phân bằng NaOH, nhưng phương pháp này thường gây racemic hóa, làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Quá trình này tạo ra lysineolanine, dẫn đến giảm hàm lượng lysine, và cũng phá huỷ các amino acid như cysteine, serine và treonine Do những hạn chế này, phương pháp thuỷ phân bằng NaOH ít được áp dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
1.6.1.3 Thủy phân bằngenzyme Để thu nhận chế phẩm amino acid việc thủy phân bằng enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau đặc biệt phù hợp hơn cho các ứng dụng trọng thực phẩm và dược phẩm do sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này chính là kiểm soát được mức độ thủy phân,điều kiện tiến hành ôn hòa, sản phẩm thu được có hàm lượng protein cao mà không phá hủy đi thành phần các amino acid (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằngenzymeprotease
Enzyme, do được cấu tạo từ protein, có tốc độ phản ứng tăng lên khi nhiệt độ tăng trong một khoảng nhất định mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của chúng Mỗi enzyme có nhiệt độ tối ưu riêng, phụ thuộc vào nguồn gốc, điều kiện và độ nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein Nhiệt độ thích hợp cho nhiều enzyme thường dao động từ 40 đến 50 độ C, trong khi enzyme có nguồn gốc thực vật và vi sinh vật thường có nhiệt độ hoạt động tối ưu cao hơn (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme không cố định mà thay đổi tùy thuộc vào cơ chất và thời gian thủy phân.
Hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH môi trường, vì pH quyết định trạng thái ion hóa của các gốc R trong amino acid của enzyme và cơ chất Để enzyme hoạt động hiệu quả, pH cần phải phù hợp, giúp enzyme và cơ chất dễ dàng kết hợp Mỗi enzyme có một pH tối ưu riêng, tại đó enzyme hoạt động mạnh nhất, nhưng pH này không cố định và có thể thay đổi tùy thuộc vào tính chất, nồng độ của cơ chất và nhiệt độ (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
1.6.2.3 Ảnh hưởng nồng độ enzyme và nồng độ cơchất
Nồng độ enzyme ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme.
Khi nồng độ cơ chất thấp, mức độ tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất sẽ giảm, dẫn đến sự giảm tốc độ phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng sẽ đạt tối đa khi tất cả enzyme đều liên kết với cơ chất.
1.6.2.4 Ảnh hưởng của thời gian thủyphân
Thời gian thủy phân ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình này; thời gian càng dài, protease càng có điều kiện thủy phân cơ chất triệt để Tuy nhiên, nếu quá trình kéo dài quá lâu, vi sinh vật sẽ sinh ra nhiều sản phẩm thứ cấp như NH3, H2S, CO2, indol, gây ảnh hưởng tiêu cực Ngược lại, nếu thời gian thủy phân quá ngắn, protein sẽ không được thủy phân hoàn toàn, dẫn đến hiệu suất kém và lãng phí nguyên liệu Trong giai đoạn đầu, tốc độ thủy phân diễn ra mạnh mẽ, nhưng sau đó giảm dần do nồng độ cơ chất giảm, nồng độ sản phẩm tăng và độ bền của enzyme suy giảm theo thời gian (Trần Minh Tâm, 1998).
1.6.2.5 Ảnh hưởng của diện tích tiếpxúc
Diện tích tiếp xúc đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân, giúp tăng cường sự tương tác giữa enzyme và cơ chất Để tối ưu hóa quá trình này, cần làm nhỏ kích thước của cơ chất trước khi thực hiện thủy phân (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990).
Quá trình thủy phân không chỉ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố đã đề cập, mà còn chịu tác động từ chất hoạt hóa và kìm hãm, anion kim loại, cũng như bản chất của enzyme.
Quá trình thủy phân bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, do đó cần tối ưu hóa các yếu tố này dựa trên loại nguyên liệu thủy phân để đạt hiệu quả cao nhất.
Ứng dụng proteinthủyphân
Sản phẩm từ quá trình thủy phân protein là dịch đạm thủy phân, chứa nhiều peptide có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu là di và tri-peptide, với lượng amino acid tự do rất ít Những sản phẩm này được coi là có giá trị dinh dưỡng cao (Bhaskar và ctv, 2007).
Enzyme protease có khả năng phân hủy protein cơ thịt thành các phần hòa tan và không hòa tan Phần không hòa tan chứa chất béo và các chất không mong muốn, có thể được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi, trong khi phần hòa tan chứa protein thủy phân và hàm lượng chất béo thấp Protein thủy phân có thể được sử dụng để tăng cường hương vị thực phẩm, bổ sung vào thực phẩm chức năng, hoặc làm phụ gia dinh dưỡng cho thực phẩm có chất lượng protein thấp (Kurozawa và ctv, 2008) Thủy phân protein cá (FPHs) đã được thử nghiệm thành công trong nhiều loại thực phẩm khác nhau, bao gồm sản phẩm ngũ cốc, cá, sản phẩm thịt, món tráng miệng và bánh quy giòn (Kristinsson và Rasco, 2000).
Thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng động vật, đặc biệt là trong việc tăng cường sức đề kháng miễn dịch FPHs đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá Nghiên cứu cho thấy các peptide trong thủy phân protein có ảnh hưởng tích cực đến hiệu suất tăng trưởng và tính miễn dịch của ấu trùng cá chẽm Một nghiên cứu khác cho thấy việc bổ sung thủy phân từ đầu cá ngừ đã cải thiện đáng kể sự sống còn và phát triển của tôm Penaeus vannamei, chứng tỏ tiềm năng của sản phẩm thủy phân trong ngành nuôi trồng thủy sản.
FPHs có thể đóng vai trò là nguồn nitơ thiết yếu cho sự phát triển của vi sinh vật Theo nghiên cứu của Ghorbel và cộng sự (2005), việc sử dụng sản phẩm thủy phân protein tách béo từ cá trích (Sardinella aurita) làm nguồn nitơ cho sản xuất lipase ngoại bào bởi nấm sợi Rhizopus oryzae đã cho thấy hiệu quả cao hơn so với việc không bổ sung protein thủy phân.
Thủy phân protein không chỉ được ứng dụng trong sản xuất vắc xin mà còn được sử dụng để điều hòa sinh trưởng thực vật, nhằm tăng năng suất cây trồng thương mại và kiểm soát cỏ dại trong các nhà máy (Pasupuleti và ctv, 2010).
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra những lợi ích vượt trội của protein thủy phân từ động vật, đặc biệt là từ thịt heo, gà và cá Các nghiên cứu này đã được thực hiện bởi nhiều tác giả như Soares và ctv (2000), Vercruysse và ctv (2005), và nhiều người khác Đặc biệt, thịt cá sấu nổi bật với hàm lượng protein cao và ít chất béo hơn so với thịt bò, heo và gà, theo nghiên cứu của Hoffman và ctv (2000) cùng Beilken và ctv (2007) Vì vậy, thịt cá sấu trở thành nguyên liệu lý tưởng cho quá trình thủy phân nhằm thu nhận dịch protein thủy phân chất lượng cao.
Thủy phân protein có thể thực hiện tương tự như các loại protein từ thịt khác Việc nghiên cứu để xác định enzyme và điều kiện phản ứng thích hợp là rất quan trọng.
Sau khi thủy phân, dịch lỏng có thể được sấy phun thành bột, mang lại lợi ích trong việc bảo quản lâu dài Sản phẩm bột dễ dàng bổ sung vào các loại thực phẩm khác và phù hợp để phối chế với các nguyên liệu khác Như vậy, sấy phun dịch lỏng thành bột sẽ tăng cường khả năng ứng dụng của sản phẩm thủy phân.
Tổng quan vềenzymeprotease
Giới thiệu chung vềenzymeprotease
Enzyme protease là chất xúc tác quan trọng trong quá trình thủy phân liên kết peptit (-CO-NH)n trong protein và polypeptit, dẫn đến sản phẩm cuối cùng là amino acid Bên cạnh đó, nhiều protease còn có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển amino acid, góp phần vào nhiều quá trình sinh học thiết yếu.
Protease là enzyme thiết yếu cho sự sống, đóng vai trò đa dạng từ cấp độ tế bào đến cơ thể, và phân bố rộng rãi trong nhiều sinh vật như vi sinh vật, thực vật và động vật Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt so với protease ở động vật và thực vật, với một hệ thống phức tạp gồm nhiều enzyme tương tự về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử, điều này khiến việc tách chúng ra dưới dạng tinh thể đồng nhất trở nên khó khăn.
Protease vi sinh vật có tính đặc hiệu rộng rãi nhờ vào sự phức tạp của các enzyme khác nhau trong thành phần của nó, cho phép sản phẩm thuỷ phân đạt được sự triệt để và đa dạng.
Phân loạiprotease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào động học cơ chế xúc tác, endopeptidase được phân loại thành bốn nhóm, trong đó nhóm serin proteinase là nhóm quan trọng nhất với nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động Nhóm này được chia thành hai tiểu nhóm: chymotrypsin và subtilisin Chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, và elastase, trong khi subtilisin gồm các enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động hiệu quả ở pH kiềm và có tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Cysteine proteinase là loại proteinase có nhóm –SH trong trung tâm hoạt động, bao gồm các proteinase thực vật như papain và bromelin, cùng với một số protein động vật và proteinase ký sinh trùng Chúng thường hoạt động hiệu quả ở pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Aspartic proteinase chủ yếu thuộc nhóm pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin và renin Những enzyme này có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động hiệu quả ở pH trung tính.
Metallo proteinase là một nhóm enzyme proteinase có mặt trong vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao hơn Chúng thường hoạt động hiệu quả ở pH trung tính, nhưng hoạt động của chúng giảm mạnh khi tiếp xúc với EDTA.
Ngoài ra, dựa vào pH hoạt động protease được phân loại thành ba nhóm:Protease acid: pH 2-4; Protease trung tính: pH 7-8; Protease kiềm: pH 9-11 (NguyễnTrọng Cẩn và ctv, 1998).
Cơ chế xúc tác củaenzymeprotease
Mặc dù các protease vi sinh vật có hoạt động khác nhau, chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo một cơ chế chung.
ES: Phức chất enzyme – cơ chất
ES’: Phức chất trung gian enzyme – cơ chất acyl hóa (Acyl enzyme)
P1: Sản phẩm đầu tiên chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới tạo thành)
` P2: Sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng (nhóm carboxyl tự do mới tạothành) (Theo Nguyễn Văn Mùi, 2012). xt xt Protein xt Polypeptide
Phương pháp thủy phân bằngenzymeprotease
Hình 1.5: Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân protein
Thủy phân protein là quá trình phân cắt các mạch protein tại các liên kết peptide, tạo ra các sản phẩm trung gian như polypeptide và peptide, cuối cùng chuyển hóa thành các amino acid.
Hiện nay, thủy phân protein có thể thực hiện bằng NaOH hoặc enzyme protease Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp thực phẩm, enzyme protease thường được ưa chuộng hơn do mang lại hiệu suất thủy phân cao và chất lượng dịch thủy phân tốt hơn Phương pháp thủy phân bằng kiềm không được sử dụng phổ biến vì gây ra hiện tượng racemic hóa, làm giảm giá trị dinh dưỡng của các amino acid.
Tình hình nghiên cứu thủy phân proteindùngenzyme
Trênthếgiới
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về thủy phân protein từ động vật đã gia tăng đáng kể do những lợi ích nổi bật mà protein thủy phân mang lại Các nghiên cứu này bao gồm thủy phân protein từ thịt heo, gà, cá, vẹm, mực, cũng như các phụ phẩm trong ngành chế biến thủy sản.
Nghiên cứu của Theo Zhuang và cộng sự (2009) đã tối ưu hóa hoạt tính chống oxy hóa của collagen sứa (Rhopilema esculentum) thông qua phương pháp bề mặt đáp ứng Collagen sứa được thủy phân bằng enzyme Trypsin với các điều kiện tối ưu là pH 7,75, nhiệt độ 48,77°C và tỷ lệ enzyme trên cơ chất 3,50% Phân tích phương sai cho thấy pH và tỷ lệ enzyme là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đáng kể đến quá trình thủy phân (p < 0,05 và p < 0,01) Collagen sứa sau khi thủy phân được tách chiết bằng HPLC và có thành phần với trọng lượng phân tử lớn hơn 3000 Da.
HF-2 có kích thước phân tử nhỏ hơn 3000 Da và HF-3 nhỏ hơn 1000 Da, cho thấy HF-2 có khả năng bắt giữ gốc hydroxyl cao nhất và đạt năng suất cao nhất so với HF-3.
Nghiên cứu của Theo Fang và cộng sự (2012) tập trung vào tối ưu hóa quá trình thủy phân chống oxy hóa từ protein cơ mực (Ommastrephes bartrami) bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Protein này được thủy phân bằng năm loại enzyme protease: pepsin, trypsin, papain, alcalase và flavourzyme Kết quả cho thấy thủy phân từ papain có hoạt động chống oxy hóa cao nhất, được đánh giá qua khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH Phương pháp bề mặt đáp ứng đã xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân, bao gồm tỷ lệ enzyme/cơ chất 1,74%, nhiệt độ 51 oC và thời gian 46 phút, với hoạt động bắt giữ gốc tự do DPPH đạt 74,25%.
Nghiên cứu của Kurozawa và cộng sự (2008) đã tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ thịt gà bằng enzyme alcalase 2,4L, xác định ảnh hưởng của nhiệt độ (43 - 77 o C), tỷ lệ enzyme/cơ chất (0,8 - 4,2%) và độ pH (7,16 - 8,84) đến mức độ thủy phân và tỷ lệ thu hồi protein Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là nhiệt độ 52,5 o C, tỷ lệ enzyme/cơ chất 4,2% và pH 8, dẫn đến mức độ thủy phân đạt 31% và tỷ lệ thu hồi protein 91% Phân tích điện di SDS-PAGE với gel tách 12% và gel gom 4% cho thấy một số liên kết protein trong thịt đã bị cắt đứt sau quá trình thủy phân, đồng thời hàm lượng acid glutamic, acid aspartic, lysine và leucine tăng cao.
Nghiên cứu của Theo Silva và cộng sự (2009) về tối ưu hóa thủy phân protein thịt vẹm bằng enzyme Protamex đã chỉ ra rằng các yếu tố như nhiệt độ (46 – 64 o C), tỷ lệ enzyme/cơ chất (0,48 - 5,52%) và pH (6,7 - 8,3) ảnh hưởng đến mức độ thủy phân Kết quả từ phương pháp bề mặt đáp ứng cho thấy điều kiện tối ưu cho enzyme thủy phân là pH 6,85, nhiệt độ 51 o C và tỷ lệ enzyme/cơ chất 4,5% Dưới các điều kiện này, mức độ thủy phân đạt 26,5% và tỷ lệ thu hồi protein đạt 65%.
Theo nghiên cứu của Zhuang và cộng sự (2012), collagen từ sứa (Rhopilema esculentum) đã được thủy phân bằng enzyme alcalase để tạo ra peptide ức chế enzyme chuyển angiotensin I (ACE) Các điều kiện thủy phân tối ưu được xác định thông qua phương pháp bề mặt đáp ứng, với nhiệt độ 52,7°C, pH 8,63 và tỉ lệ enzyme/cơ chất là 3,46% Kết quả cho thấy hoạt động ức chế ACE của thủy phân đạt đến 81,7%.
Theo nghiên cứu của Bhaskar và cộng sự (2007), protein từ nội tạng cừu như dạ dày, ruột lớn và nhỏ đã được thủy phân bằng enzyme protease từ nấm với tỷ lệ 1% tổng khối lượng chất khô Quá trình diễn ra ở nhiệt độ 43 ± 1 °C và pH khoảng 7,0 trong 45 phút, đạt mức độ thủy phân 34% và tỷ lệ thu hồi nitơ lớn hơn 64% Kết quả điện di SDS-PAGE với nồng độ gel 12% cho thấy các peptide có trọng lượng phân tử trung bình lớn hơn 10 kDa.
Nghiên cứu của Theo Liu và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng việc sử dụng hỗn hợp enzyme protease kiềm và papain để thủy phân da cá tuyết có thể tạo ra collagen polypeptide, có tiềm năng làm chất phụ gia trong thức ăn chăn nuôi Kết quả cho thấy, dưới điều kiện tối ưu với 4,0% protease kiềm, 4,5% papain, nhiệt độ 55°C, pH 8 và thời gian phản ứng 11 giờ, mức độ thủy phân protein đạt 25,61% Sản phẩm thu được từ quá trình này cũng có khả năng chống oxy hóa tốt.
Nghiên cứu của Theo Ovissipour và cộng sự (2010) về thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng sử dụng 1,5% alcalase và 1,5% protamex ở pH tự nhiên cho thấy mức độ thủy phân và hàm lượng protein thu hồi tăng theo thời gian Sau 24 giờ, mức độ thủy phân của sản phẩm bằng alcalase đạt 34%, cao hơn so với 19% của sản phẩm bằng protamex (p < 0,05) Hàm lượng protein của dịch thủy phân bằng alcalase lần lượt là 76,8% và 80,2% sau 4 giờ và 24 giờ, trong khi dịch thủy phân bằng protamex đạt 72,32% và 75,4% sau cùng thời gian.
Trongnước
Năm 2013, Cao Xuân Thủy và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ sản xuất đạm cá phân lập từ phế liệu chế biến cá tra, đạt được kết quả thủy phân cao nhất là 19,20% với enzyme alcalase 2,4L Điều kiện tối ưu bao gồm tỷ lệ enzyme / cơ chất 0,2% (hoạt tính enzyme 0,5 IU/g cơ chất), pH 6,8, nhiệt độ 61°C, tỷ lệ nước bổ sung từ 150-200%, và thời gian thủy phân từ 60-90 phút.
Nguyễn Thị Mỹ Hương (2012) đã tiến hành nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme protamex 0,5% ở nhiệt độ 45°C và pH tự nhiên trong 6 giờ với tỉ lệ nước/nguyên liệu 1:1 Kết quả cho thấy mức độ thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ tăng theo thời gian, đạt 30,1% và 85,1% sau 6 giờ Sản phẩm thu được có hàm lượng protein 88,2%, lipit 1,4% và tro 8,3%, với hàm lượng amino acid không thay thế cao, phù hợp để sử dụng trong sản xuất thức ăn cho người và động vật.
Trên thế giới và trong nước, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ứng dụng enzyme protease trong việc thủy phân nguyên liệu và phụ phẩm chứa protein động vật Thịt cá sấu nổi bật với hàm lượng protein cao và chất béo thấp, làm cho nó trở thành lựa chọn lý tưởng cho quá trình thu nhận dịch protein thủy phân Việc sử dụng enzyme trong thủy phân protein không chỉ cải thiện các tính chất hóa lý mà còn giữ nguyên giá trị dinh dưỡng của protein Tuy nhiên, hiện tại chưa có báo cáo khoa học nào công bố về thủy phân protein từ thịt cá sấu.
Tổng quan vềsấyphun
Nguyên lýsấyphun
Sấy phun là phương pháp chuyển đổi nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng bột khô thông qua việc phân tán dịch nguyên liệu thành các hạt ẩm Các hạt này sau đó tiếp xúc với luồng không khí nóng trong buồng sấy trong thời gian ngắn, giúp giữ nhiệt độ của hạt ổn định và bảo toàn các thành phần dinh dưỡng của nguyên liệu.
Chất trợsấy
Trong quá trình sấy phun, hiện tượng các hạt bột dính vào thành buồng sấy thường xảy ra do sự chênh lệch nhiệt độ giữa nhiệt độ hóa gương (Tg) của hạt và nhiệt độ không khí sấy Để giảm thiểu tình trạng này, cải thiện hiệu suất thu hồi cũng như chất lượng sản phẩm bột sấy phun, việc bổ sung chất trợ sấy là cần thiết (Adhikari, 2004).
According to the United States Food and Drug Administration (USFDA), maltodextrin is a polysaccharide composed of D-glucose units linked together by α-1,4 bonds, with a Dextrose Equivalent (DE) value of less than 20.
Maltodextrin được sản xuất bằng cách thủy phân tinh bột từ sắn hoặc khoai tây Theo nghiên cứu của Kened và cộng sự (1995), chỉ số DE quyết định tính chất của maltodextrin, với maltodextrin có chỉ số DE cao tan trong nước tốt hơn so với loại có chỉ số DE thấp Chỉ số DE càng thấp, cấu trúc mạng polymer của tinh bột càng phức tạp, dẫn đến khả năng hòa tan kém hơn.
Cơ chế làm giảm hiện tượng bám dính của chấttrợ sấy
Maltodextrin giúp giảm hiện tượng bám dính bằng cách tạo liên kết với các thành phần khô trong dịch nguyên liệu Khi được phối trộn, maltodextrin làm tăng nhiệt độ hóa gương (Tg) của hỗn hợp, giảm sự chênh lệch nhiệt độ giữa các phần tử trong buồng sấy phun Kết quả là hiện tượng bám dính được giảm thiểu, cải thiện hiệu suất sấy.
Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm bộtsấyphun
Nhiệt độ không khí sấy có tác động lớn đến các tính chất vật lý của bột, bao gồm độ ẩm, độ hút ẩm, tỷ trọng và kích thước hạt (Chegini và Ghobadian, 2005) Nhiệt độ sấy phun thường dao động từ 120 đến 220 độ C, và khi tốc độ bơm dòng nhập liệu không thay đổi, việc tăng nhiệt độ không khí sấy sẽ giúp giảm độ ẩm của bột sấy.
Hiệu suất của quá trình sấy phun phụ thuộc vào nhiệt độ không khí sấy Nhiệt độ cao giúp các hạt bột khô và dễ thu hồi (Goula và Adamopoulos, 2008; Tonon và ctv, 2011) Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, sự chênh lệch giữa nhiệt độ không khí và nhiệt độ hóa gương của nguyên liệu sẽ lớn, dẫn đến hiện tượng bám dính và giảm hiệu suất thu hồi (Chegini và Ghobadian, 2007).
1.9.4.2 Ảnh hưởng của tốc độ bơm dòng nguyênliệu
Theo nghiên cứu của Tonon và cộng sự (2011), khi nguyên liệu được bơm vào với tốc độ chậm, các hạt ẩm có kích thước nhỏ và mật độ thấp trong buồng sấy giúp hạn chế hiện tượng kết dính Ngược lại, khi tăng tốc độ bơm, mật độ hạt trong buồng sấy tăng cao, dẫn đến việc các hạt dễ dàng bám dính vào nhau và vào thành buồng sấy, làm tăng kích thước hạt sản phẩm và giảm hiệu suất thu hồi bột.
1.9.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng chất trợsấy
Theo Kurozawa (2009), trong quá trình sấy phun dịch thủy phân protein từ thịt gà, việc sử dụng maltodextrin với hàm lượng 10%, 20%, 30% đã cho ra sản phẩm bột có độ ẩm thấp từ 1,2-1,8% Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Gabas và cộng sự (2007) về dịch ép từ quả dứa, cũng như nghiên cứu của Tonon và cộng sự (2011) về dịch ép từ quả Acai và Papadakis cùng cộng sự (2006) Maltodextrin, với trọng lượng phân tử lớn và khả năng hút ẩm kém, giúp giảm độ ẩm của sản phẩm bột sấy phun, từ đó tăng cường khả năng bảo quản Các nghiên cứu của Abadio và cộng sự (2004), Goula và Adamopoulos (2005), và Grabowski cùng cộng sự (2006) cũng chỉ ra rằng việc sử dụng maltodextrin trong sấy phun làm giảm khả năng hút ẩm của sản phẩm.
Hàm lượng maltodextrin 30% (g maltodextrin/g chất khô) cho hiệu suất thu hồi đạt 52,98 ± 5,13% khi sấy phun dịch quả “Bayberry” (Fang và Bhandari, 2012) Nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của maltodextrin đến chất lượng sản phẩm bột sấy phun là tương tự khi sử dụng cùng một hàm lượng (Masters, 1991) Hiện nay, maltodextrin thường được lựa chọn làm chất trợ sấy và được bổ sung vào dịch nguyên liệu với hàm lượng từ 30 - 40%.
Tình hình nghiên cứu quá trình sấy phun trong nước và trênthếgiới
Nghiên cứu của Theo Adhikari và cộng sự (2004) chỉ ra rằng việc bổ sung maltodextrin có ảnh hưởng tích cực đến quá trình động học và hiện tượng bám dính trong sấy phun thực phẩm giàu acid Kết quả cho thấy maltodextrin giúp tăng nhiệt độ hóa gương, từ đó giảm hiện tượng bám dính của các hạt bột lên thành buồng sấy và cải thiện độ ẩm của sản phẩm cuối cùng.
Cai và Corke (2000) đã nghiên cứu quá trình sấy phun bột sắc tốAmaranthusBetacyanin Nhiệt độ không khí sấy được khảo sát ở các mức nhiệt độ
150 o C, 165 o C, 180 o C, 195 o C, 210 o C với các loại maltodextrin có chỉ số DE 10, 15,
Kết quả nghiên cứu cho thấy maltodextrin có khả năng giảm đáng kể tính hút ẩm của bột sản phẩm Việc phối trộn maltodextrin với chỉ số DE 25 và 10 vào dịch nguyên liệu trong quá trình sấy phun giúp kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm lên đến 63 tuần, so với việc sử dụng riêng từng loại maltodextrin Sản phẩm bột thu được có độ khô tốt hơn so với các loại bột thương mại khác.
Fang và Bhandari (2012) đã tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu quả của hai chất trợ sấy, whey protein và maltodextrin, trong quá trình sấy phun dịch quả "Bayberry" Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng whey protein giảm hiện tượng bám dính bằng cách liên kết với các phân tử trên bề mặt hạt, từ đó làm giảm sức căng bề mặt Ngược lại, maltodextrin hoạt động bằng cách tăng nhiệt độ hóa gương của nguyên liệu.
Nghiên cứu của Kurozawa (2009) về quá trình sấy phun dịch thủy phân protein từ thịt gà cho thấy nhiệt độ không khí sấy (120 - 200 o C) và lưu lượng bơm dòng nhập liệu (0,1 - 0,38 kg.h -1 ) ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi Tăng nhiệt độ không khí sấy giúp giảm độ ẩm bột và nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt từ 38,7 - 59,4% Để đánh giá chất lượng mẫu bột sấy phun, khả năng kháng oxy hóa được kiểm tra bằng gốc tự do diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) Ngoài ra, việc bổ sung 10% (w/w) maltodextrin vào dịch thủy phân cũng giúp giảm tính hút ẩm và tăng nhiệt độ hóagương của sản phẩm.